CC BY
35СТАНДАРТНЫЕ ПАНЕЛИ СЫВОРОТОК В ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ В и С.
В последние 10 лет интенсивное развитие получила лабораторная диагностика вирусных инфекций, в том числе вирусных гепатитов. Для этой цели широко используется иммуноферментный анализ (ИФА), Для получения адекватных результатов при постановке ИФА кроме соответствующего аппаратурного оснащения и квалифицированного персонала требуются стандартные панели сывороток (СПС), содержащие или нет специфические антивирусные антитела или вирусные антигены. Необходимы как референс СПС для оценки качества выпускаемых и используемых диагностических тест-систем, так и контрольные панели сывороток для оценки качества выполнения анализов в диагностических лабораториях.
Важной проблемой, которая должна быть учтена при конструировании СПС, является зависимость результатов ИФА от генотипа инфицирующего вирусного агента, а также иммунного статуса отвечающего индивидуума. Известно, например, что узнавание анти-ВГС антител существенно зависит от генотипа вируса и может варьировать в несколько раз. Также известно, что ряд индивидуумов не вырабатывают антитела на те или иные белки, против которых в норме наблюдается интенсивный гуморальный ответ.
Для определения количества маркера в сыворотке необходимо иметь прямой способ измерения единицы этого количества. В иммунохимии количество белков вируса нормируется относительно первичных стандартов, разрабатываемых под контролем Комитета экспертов ВОЗ по биологическим стандартам. Однако генотипическое многообразие вирусных субтипов не позволяет использовать один стандартный образец для количественной оценки концентрации маркера в сыворотке. Поэтому в иммунодиагностике используют наборы стандартов с аттестованной концентрацией искомых маркеров, специфичных для различных вирусных субтипов, объединенные в панели сывороток. Таким образом, каждая сыворотка СПС должна быть аттестована на содержание вирусспецифических антител или иных маркеров вирусной инфекции и характеризоваться строго определённой специфичностью тем или иным вирусным антигенам. При этом обязательно должны быть представлены наиболее распространённые и эпидемиологически значимые субтипы вируса.
Главный тезис, лежащий в основе использования стандартов для проверки количественных характеристик иммуноанализа, состоит в том, что анализируемый маркер в стандарте и в тестируемом образце показывает эквивалентную способность взаимодействовать с определенным (одним и тем же) рецептором.
По рекомендациям экспертов ВОЗ различают следующие типы панелей сывороток: референс-панели, контрольные и сероконверсионные.
• Референс-панель - панель низкотитражных образцов, приготовленных методом разведения положительно аттестованных стандартов в нормальной человеческой сыворотке, не содержащей HBsAg и анти-ВИЧ, анти-ВГС и антител к сифилису. Всего 15-20 К+ образцов. В состав референс-панели включают 4-6 образцов отрицательных нативных сывороток, необходимых для оценивания специфичности тестируемых диагностических наборов.
• Контрольная панель - составлена из нативных сывороток с низкими титрами. Панели служат для контроля качества выполнения анализов в диагностических лабораториях.
• Сероконверсионная панель - составлена из образцов сывороток отдельных индивидуумов, обычно доноров крови, которые в результате инфицирования проходят этап сероконверсии. В этом случае из банка крови берутся кроводачи данного донора и одновременно продолжают отбирать образцы крови до тех пор, пока не прекратится нарастание титра искомого агента.
В ГНЦ ВБ «Вектор» с 1990 г. ведутся работы по стабилизации биопрепаратов и разработке научных и технологических основ изготовления панелей сывороток, содержащих нормированные концентрации IgG и IgM антител. Способы изготовления панелей сывороток защищены 4-мя патентами РФ. Были изготовлены и аттестованы в качестве стандартов ГИСК им. Л.А. Тарасевича следующие СПС:
• анти-ВИЧ-1/2 стандартная панель положительных сывороток- ОСО 42-28-212-93
• анти-ВИЧ стандартная панель отрицательных сывороток - ОСО 42-28-212-94;
• анти-ВГС стандартная панель сывороток (1994), (выпущено 4 серии);
• анти-ВГА IgM стандартная панель сывороток (ОСО 42-28 -220-96).
Кроме того, в ГНЦ ВБ «Вектор» разработана референс-панель HbsAg, содержащая разведённые сыворотки с концентрацией HbsAg от 4 нг/мл до 0.2 нг/мл субтипов ad и ау.
Главным направлением использования референс-панелей поликлональных сывороток является контроль чувствительности и специфичности коммерческих тест-систем и вакцин (против гепатита В) как производимых в России, так и закупаемых за рубежом. В этом качестве стандартные панели становятся юридической основой для государственных органов контроля при обосновании решений о соответствии коммерческих препаратов установленным нормам качества.
Известны панели сывороток Boston Biomedical Inc. (США). Например, Hepatitis В Surface Antigen Sensitivity Panel (PHA 806). Панель включает позитивные разведенные сыворотки с концентрацией HBsAg от 2.5 нг/мл до 0.1 нг/мл субтипов ad и ау . Эти панели предназначены для контроля чувствительности коммерческих наборов и в научных целях.
Панель включает 2 серии разведенных препаратов, содержащих 20 образцов по 1.5 мл с переменной концентрацией HBsAg субтипов ad и ау (по 10 образцов каждого субтипа). Образцы калиброваны относительно вторичного стандарта с использованием тест-системы Abbott Auszyme-Monoclonal (Abbott Catalog # 1980-24). Образцы панели изготовлены из стерильно фильтрованных пулов HBsAg субтипов ad и ау, разведенных в пуле донорских сывороток, не содержащих HBsAg, анти-HBs, анти-НВс, анти-ВИЧ-1/2 и анти-ВГС. Сыворотки, входящие в состав этих панелей, представлены в жидкой форме и должны храниться при отрицательных температурах, что создаёт серьезные проблемы для их использования в странах, не имеющих надежной холодовой цепи.
Другой компанией, широко известной в США и в Европе, является "BioClinical Partners, Inc." Эта компания разработала уникальную серию диагностических референс-панелей в том числе: Clinical Validation Panels и Diagnostic Reference Panels. В состав первой включают нативные сыворотки пациентов с установленным клиническим диагнозом, в то время как в состав второй включены сыворотки на основе серологических методов анализов, как цельные, так и разведенные в пуле донорской плазмы. Сероконверсионные панели этой компании выпускаются для контроля ранней диагностики как вирусов, так и вирус специфических антител. Паспорта панелей включают результаты анализов в различных тест-системах и могут быть использованы в сравнительных испытаниях.
Образцы панелей не инактивированы, не стабилизированы и должны храниться и распространяться при -80°С.
В Европе основными центрами производства панелей сывороток являются National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) (Потер Бар, Великобритания) и Контрольная лаборатория стандартов Красного Креста (Амстердам, Нидерланды). Основной продукцией NIBSC являются международные стандарты, выпускаемые под эгидой ВОЗ. Например, International Standard for Hepatitis B Surface Antigen (subtype ad) кат. №80/549, который содержит HBsAg в концентрации 100 MU/мл.
Для контроля профессионального уровня сотрудников диагностических лабораторий в Центральной лаборатории стандартов голландского Красного Креста разработаны контрольные панели Pelichek и Pelispy в рамках программы VQC. Эти панели представляют собой 8-10 разведенных образцов стандартных препаратов HBsAg, а также анти-ВИЧ, анти-ВГС и анти-HTLV-1 антител в пуле донорских сывороток, не содержащих маркеров опасных вирусных инфекций.
А.Н. Капев, А.З, Максютов, Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирск.
СОВРЕМЕННЫЕ НАУЧНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ПОИСКА ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ВИРУСА ГЕПАТИТА С (по материалам информационных центров фармацевтических фирм).
Инфицирование вирусом гепатита С (ВГС) в большинстве случаев приводит к развитию хронического гепатита С (ХГС), часто имеющего мягкое и скрытое течение, но постепенно прогрессирующего и приводящего к развитию цирроза или гепатоцеллюлярной карциномы. Учитывая, что около 3% населения мира инфицировано ВГС, и распространение инфекции не поддается существенному ограничению, то очевидно, как актуален поиск новых эффективных противовирусных препаратов и вакцин.
