CC BY
35
УДК 616.36-002-07:616-097
МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ HBSAG С ВЫСОКОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ
С.В. Жаворонок, Е.В. Воропаев, Мунасар Хани, В.М. Мицура, А.В. Воропаева Гомельский государственный медицинский университет
В соответствии с ГОСТом проведена разработка средств диагностики и контроля качества вирусного гепатита В, в основе которого лежит технология иммуноферментного анализа. Подготовлены технические условия на производство, программа и методика испытаний, проведены предварительные испытания иммуноферментной тест-системы для выявления HBsAg с высокой чувствительностью, а также стандартной национальной панелью сывороток с различным содержанием HBsAg.
Ключевые слова: иммуноферментый анализ, вирусный гепатит, HBsAg.
METHODICAL APPROACHES TO CREATION DOMESTIC DIAGNOSTIC THE TEST-SYSTEMS FOR REVEALING HBSAG WITH HIGH SENSITIVITY
S.V. Zavoronok, E.V. Voropaev, Munasar Hani, V.M. Mitsura, A.V. Voropayeva
Gomel State Medical University
In conformity with national standard, design of diagnostics and monitoring methods to qualifying control of virus hepatites В according to the basis of ELISA technology. Creation оf test manual documentation, techniques of tests are prepared, preliminary researches in ELISA test-systems for revealing HBsAg with high sensitivity, and also standard national panels with various contents HBsAg.
Key words: ELISA, virus hepatites В, HBsAg.
Первым идентифицированным вирусом, вызывающим вирусный гепатит с парентеральным механизмом заражения, является вирус гепатита В, наиболее известным серологическим маркёром которого является HBsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В), открытый в 1963 году Б. Бламбергом (Нобелевская премия 1976 года по разделу медицина) ранее известный как «австралийский» антиген, обнаруженный у аборигенов Австралии [3].
Наиболее оптимальным методом диагностики различных вирусных заболеваний является иммуноферментный анализ (ИФА) и его различные модификации. ИФА тесты сочетают высокую чувствительность и специфичность с возможностью проведения массовых определений, они могут быть в значительной степени автоматизи-
рованы, а результаты подвергнуты компьютерной обработке. Твердофазный иммуноферментный анализ широко применяется для серологической диагностики вирусных инфекций [7].
В настоящее время с учетом высокого числа больных НВV- инфекцией с субклинической, инаппаратной формой ГВ в Республике Беларусь назрела необходимость использования тест-систем для выявления HBsAg с чувствительностью не ниже 0,1 нг/мл (Ме/мл). В связи с этим большое значение отводится выявлению HBsAg на ранних стадиях заболевания и обнаружению HBsAg в низких концентрациях, для чего необходима разработка относительно недорогих и простых в использовании и качественных методов диагностики, позволяющих решать эти задачи.
Материалы и методы
Разработка комплекта НТД велась в соответствии с СТБ 1019-96 ГОСТ РБ «Разработка и постановка на производство медицинских изделий».
ИБвЛ§ был очищен из объединенных сывороток больных, содержащих высокий титр антигена, используя колонку, несущую кроличьи антитела к ИББ-антигену. Для получения очищенного препарата ИБвЛ§ брали 900 мл плазмы доноров-носителей ИБвЛ§ с исходным титром 1:2-1:4 и добавляли 100 мл 50% раствора полиэтиленгли-коля (ПЭГ) с молекулярной массой 6000. Плазму, содержащую 5% ПЭГ, инкубировали 60 минут при 4° С и отделяли выпавшие в осадок белки центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 10 минут. Осадок отбрасывали, а к осветленной надоса-дочной жидкости (900 мл) добавляли еще 100 мл 50% раствора ПЭГ. Смесь инкубировали при 4°С 60 минут и отделяли осадок центрифугированием при 10000 об/мин в течение еще 10 минут. Надосадочную жидкость отбрасывали, осадок, содержащий ИБвЛ§, ресуспензировали в 35 мл 0,3 М раствора хлорида натрия, содержащего 0,05 моля трис-ИС1 буфера с рИ 7,6. Осветленный центрифугированием раствор содержал иббл§ в титре 1:32-1:64 и протеины около 200 г/л. Белок определялся по методу Лоури (с реактивом Фолина). Затем данный концентрат подвергался ультрацентрифугированию в линейном градиенте сахарозы от 20 до 45% — 75 000 О в течение 10 часов. В каждую пробирку, содержащую 10,5 мл линейного градиента сахарозы, наслаивали 0,3 мл концентрата иббл§. После окончания ультрацентрифугирования градиент фракционировали по 0,3 мл. Определяли рефрактометром плотность раствора сахарозы в каждой фракции и во фракциях с плотностью 1,1-1,2 кг/л проводили индикацию иббл§. Для стандартизации условий исследования и контроля эффективности ультрацентрифугирования проводили спек-трофотометрию градиента при его фракционировании. В конечном итоге получали препарат иббл§ в титре 1:4-1:8 и белок в концентрации не более 1,2 г/л. Для контроля за эффективностью очистки иббл§ и стандартизации условий все этапы фракционирования антигена контролировали диск - электрофорезом в полиакриламидном геле. Свя-
занный иббл§ был элюирован 0,1 М гли-цин/ИС1 рИ 2,5 и немедленно диализирован против карбонатно/ бикарбонатного буфера (0,1 М, рИ 8,3), содержащего 0,5М ШС1.
Концентрация полученного иббл§ была оценена иммуноферментным методом с использованием наборов реагентов фирм НПО «ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ» (Нижний Новгород) и Вектор Бест (Новосибирская область, п. Кольцово). Стандартизованные сыворотки были лиофилизированы, остаточная влажность составила не более 1,3%.
Опытный экземпляр панели стандартных образцов сывороток (8 сывороток с иббл§ и 1 здорового донора) может быть использован для стандартизации исследований по выявлению иббл§ методом иммуноферментного анализа (ИФА) и оценки специфичности и чувствительности отечественных и зарубежных ИФА тест-систем, предназначенных для выявления иббл§ в сыворотке или плазме крови человека, а также для использования в качестве стандартных позитивных контролей в тест-системах для выявления иббл§. В процессе дальнейшей работы планируется увеличить количество образцов стандартных сывороток с различной концентрацией иббл§ до 100 штук.
При определении чувствительности тест -системы рекомендуется использовать все стандартные сыворотки, входящие в состав панели. Уровнем чувствительности тест-системы считается наименьшая концентрация панели, оцененная согласно инструкции по применению данной тест-системы как положительный образец в обеих лунках.
Препарат иббл§ в количестве, соответствующем 2 мг общего белка, в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) вводился под конъюнктиву в оба глаза; еще 2 мг белка в смеси с ПАФ вводились в подушечки задних лап.
Через 9 дней 2 мг того же белка в смеси с ПАФ вводились под конъюнктиву в оба глаза; еще 2 мг белка в смеси с ПАФ — подкожно в область лимфоузлов лопаток.
Через 9 дней 2 мг того же белка в смеси с ПАФ вводились под конъюнктиву в оба глаза; еще 2 мг белка в смеси с ПАФ — подкожно в область подколенных лимфоузлов задних лап.
Через 7 дней — пробный забор крови.
Через 90 дней — повторная иммунизация однократным внутривенным введением 4-6 мг белка.
При высоком качестве антисыворотки ее забор проводился всегда через 7 дней после последней инъекции (из краевой вен уха кролика или из вены подкрыльцовой впадины у овцы). При этом однократно отбирали у кролика 50-100 мл крови, у овцы — 300-400 мл. Забор крови повторялся через 2-3 дня и продолжался в таком режиме в течение 15-20 дней.
Полученная сыворотка лиофилизирова-лась или консервировалась добавлением азида натрия (до общей концентрации 0,02%) и хранилась в жидком виде при 4-8°С.
Анализ и стандартизация антисывороток. Все серии антисывороток предварительно проверялись на присутствие антител к HBsAg. Для этого они адсорбировались (истощались) антигенами плазмы крови экстрактов разных органов и тканей, после чего изучалась их преципитирующая способность в специфической реакции с антигеном иммунодиффузионным анализом или с помощью иммуноэлектрофореза по P. Grabar и C.A. Williams и перекрестного иммуноэлектрофореза по C.B. Laurell.
Для сравнения специфичности и чувствительности тест-систем, разработанных на основе моноклональных анти-HBs собственного производства, использовались коммерческие анти-HBs, изготовленные фирмой «Сорбент-сервис» Россия.
В основе разрабатываемой тест-системы была положена пара монокло-нальных антител, первые из которых выступили в качестве подложки: анти-HBs — собственного производства — исходная концентрация 550 мг/мл и анти-HBs — «Сорбент-сервис» (клон Х-12 исходная концентрация 8 мг/мл), а вторые в качестве коньюгата — меченные пероксидазой хрена SIGMA 6782, анти-HBs собственного производства исходная концентрация 500 мг/мл — и анти-HBs — «Сорбент-сервис» (клон Х-7 исходная концентрация
4 мг/мл). Сорбция анти-HBs проводилась в 0,02 М боратном буфере рН 8,0, содержащем 0,15 М NaCl, или просто в растворе NaCl с рН 5,5—6,0 в концентрации
5 мкг/мл. Антитела Х-12 сорбировали по 105 мкл на лунку на ночь при комнатной температуре на 96 луночных планшетах MaxiSorb фирмы NUNC Дания. Для разведения коньюгата, конечная концентрация которого составила 2 мкг/мл, нами
обычно использовался фосфатно-солевой раствор с твином 20, содержащий 10 мг/мл БСА. Одним из вариантов буфера для коньюгата для увеличения специфичности тест-системы служил многокомпонентный буфер, на основе фосфатно-солевого раствора с твином 20, который содержал: 20% мочевины, 0,02% азид натрия, 0,5% козеин, 0,2% фенола, 10% иммуноглобулина крупного рогатого скота или нормальной человеческой сыворотки в той же концентрации и 0,2% нормальной мышиной сыворотки. В качестве субстратной смеси использовали стандартный раствор ТМБ на цитратном буфере. Инкубации сывороток (неразведенных) и коньюгата проводили в термостате (ТС-80) при 37°С в течение 1 часа. Для промывки использовался стандартный фосфатно - солевой буфер с тви-ном 20. Отмывку не связавшихся антител проводили троекратно, заполняя лунки планшета на 300 мкл, используя автоматический вошер иммунологических планшет отечественного производства МВ-350 (Технофорум, Минск). В качестве контрольных образцов использовались сыворотки крови больных вирусным гепатитом В (пациенты Витебской и Гомельской областных инфекционных больниц — 123 пациента), а также сыворотки с различной концентрацией HBsAg из панели стандартных сывороток производства Российской фирмы Вектор Бест (Б-0540).
Проводилась качественная оценка результатов иммуноферментного анализа в соответствии с инструкциями по применению данных тест-систем. Оптическая плотность измерялась при длине волны 450 нм на автоматическом иммуноферментном анализаторе АИФ М/340.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием программы БТАИБИСА у.5.0, были применены метод вариационной статистики Фишера-Стьюдента, критерий %2, непараметрический критерий Манна-Уитни.
Для модификации планшет в качестве источников ультрафиолетового излучения применяли широко используемый облучатель бактерицидный потолочный 0БП-300 (ТУ 64-1-1445-78). В облучателе использовали две открытые газозарядные лампы низкого давления, излучающие УФ лучи (длинна волны 253,7 нм).
Результаты и их обсуждение
ИБУ- инфекция представляет собой одну из важнейших проблем современного здравоохранения в связи с частотой распространения, неуклонным ростом заболеваемости, высоким риском трансформации в цирроз печени и развития гепатоцеллюляр-ной карциномы. Около 1 млн. человек умирают ежегодно от хронических заболеваний печени, включая рак и цирроз печени. Вирус гепатита В занимает второе место в мире после табакокурения как причина, вызывающая рак у человека [2]. Распространенность гепатита В широко варьирует в разных регионах земного шара. Страны Северной Америки, Западной Европы, Австралии, Новой Зеландии имеют низкий эпидемический статус в отношении гепатита В. Инфицированность в них составляет менее 20%, носителей иббл§ — менее 1%. В Восточной и Южной Европе, странах СНГ, Центральной Азии, Японии, Южной Америке инфицированность населения колеблется от 20 до 60%, а число носителей иббл§ составляет 2-7%. В странах Южной Азии, Китая, Ближнего Востока, Африки, Арктики гепатит В распространен очень широко — инфицированность составляет более 60%, а носительство — более 15%.
Создание недорогих и качественных иммунноферментных диагностических наборов, обеспечивающих высокую аналитическую чувствительность и специфичность, связано как с разработкой новых высокоэффективных иммунноферментных препаратов, так и с внедрением новых техпроцессов изготовления аналитических слоев на поверхности стрипов, а также разработкой принципиально новых иммуноферментных процессов, сокращающих диагностические процедуры (время анализа) в десятки раз.
При выборе носителя и методе связывания для конкретного объекта необходимо стремиться к максимальному сохранению им иммунологических свойств и стабильности в иммобилизованном состоянии. Важно также, чтобы носитель обладал минимальной способностью неспецифически связывать компоненты анализируемой смеси, в особенности соединение, меченное ферментом [2, 7].
Форма заболевания, его прогноз проводятся на основании комплексного учета клинических, биохимических, сероло-
гических и эпидемиологических данных. Особое значение для этиологической диагностики имеет обнаружение серологических маркеров этой инфекции, основными из которых являются иббл§, ИБеЛ§, анти ИБс 1§М, анти ИБс, анти ИБе и анти ибб, которые выявляются в сыворотке крови в основном иммуно-ферментным методом, реже в реакции пассивной гемагглютинации радио и им-мунофлюоресцентным анализом. Маркером, свидетельствующим об активном размножении вируса является ДНК ИБУ, для определения которой используются молекулярно-биологические методы.
иббл§, являясь основным серологическим маркером вируса гепатита В, использующимся для диагностики этой инфекции, появляется в сыворотке крови через 12 недели после инфицирования, т. е. может быть обнаружен инкубационном периоде до появления клинических симптомов, иногда одновременно с вирусной ДНК. Концентрация иббл§ в этот период может быть очень незначительной, но в последующие сроки она существенно увеличивается вместе с подъемом активности АЛАТ и в периоде разгара болезни иногда достигает 100-500 мг в/мл крови.
В то же время появление иббл§ в крови зависит от инфицирующей дозы вируса, индивидуальных особенностей иммунной системы организма. При использовании высокочувствительных иммуноферментных тест систем, позволяющих выявить иббл§ в концентрациях 0,05-0,1 нг/мл, он обнаруживается практически у всех лиц, инфицированных ИБУ.
При создании иммуноферментных тест-систем, в основе которых лежит реакция антиген-антитело, необходимо учитывать неоднородность популяции антител так как из литературы известно, что иббл§ это сложный антигенный комплекс, в состав которого входит несколько антигенных детерминант [4]:
«а» — общая группоспецифическая детерминанта «у» или «ё», «г» или — две пары аллельных или подтиповых детерминанты;
«х, Г, 1;, п, к, д» — дополнительные (минорные) детерминанты.
В настоящее время известно девять основных субтипов антигена: ау1^, ayw2, ayw3, ayw4, ауг, adw2, adw4, аёг§- и аёг§+и
пять более редких: а'Ш", аёт, аёу1^ аёу'Ш", которые определяются сочетанием антигенных детерминант.
Имеются четыре зоны земного шара, разделённые по распространению HBsAg:
Зона «V» (HBsAg/ay) — средний Восток, Иран, Пакистан, Южно-Европейские страны, Африка. Частота выявления HBsAg субтипа ау в России, Украине и Узбекистане составляет 95-98%; в Литве, Латвии, Молдове — 72-84%.
Зона «Б» (HBsAg/adw) — Северные и Центральные районы Европы, Америки и Африки, Тайланд, Индонезия, Гвинея.
Зона «К» (HBsAg/adr) — Юго - Восточная Азия (Китай, Япония, Корея), Дальний Восток.
Смешанная зона — центральные зоны в Океании.
В той части Белоруссии, которая расположена ближе к России, практически в 95% случаев выявляется субтип ау, а на западных её территориях чаще встречаются варианты субтипа ad. Соответственно правильный подбор пары моноклональных анти-HBs: подложка — коньюгат — является одним из самых значимых параметров разрабатываемой тест-системы. Данный факт очень важен, так как на взаимодействие антитела с антигеном способны повлиять небольшие различия в первичной структуре молекулы последнего, а также изменение заряда и стерической кон-формации его последовательности. Поэтому используемые в диагностике антигены должны обладать свойствами, наиболее приближенными к свойствам нативных антигенов инфекционных агентов, которые и вызвали синтез антител. Использование монокло-нальных антител для создания диагностических наборов, не прошедших полное предварительное тестирование на стандартных контрольных панелях, делает возможным пропуск обнаружения некоторых мутантых вариантов HBsAg. В настоящее время в некоторых работах отмечается, что существует как минимум 66 моноклональных антител, которые могут быть использованы для конструирования ИФА тест-систем для выявления HBsAg [8].
Таким образом, используемые для создания иммуноферментных наборов монокло-нальные антитела должны проходить тщательное предварительное тестирование против всех известных в настоящее время вариантов антигенного комплекса, именуемого HBsAg.
В результате проведения предварительных внутрилабораторных испытаний было установлено, что чувствительность тест-системы, созданной на основе пары моноклональных анти-HBs (Х 12-Х 7), достигает 0,1 нг/мл при тестировании стандартов, содержащих HBsAg. Выбор для создания разрабатываемой тест-системы именно этой пары антител основан на анализе литературных данных [1, 6] и собственного опыта (обследовано 123 больных HBV-инфекцией).
В то же время недостатком разрабатываемой тест-системы является малое время удержания сорбции при хранения набора (не более двух недель). Выходом из данной ситуации, на наш взгляд, является создание варианта тест-системы с моноклональными анти-HBs для сорбции с фасовкой в отдельном флаконе, которые разводятся непосредственно перед проведением исследований, а также проведение дальнейшей работы над консервацией сорбированных планшет, для чего, в частности, нами планируется использование вакуума для упаковки сорбированных планшет и применение различных химических консервантов.
В результате проведенной работы, разработанные диагностические препараты были апробированы с использованием сывороток крови больных хроническим вирусным гепатитом В, находившихся на лечении в инфекционных стационарах Гомельской и Витебской областей.
Отобран банк HBsAg позитивных сывороток крови, в котором находится более 700 сывороток крови. Дополнительно на Гомельской областной станции переливания крови проводится отбор HBsAg позитивных сывороток крови в больших объёмах.
На основе этих банков крови изготовлены пулы сывороток, содержащих HBsAg в различных концентрациях, пулы стандартизованы на тест-системах производства фирмы Вектор Бест (Новосибирская область, п. Кольцово) и НПО «ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ» (Нижний Новгород) с использованием наборов стандартных образцов (СО) HBsAg, разработанных в соответствии с международным стандартом NIBSC code 80/549 (для HBsAg) Государственным учреждением НИИ Эпидемиологии и Микробиологии Министерства Здравоохранения Республики Беларусь (ГУ НИИ ЭМ) с нашим участием.
На основе пулов сывороток изготовлен опытный образец панели стандартных сывороток, содержащих ИБвЛ§ в 8 различных концентрациях, плюс одна негативная по ИБвЛ§.
Разработанный комплект НТД на диагностические препараты полностью соответствует ГОСТу РБ «Разработка и постановка на производство медицинских изделий».
Заключение
В результате проведения предварительных внутрилабораторных испытаний было установлено, что по параметрам чувствительности и специфичности тест - система, созданная нами, практически полностью соответствует коммерческим имуно-ферментным тест-системам, зарегистрированным в Республике Беларусь, уточнённые данные по этим параметрам будут представлены после официальных медицинских испытаний, которые будут проводиться в соответствии с назначением Центра экспертиз и испытаний в Здравоохранении Республики Беларусь.
При создании иммуноферментных тест -систем, в основе которых лежит реакция антиген-антитело, необходимо учитывать неоднородность популяции антител. Соответственно правильный подбор пары моно-клональных анти-ИБв: подложка — конью-гат — является одним из самых значимых параметров разрабатываемой тест-системы. Данный факт очень важен, так как на взаимодействие антитела с антигеном способны повлиять небольшие различия в первичной структуре молекулы последнего, а также изменение заряда и стерической конформации его последовательности [2, 7, 9]. Поэтому используемые в диагностике антигены должны обладать свойствами, наиболее приближенными к свойствам нативных антигенов инфекционных агентов, которые и вызвали синтез антител. Использование монокло-нальных антител для создания диагностических наборов, не прошедших полное предварительное тестирование на стандартных контрольных панелях, делает возможным
пропуск обнаружения некоторых мутантых вариантов HBsAg [1].
Таким образом, используемые для создания иммуноферментных наборов монокло-нальные антитела должны проходить тщательное предварительное тестирование против всех известных в настоящее время вариантов антигенного комплекса, именуемого HBsAg.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бурков А.Н. Методология конструирования коммерческих тест-систем для диагностики инфекционных заболеваний. Дис. ... д-ра. мед. наук. — Нижний Новгород, 2001.
2. Васильева Е.А. Сравнительная характеристика вирусных гепатитов В и С по данным клини-ко-лабораторного и эпидемиологического обследования: Дис. ... канд. мед. наук. — СПб., 1995.
3. Вирусные гепатиты: Учебное пособие / В.И. Ро-щупкин, Н.Г. Юрченко, А.А. Суздальцев, В.Ф. Четвергов. — Самара: СГМУ, 1996. — 56 с.
4. Дзантиев Б.Б., Егоров А.М. // Ж. Всесоюзн. хим. общ. им. Д.И. Менделеева. — 1982. — Т. 27. — № 4. — С. 442—449.
5. Жаворонок С.В. Клинико-прогностические особенности хронических заболеваний печени в зависимости от циркуляции маркеров инфицирования вирусами гепатитов В, С и Д // Съезд врачей-инфекционистов в г. Суздале. — М.-Киров, 1992. — Т. 1. — C. 225—227.
6. Значение обнаружения HBsAg методом им-муноферментного анализа для клинической практики. Информативность индикации HBsAg иммуно-ферментным анализом для клинической практики. / Бурков А.Н., Блинова Т.В., Шарипова И.Н., Залес-ких Н.В., Пыренкова И.Ю., Лялина И.К., Белова Н.Г., Поздышева Л.В. — Нижний Новгород., 2002.
7. Иммуноферментный анализ. Пер. с англ. / Под ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхоффа. — М.: Мир, 1988. — 446 с.
8. Патент № 2082759 Бирагийн Арьяа [MN] Скрябин Константин Георгиевичей] Эльдаров Михаил Анатольевич [RU] Штамм дрожжей saccharomyces cerevisial, содержащий рекомбинант-ную плазмиду YEP 63/AB, — продуцент производного М-белка вируса гепатита В человека.
Поступила 28.03.2005
