CC BY
14
УДК 616.932(474)
В.Н.Савельев, И.В.Савельева, О.В.Васильева, Б.В.Бабенышев, Д.А.Ковалев, Г.М.Грижебовский, А.Д.Антоненко, Ш.Х.Курбанов, Т.М.Бутаев, А.Н.Куличенко
ЭВОЛЮЦИЯ VIBRIO CHOLERAE ELTOR И ОБНАРУЖЕНИЕ ИХ ГЕНОТИПИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ НА КАВКАЗЕ
ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт», Ставрополь
Проведен молекулярно-генетический анализ 73 штаммов холерного вибриона эльтор, изолированных от больных в разные годы (1970-1998 гг.) на территории Кавказа. 32 штамма, выделенные в 1970-1990 гг., определены как генотип I (содержит только гены rstREl и ctxBEl - типичные холерные вибрионы эльтор, продуцирующие СТ 2-го типа); 31 штамм, изолированный в 1993-1998 гг., отнесен к генотипу II (с генами rstREl, rstRClas и ctxBClas), 3 - к генотипу III (с генами rstRClas, ctxBClas, rstC), 7 - к генотипу I. Генотипы II и III (генетически измененные) -гибридные варианты биовара эльтор, продуцирующие СТ 1-го типа.
Ключевые слова: Vibrio cholerae eltor, эволюция, генотипы холерного вибриона эльтор.
V.N.Savel’ev, LV.Savel’eva, O.V.Vasil’eva, B.V.Babenyshev, D.A.Kovalev, G.M.Grizhebovsky, A.D.Antonenko, Sh.Kh.Kurbanov, T.M.Butaev, A.N.Kulichenko
Evolution of Vibrio cholerae El Tor and Detection of Their Gene-Variants in the Caucasus
Stavropol Research Anti-Plague Institute, Stavropol
Carried out is the molecular-genetic analysis of 73 Vibrio cholerae El Tor strains isolated from patients at different time points in 1970-1988 in the territory of the Caucasus region. 32 strains isolated in 1970-1990 have been identified as genotype I (contains only rstREl and ctxBEl genes - typical cholera vibrios El Tor producing CT of the II type); 31 strains isolated in 1993-1998 have been classified as genotype II (with rstREl, rstRClas' and ctxBClas' genes), 3 strains, isolated within the same period, have fallen into the third genotype (with rstRClas, ctxBClas, rstC genes), and 7 strains - to the genotype I. Genotypes I and II (genetically altered ones) are the hybrid variants of the El Tor biovar producing CT of the first type.
Key words: Vibrio cholerae El Tor, evolution, genotypes of the cholera vibrio El Tor.
К настоящему времени в процессе эволюции сформировались 3 эпидемически опасных, отличающихся по фенотипическим и генотипическим свойствам, варианта возбудителя холеры: Vibrio сЫ1вте О1 классического биовара, Vibrio еЫкте О1 биовара эльтор и Vibrio сЫ1вте О139 серогруп-пы [4]. Основным же возбудителем 7-й пандемии на протяжении более полувека продолжает оставаться V. сЫ1вте О1 биовара эльтор [2].
Vibrio сЫ1вте О1 классического биовара был возбудителем первых шести пандемий азиатской холеры (1817-1926 гг.), при которой в ряде стран «смертность превышала возможность хоронить мертвых» [1, 10]. Однако в 1961 г. более чем у 90 % всех заболевших холерой в мире обнаруживались V. с^1вте О1 биовара эльтор, гемолизположитель-ные в пробе Грейга, которые в августе 1962 г. были признаны ВОЗ возбудителями холеры эльтор [9]. Но эпидемический потенциал данных штаммов холерного вибриона эльтор оказался недостаточно высоким для дальнейшего эпидемического распространения. Эту функцию взял на себя новый вариант холерного вибриона эльтор - V. еЫкте О1 eltor anhaemolyticus, обусловивший крупную вспышку холеры в Западном Ириане (Новая Гвинея) в октябре 1962 г. [7]. В середине шестидесятых годов прошлого столетия негемолитический, токсигенный (ctx+) холерный вибрион эльтор вытеснил классический биовар данных микроорганизмов на его эндемичной территории.
В 2002-2007 гг. появились сообщения [5, 12, 13]
о находках у выделенных в 1991-1994 гг. в Матлабе (Бангладеш) и в лечебном Центре Beira (Мозамбик, Африка) штаммов холерных вибрионов эльтор, несущих генотипические признаки вибрионов классического биотипа: их геном содержал ген rstR классического типа, а гены ctxAB кодировали синтез холерного токсина (CT) также классического типа. Изоляты V. choleraе О1 с генотипическими признаками обоих биотипов получили название «гибридных»[11].
Характеристику генетически измененных штаммов холерных вибрионов О1 приводят в своей работе A. Safa и соавт. [15]. Генотипическая характеристика измененных токсигенных штаммов холерного вибриона дана в сравнительном аспекте с типичными эльтор и классическими вибрионами. Так, геном CTXф типичного токсигенного холерного вибриона эльтор состоит из коровой области и области RS2. В коровой области гены оіхАВ кодируют продукцию холерного энтеротоксина; гены асе и zot, обеспечивающие морфогенез фаговых частиц, кодируют синтез токсинов, нарушающих проницаемость эпителиальных клеток кишечника человека, способствующих свободному доступу в них энтеротоксина. Функция остальных трех генов, входящих в кластер токсигенности, изучена недостаточно. В область RS2 входят гены rstA, rstB, кодирующие репликацию, интеграцию фаговых частиц, и ген rstR, регулирующий эти процессы. Геном СТХф фланкируется с обеих сторон филаментозным фагом RS1, в геноме которого важную роль играет ген rstC, специфичный для типичного эльтор. Необходимо
отметить, что гены СхАВ кодируют продукцию токсина эльторовского типа (СТ2), т.е. энтеротоксина, аминокислотная последовательность субъединицы В которого в положении 39 содержит аминокислоту тирозин, а в позиции 68 - изолейцин.
Геном СТХф классического холерного вибриона состоит, как и у типичного эльтор, из коровой и RS2 областей с тем же набором генов. Гены с^АВ кодируют продукцию энтеротоксина классического типа (СТ1) - в положении 39 такой энтеротоксин субъединицы В содержит гистидин, а в положении 68 - треонин. Ген rstR по последовательностям нуклеотидов имеет четкие отличия от rstR холерного вибриона эльтор. Кроме того, геном СТХф классического холерного вибриона не фланкируется областью RS1.
В группу «атипичных» входят генетически разнородные холерные вибрионы О1 серологической группы. Так, матлабские варианты содержат в своем геноме профаг СТХф классического биовара с генами rstRClas и аллелем СхВ1, кодирующем продукцию СТ1, и не дифференцируются на биовары. Вместе с тем данные варианты содержат кластер генов VSP1 и VSP2, что указывает на происхождение матлабских вариантов от типичного холерного вибриона эльтор. Анализ электрофореграмм пульс-электрофореза показал наличие генов классического и эльтор биоваров [14]. Мозамбикские варианты фенотипически характеризуются как холерные вибрионы биотипа эльтор, содержат в своем геноме СТХфС1ж с генами rstRClas и аллелем СхВ1, кодирующем продукцию СТ1. Группа генетически измененных вариантов холерных вибрионов эльтор содержит «гибридный СТХф» с комбинацией генов rstRE1 и СхВ1(кодируют продукцию СТ1) или rstRC1as и СхВ3 (кодируют продукцию СТ2). И, наконец, «гибридные эльтор» [15] содержат в геноме rstRC1as и rstRE1, что является отражением присутствия двух различных копий СТХф, расположенных как тандемно на одной хромосоме, так и локально на различных хромосомах. Гибридные варианты эльтор продуцируют СТ1.
На основании приведенных данных, для гено-типирования генетически измененных холерных вибрионов эльтор методом ПЦР определен оптимальный набор праймеров, мишенью которых будут ДНК генов rstRE1t, rstRC1as, СхА, СхВ1, ВЗ и геЮ.
Все эпидемические осложнения по холере в России и странах СНГ явились следствием завоза инфекции из стран Юго-Восточной Азии (Индия, Пакистан, Иран) или Ближнего Востока (Сирия), что предопределило цель настоящего исследования: ретроспективный поиск генетически измененных вариантов холерного вибриона эльтор среди изолированных в 90-е годы на Кавказе.
Материалы и методы
В работе изучены 73 штамма холерного вибриона эльтор, из которых 32 выделены от больных в 19701990 гг. в Грузии, Дагестане и Ставропольском крае,
41 - в 1993, 1994, 1998 гг. в Дагестане. Клинические изоляты идентифицированы как холерные токсиген-ные вибрионы О1 серологической группы биовара эльтор сероваров Огава или Инаба.
Определение генотипов, в том числе и генетически измененных, среди клинических изолятов холерного вибриона эльтор, выделенных на Кавказе в период 7-й пандемии, осуществляли методом ПЦР: детектируя фрагменты генов rstRElt, rstRClas, ctxA, ctxB1(BClas), ctxB3(BEl), rstC. Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе, синтезированы в ЗАО «Синтол» (табл. 1).
Для определения размеров ампликонов использовали 100 bp DNA Ladder (100-3000 bp). Секвенирование ампликонов проводили на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems) с набором реактивов BigDye Terminator v3.1 в соответствии с методическими рекомендациями производителя, исходные данные анализировали в программе Sequencing Analysis v5.4. При сопоставлении последовательностей были использованы программы FinchTV 1.4.0. и BLAST (NCBI).
Результаты и обсуждение
Результаты исследований (табл. 2) показывают, что 32 клинических изолята, выделенные от людей в 1970-1990 гг., и 7 штаммов, выделенные в 19931994 гг., отнесены нами к генотипу I, 31 штамм - к генотипу II, а 3 штамма - к генотипу III, которые по генетической структуре прилегающего к умеренному фагу СТХф участку RS1 с геном rstC отличались от классического биовара, фенотипически оставаясь эльтор вибрионом. «Гибридный», или смешанный, генотип II составили дагестанские штаммы, выделенные в 1993, 1994 и 1998 гг. Эти штаммы отличались также полиантибиотикорезистентностью (от 3 до 8 маркеров устойчивости), и большая их часть не лизировалась фагами С, эльтор II, ХДФ 3, 4, 5.
Полученные данные позволили выявить среди клинических изолятов три генотипа холерного вибриона эльтор, которые характеризовались наличием, наряду с ctxA, rstC, следующих генов: генотип I содержал только свои собственные, эльторовские,
Таблица 1
Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе
Тестируемый Нуклеотидная последова- Размер амп- Источник
ген тельность праймера, 5-3 ликона, п.н.
rstRE gcaccatgatttaagatgctc tcgagttgtaattcatcaagagtg 501 [8]
rstRCla cttctcatcagcaaagcctccatc tcgagttgtaattcatcaagagtg 501 [8]
ctxA cgggcagattctagacctg cgatgatcttggagcactattcccac 564 [6]
ctxB1(BClaa) аctatcaacagcatatgcacatgg cctggttacttgaaacg 186 [15]
ctxB3(BEl) аctatcaacagcatatgcacatgg cctggttacttgaaaca 186 [15]
rstC аtgagtttgaaaccatacacttt ttacagtgatggatcagtcaat 224 [12]
Таблица 2
Генотипы холерного вибриона эльтор среди 73 клинических изолятов, выделенных на Кавказе в период 7-й пандемии
Фенотип, годы выделения, кол-во исследованных штаммов
Кол-во изолятов с детектируемыми генами
rstREl rstRClas ctxA ctxBClas ctxBEl rstC
Генотип
V. cholerae O1 биовара эльтор, 1970-1990 гг., n=32 32
V. cholerae O1 биовара эльтор, 1993-1998 гг., n=41 7
31
0
0 32 0 32 32
0 7 0 7 7
31 31 31 0 31
3 3 3 0 3
гены - rstREl и ctxBEl, генотип II - гены rstREl, rstRClas и ctxBClas, генотип III - rstRClas и ctxBClas (табл. 2), т.е. генотипы II и III содержат ген ctxBClas, кодирующий энтеротоксин классического типа.
При секвенировании гена ctxB штаммов холерного вибриона эльтор, отнесенных нами к генотипу I, установлено, что в нуклеотидной последовательности данного гена в позициях 115 и 203 присутствует тимин, а кодируемая им аминокислотная последовательность субъединицы В холерного токсина в положении 39 содержит аминокислоту тирозин, в положении 68 - изолейцин.
В нуклеотидной последовательности гена ctxB штаммов холерного вибриона эльтор II и III генотипов в позициях 115 и 203 находится цитозин, а кодируемый им экзотоксин в положениях 39 и 68 содержит соответственно аминокислоты гистидин и треонин. Данные секвенирования свидетельствуют о том, что штаммы I генотипа продуцируют СТ 2-го типа, а II и III генотипов - СТ 1-го типа.
Таким образом, штаммы холерных вибрионов
I генотипа являются типичными токсигенными холерными вибрионами биовара эльтор, вызвавшими эпидемиологические осложнения по холере на Кавказе в 1970-1990 гг., хотя единичные случаи этой инфекции наблюдались в 1993-1998 гг. Генотипы II и III следует определить как генетически измененные варианты биовара эльтор, обусловившие эпидемические вспышки и единичные случаи холеры в Дагестане в 1993-1998 гг. Такие геноварианты биовара эльтор продуцируют СТ 1-го типа, причем, как показали исследования Н.И.Смирновой и соавт. [4], в значительно большем количестве по сравнению с типичным токсигенным холерным вибрионом, являются полиантибиотикорезистентными и устойчивыми к холерным диагностическим бактериофагам. Учитывая полученные результаты и данные A.Safa и соавт. [14], можно утверждать, что выявленные на Кавказе генотипы II и III холерного вибриона эльтор имеют клоновое происхождение от генетически измененных штаммов биовара эльтор, выделяемых в Азии и Африки.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бароян О.В. Холера Эль-Тор. М.: Медицина; 1971. 254 с.
2. ОнищенкоГ.Г., ЛомовЮ.М., ФедоровЮ.М., Москвитина Э.А., Подосинникова Л.С., Горобец А.В. Холера в начале века. Прогноз. Журн. микробиол, эпидемиол. и микробиол. 2005; 3:44-8.
3. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Шашкова А.В., Кутырев В.В. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio
Ло1егае биовара эльтор, изолированных на территории России в современный период. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2011; 3:11-7.
4. СмирноваН.И., КутыревВ.В., КостромитинаЕ.А., Осин А.В. Вариабельность генома штаммов Vibrio cholerae биовара эльтор. Вестник РАМН. 2005; 7:19-26.
5. Ansaruzzaman M. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 2004; 10:2057-9.
6. Bhattacharya T., Chatterjee S., Maiti D., Bhadra R.K., Takeda Y., Nair G.B., Nandy R.K. Molecular analysis of the rstR and orfU genes of the CTX prophages integrated in the small chromosomes of environmental Vibrio cholera non-O1, non-O139 strains. Environ. Microbiol. 2006; 8:526-34.
7. De Moor C.E. A non-haemolytic El-Tor Vibrio as the cause of an outbreak of pаracholera in West New Guinea. The El-Tor problem pаracholera in the West Pacific. Trop. Geogr. Med. 1963; 15?2):97-107.
8. Faruque S.M., Nair G.B. Molecular ecology of toxigenic Vibrio cholerae. Microbiol. Immunol. 2002; 46:59-66.
9. Hugh R. The taxonomy of El-Tor Vibrios. Bact. Proc. 1962; 5:123-8.
10. Karaolis D.K.R., Lan R., Reeves P.R. Molecular evolution of the seventh-pandemic clone of Vibrio cho^rae and its relationship to other pandemic and epidemic V. cholera isolates. J. BacterioL 1994; 176:3191-8.
11. MoritaM., OhnishiM., Arakava E., Bhuiyan N.A., Nusrin S., Alam M. et al. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCA assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio chohrae O1 biotype El Tor. Microbiol. Immunol. 2008; l(52):314—7.
12. Nair G.B. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002; 40:3296-9.
13. Safa A. Genomic relatedness of the new Matlab variants of Vibrio cholerae O1 to the classical and El Tor biotypes as determined by pulsed-field gel electrophoresis. J. Clin. Microbiol. 2005; 43:1401-4.
14. Safa A., Sultana J., Cam P.D., Mwansa J., Kong R. Vibrio cholerae O1 eltor strains, Asia and Africa. Emerg. Infect. Dis. 2008; 15(6):987-8.
15. Safa A., Nair G.B., Alam M. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18:46-54.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Baroyan O.V [Cholera Biovar El Tor]. M.: Meditsina; 1971. 254 p.
2. Onishchenko G.G., Lomov Yu.M., Fedorov Yu.M., Moskvitina E.A, Podosinnikova L.S., Gorobets A.V [Cholera in the beginning of the century. Prognosis]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2005; 3:44-8.
3. Smirnova N.I., Zadnova S.P., Shashkova A.V., Kutyrev V.V. [Variability of the genome of Vibrio cholerae altered variants biovar El Tor, isolated in the territory of Russia in the modern period]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 2011; 3:11-7.
4. Smirnova N.I., Kutyrev V.V, Kostromitina E.A., Osin A.V [Variability of the genome of Vibrio cholerae strains biovar El Tor]. RAMS Bulletin. 2005; 7:19-26.
Authors:
Savel’ev V.N., Savel’eva I.V., Vasil’eva O.V., Babenyshev B.V., Kovalev D.A., Grizhebovsky G.M., Antonenko A.D., Kurbanov Sh.Kh., Butaev T.M., KulichenkoA.N. Stavropol Research Anti-Plague Institute. 13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russia. E-mail: snipchi@mail.stv.ru
Об авторах:
Савельев В.Н., Савельева И.В., Васильева О.В., Бабенышев Б.В., Ковалев Д.А., Грижебовский Г.М., Антоненко А.Д., Курбанов Ш.Х., Бутаев Т.М., Куличенко А.Н. Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт. 355035, Ставрополь, ул. Советская, 1315. E-mail: snipchi@mail.stv.ru
Поступила 08.11.12.
