CC BY
58
Апробация в доклинических испытаниях метода определения вируснейтрализующей активности вакцины-кандидата против ВИЧ-инфекции КомбиВИЧвак с использованием технологии псевдовирусов ВИЧ-1
А.Б. Рыжиков1, К.А. Саркисян2, Л.И. Карпенко1, О.Г. Пьянкова1, Л.А. Шаламова1, И.В. Борисевич2, М.С. Воробьева2, М.П. Богрянцева1, А.А. Ильичев1, Д.С. Монтефиори3, Е.А. Нечаева1
1ФБУН «ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, р.п. Кольцово Новосибирской области (vector@vector.nsc.ru)
2ФГБУ «НЦ экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России, Москва (info@gisk.ru)
3Медицинский центр Университета Дьюка, Северная Каролина, США
Резюме
Ранее нами было показано, что вакцина-кандидат КомбиВИЧвак имеет специфическую активность и подлинность, установленные при исследовании сывороток иммунизированных животных методами иммуноферментного анализа и иммунного блоттинга. В данной работе приведены результаты апробации в доклинических испытаниях метода определения вируснейтрализующей активности вакцины-кандидата против ВИЧ-инфекции КомбиВИЧвак с применением технологии, использующей псевдовирусы. Даны рекомендации по стандартизации реакции нейтрализации псевдовирусов ВИЧ-1 с целью ее широкого внедрения в практику при проведении клинических испытаний вакцин против ВИЧ-1.
Ключевые слова: вакцина-кандидат КомбиВИЧвак, ВИЧ-инфекция, псевдовирус ВИЧ-1
Testing in Preclinical Trials Method for Determining the Neutralizing Activity of Vaccine-Candidate against HIV Infection СombiHIVvaс Using HIV-1 Pseudoviruses Technology
A.B. Ryzhikov1, K.A. Sarkisyan2, L.I. Karpenko1, O.G. Pyankova1, L.A. Shalamova1, I.V. Borisevich2, M.S. Vorobyeva2, M.P. Bogryantseva1, A.A. Ilyichev1, D.S. Montefiori3, E.A. Nechaeva1 1State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», Koltsovo, Novosibirsk Region (vector@vector.nsc.ru) 2The Federal Government Budget Institution «Scientific Center of Examination of Medical Means Applications»Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation, Moscow (info@gisk.ru)
3Duke University Medical Center, North Carolina, USA Abstract
Earlier it was shown that the candidate vaccine CombiHIVvac has specific activity and specificity determined during research of sera of the immunized animals by ELISA and immunoblotting methods. In this work we showed results on approbation in nonclinical tests of the method of virus neutralizing activity definition of the candidate vaccine CombiHIVvac against HIV with involvement of technology using pseudoviruses. We made recommendations concerning standardization of neutralization reaction of HIV-1 pseudoviruses for its wide practical application when carrying out of clinical trials of vaccines against HIV-1.
Key words: candidate vaccine CombiHIVvac, HIV infection, HIV-1 pseudovirus
Введение
Вакцина КомбиВИЧвак представляет собой ми-целлоподобные частицы, объединяющие в своем составе полиэпитопный белок TBI и ДНК-вакцину pcDNA-TCI [2]. Белок TBI был разработан для стимуляции гуморального иммунного ответа, он содержит эпитопы из белков Env и Gag ВИЧ-1. TCI-иммуноген
спроектирован для стимуляции клеточного ответа. Он содержит более 80-ти перекрывающихся эпито-пов (как CD8+ CTL, так и CD4+ Th) из основных вирусных белков Env, Gag, Pol и Nef. Выбранные эпитопы консервативны у субтипов A, B и С ВИЧ-1 [6].
Одним из основных показателей эффективности вакцины является способность индуцировать анти-
тела, которые могут не только узнавать, но и ней-трализовывать вирус. Вируснейтрализующие антитела предотвращают развитие инфекции и определяют протективные (защитные) свойства вакцины против живого активного ВИЧ. В момент инфицирования ВИЧ-нейтрализующие антитела существенно ограничивают и даже исключают возможность образования мутантных вариантов вируса, способных избегнуть нейтрализующего действия антител [8].
В связи с этим изучение вируснейтрализующих свойств антител, индуцированных вакциной Ком-биВИЧвак, становится важной задачей доклинического исследования препарата.
Сравнительные характеристики трех методов измерения степени нейтрализации ВИЧ-1 показаны в таблице 1. Из приведенного сравнения видно, что система псевдовирусов имеет некоторые преимущества как платформа, которая позволяет быстро измерять наличие ВИЧ-нейтрализующих антител против вирусных частиц, несущих оболо-чечные белки, свойственные начальному этапу инфицирования человека. Технология использования псевдовирусов позволяет работать с вирусными частицами из множества вирусных субтипов, обеспечивать высокий уровень воспроизводимости и производительности, применять простые и безопасные реагенты, которые можно распространять по всему миру в виде диагностических наборов, и, что очень важно для контрольных лабораторий, может быть валидирована.
Метод нейтрализации с использованием псевдовирусов и генно-инженерных линий клеток является новым технологическим подходом. Псев-
довирусы представляют собой вирусные частицы, полученные из молекулярно клонированных оболо-чечных белков ВИЧ-1 определенного штамма и дефектного генома, который не способен обеспечить формирование инфекционных дочерних вирионов. Клетки-мишени, созданные методами генной инженерии, содержат рецептор CD4 и корецепторы CCR5 и CXCR4, а также репортерный ген люцифе-разы, который активируется в результате инфицирования ВИЧ-1. Экспрессия активированного гена люциферазы в инфицированных клетках детектируется с помощью люминометра, при этом интенсивность люминесценции пропорциональна уровню инфекции, а подавление люминесценции соответствует нейтрализации ВИЧ-инфекции [7]. В таблице 1 приведены сравнительные характеристики метода измерения степени ВИЧ-нейтрализации с помощью неклонированных изолятов на моно-нуклеарных клетках периферической крови (первый метод), вирусов ВИЧ-1, многократно пассированных на перевиваемых линиях Т-лимфоцитов (второй метод), и технологии использования псевдовирусов (третий метод).
Цель работы - апробация в доклинических испытаниях метода определения вируснейтрализую-щей активности вакцины-кандидата против ВИЧ-1 КомбиВИЧвак с помощью технологии использования псевдовирусов ВИЧ-1.
Материалы и методы
Определяли вируснейтрализующие антитела к ВИЧ-1 в иммунных сыворотках после иммунизации вакциной КомбиВИЧвак с помощью технологии применения псевдовирусов в культуре клеток TZM-bl.
Таблица 1.
Сравнительные характеристики трех методов измерения степени нейтрализации ВИЧ-1
Сравниваемый показатель Первичные лимфоциты периферической крови Перевиваемые линии Т-лимфоцитов Культура клеток TZM-bl
Тип клеток Первичные лимфоциты периферической крови Неопластические CD4+ Т-клетки Эпителиальные клетки HeLa
Вирус Первичный неклонированный Адаптированный к Т-клеткам вариант Псевдовирус первичный неклонированный
Продолжительность измерения 4 - 6 дней 5 - 7 дней 2 - 3 дня
Регистрация результата Антиген р24 Обратная транскриптаза Синцитий БОЕ ЦПД Антиген р24 Активность люциферазы, грин-флюоресцеин-белка, щелочной фосфатазы, бета-галактозидазы
Количество инфекционных циклов Множество Множество Только один
Способность измерять ингибирование прикрепления/ проникновения межклеточной инфекции Да/да Да/да Да/нет
Используемые корецепторы CCR5, CXCR4 и др. (CCR5 наиболее физиологичен) CXCR4 CCR5, CXCR4 (100-кратное превышение поверхностной концентрации CCR5 над первичными лимфоцитами)
Это исследование состоит из пяти этапов, включающих подготовку материалов и проведение опыта. Исследование проводилось на базе ФБУН «ГНЦ ВБ «Вектор» сотрудниками Центра и представителями ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ныне - ЦЭК МИБП ФГБУ «НЦ ЭСМП»).
Этап 1. Подготовка культуры клеток 293Т/17 для проведения котрансфекции и получения псевдовирусов ВИЧ Материалы: перевиваемая линия клеток 293Т/17; ФБР (фосфатный буферный раствор); среда «Игла», модифицированная DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, GIBCO/Invitrogen, США); MEM Non-Essetial Amino Acids Solution (10 ммоль), NAA (a-naphthaleneacetic acid), GIBCO/Invitrogen, США; антимикотик (амфотерицин В, стрептомицин, пенициллин G), ООО «Биолот», Санкт-Петербург; сыворотка крови плодов коровы, Invitrogen, США; раствор трипсина с ЭДТА.
Оборудование: термостат, инвертированный микроскоп.
Работа с культурой клеток 293Т/17: для наращивания культуры клеток 293Т/17 использовалась ростовая среда, состоящая из DMEM, амфотери-цина В, стрептомицина и пенициллина, с добавлением раствора аминокислот MEM Non-Essential Amino Acids Solution и 10%-ной сыворотки крови плодов коровы. Стерилизовали ростовую среду фильтрованием (фильтр 0,22 мкм). Удаляли питательную среду с монослоя клеток в культуральном флаконе Т25, после чего добавляли раствор трип-син-ЭДТА, инкубировали 30 - 45 секунд при комнатной температуре, затем удаляли раствор трипсина и инкубировали при 37,0 ± 0,2 °С в течение трех минут. Прибавляли 10 мл ростовой среды и ресуспендировали клетки пипетированием. Проводили подсчет концентрации клеток и засевали в новый культуральный флакон Т25 по 300 тыс. клеток в 5 мл ростовой среды. Продолжали инкубацию при 37 оС в течение трех суток.
Этап 2. Проведение котрансфекции и получение псевдовирусов Материалы: рекомбинантные плазмидные ДНК: 1) PVO, клон 4 (SVPB11), формирующая псевдовирусные частицы с низкой чувствительностью к нейтрализации, 2) SF162.LS, формирующая псевдовирусные частицы с высокой чувствительностью к нейтрализации, и 3) pSG3delta Env, содержащая геном ВИЧ-1, дефектный по гену оболочечного гликопротеина gp160; трансфектант ExGen 500; физиологический раствор; поддерживающая среда DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), содержащая амфотерицин В, стрептомицин 500 мг, пенициллин G (500 000 ЕД), 250 мкл MEM Non-Essential Amino Acids Solution (10 ммоль).
Сток Env-типированных псевдовирусов нарабатывали в культуре клеток 293Т/17 путем котранс-фекции двух плазмид, одна из которых содержит
ген Env, кодирующий оболочечные белки ВИЧ-1, а другая - геном ВИЧ-1, за исключением гена Env. Только Env-минус-плазмида pSG3delta Env способна реплицироваться в клетках 293Т/17, и она участвует в упаковке псевдовириона, чтобы доставить tat-ген в клетки TZM-bl. Таким образом, котрансфекция клеток 293Т/17 вышеуказанными плазмидами формирует потомство инфекционных псевдовирусных частиц, которые не способны воспроизводиться.
Проведение котрансфекции: в двух стерильных микропробирках готовили смесь реагентов - двух плазмидных ДНК и трансфектанта ExGen 500 («Хеликон», Москва), перемешивали содержимое микропробирок с плазмидами и ExGen 500 на «Вортексе», инкубировали при комнатной температуре 10 минут для образования комплекса плазмид с ExGen 500. Добавляли содержимое обеих микропробирок (комплекс плазмид с ExGen 500) в культуральный флакон с клетками 293Т/17. Инкубировали клетки с комплексом три часа в термостате при 37,0 ± 0,2 °С. Затем в культуральный флакон добавляли ростовую среду и инкубировали при 37,0 ± 0,2 °С двое-трое суток. После окончания инкубации супернатант культуры клеток 293Т/17 центрифугировали, чтобы осадить клетки и клеточный детрит. Полученную суспензию псевдовирусных частиц стерилизовали фильтрованием через фильтр с размером пор 0,45 мкм и разливали в стерильные пробирки.
Этап 3. Определение инфекционной активности псевдовирусов и подбор рабочей дозы псевдовируса для реакции нейтрализации(РН)
Материалы: культура перевиваемых клеток TZM-bl; псевдовирус SF162; псевдовирус PVO4; поддерживающая среда для культивирования клеток DMEM, амфотерицин В, стрептомицин, пенициллин, 96-луночный культуральный планшет; ДЕАЕ-декстран; 96-луночный микропланшет для люминометрии; набор для выявления люцифера-зы (Dual-Luciferase Reporter 1000 Assay System, Promega, США): лизирующий буфер и реагент (субстрат) для выявления люциферазы светлячка.
Оборудование: люминометр планшетный, термостат, инвертированный микроскоп.
Для постановки реакции нейтрализации используется псевдовирус с инфекционной активностью 100 TCID50. Поэтому после получения стока псевдовирусов необходимо измерить их инфекционную активность с целью определения рабочего разведения псевдовируса.
Измерение инфекционности: на поддерживающей среде готовили пятикратные разведения псевдовирусов до 11-го разведения, после чего смешивали с равным объемом суспензии клеток TZM-bl в концентрации 15 000 клеток/100 мкл в ростовой среде. Инкубировали микропланшет 48 часов при температуре 37,0 ± 0,2 °С в ат-
мосфере 5%-ного СО2. После окончания инкубации промытые клетки разрушали с использованием лизирующего буфера (Bioscience Pharmingen (кат. № 51-56871), США) и переносили по 30 мкл ли-зата в соответствующие лунки 96-луночного микропланшета для измерения люминесценции, затем вносили по 100 мкл реагента для выявления люциферазы и незамедлительно проводили учет люминесценции в планшетном люминометре. Рассчитывали значение TCID50 по методу Рида-Менча, при этом лунки, в которых люминесценция меньше, чем трехкратный фоновый сигнал от культуры клеток, считаются отрицательными.
Этап 4. Нейтрализация псевдовирусов ВИЧ-1 иммунными сыворотками
Материалы: сыворотки крови мышей линии BALB/С, иммунизированных сериями вакцины КомбиВИЧвак двукратно с интервалом 28 суток; референс-сыворотки - сыворотка К(+), полученная от ВИЧ-инфицированного, обладающая нейтрализующей активностью, и сыворотка К(-), не обладающая ВИЧ-нейтрализующей активностью; для постановки РН использовались те же реагенты, материалы и оборудование, что и указанные в пункте 3.
Величина вируснейтрализующей активности исследуемого образца сыворотки крови мышей измеряется как обратное значение его разведения, при котором достигается 50%-ное подавление вирус-индуцированной люминесценции в сравнении с люминесценцией только псевдовируса без добавления исследуемой сыворотки.
Постановка реакции нейтрализации: в поддерживающей среде готовили трехкратные разведения сывороток, включая контрольные образцы.
Готовили сток с псевдовирусами SF162 и PVO4 таким образом, чтобы обеспечить инфекционную активность в лунке, равную 100 TCID50, после добавления суспензии псевдовируса и суспензии клеток TZM-bl. Схема внесения образцов сыворотки и псевдовирусов приведена в таблице 2. Для каждого разведения исследуемой сыворотки использовали по два ряда лунок планшета: один - для псевдовируса SF162, другой - для псевдовируса PVO4. После смешивания псевдовируса и сыворотки закрывали планшет и инкубировали один час при температуре 37,0 ± 0,2 °С в атмосфере с 5%-ным СО2. Готовили суспензию TZM-bl-клеток и вносили по 15 000 клеток в каждую лунку планшета. Планшет инкубировали 48 часов при температуре 37,0 ± 0,2 °С в атмосфере с 5%-ным СО2. После окончания инкубации промытые клетки разрушали с помощью лизирующего буфера (Bioscience Pharmigen (кат. № 5156871), США) и переносили по 30 мкл лизата в соответствующие лунки 96-луночного микропланшета для измерения люминесценции, затем вносили по 100 мкл реагента для выявления люциферазы и незамедлительно проводили учет люминесценции в планшетном люминометре.
Этап 5. Учет и обработка результатов
нейтрализации псевдовирусов ВИЧ-1
Нейтрализация псевдовируса каждым разведением сыворотки определялась разностью показателей люминесценции в измеряемой лунке (клетки + сыворотка + вирус) и усредненного значения по контрольным лункам (только клетки) и делением этой разности на разность между усредненными показаниями люминесценции вирусного контроля (вирус + клетки) и контроля клеток
Таблица 2.
Схема внесения в лунки микропланшета проб исследуемых сывороток и контролей для измерения ВИЧ-нейтрализующей активности сывороток (в ячейках указаны разведения исследуемой сыворотки)
Псевдовирус SF162 PVO4 SF162 PVO4 SF162 PVO4 SF162 PVO4 SF162 PVO4
Сыворотка № 1 № 1 № 2 № 2 № 3 № 3 К(+) К(+) К(-) К(-)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A SF162 PVO4 1:44 734 1:44 734 1:44 734 1:44 734 1:44 734 1:44 734 1:44 734 1:44 734 1:44 734 1:44 734
B SF162 PVO4 1:14 911 1:14 911 1:14 911 1:14 911 1:14 911 1:14 911 1:14 911 1:14 911 1:14 911 1:14 911
C SF162 PVO4 1:4970 1:4970 1:4970 1:4970 1:4970 1:4970 1:4970 1:4970 1:4970 1:4970
D SF162 PVO4 1:1657 1:1657 1:1657 1:1657 1:1657 1:1657 1:1657 1:1657 1:1657 1:1657
E SF162 PVO4 1:552 1:552 1:552 1:552 1:552 1:552 1:552 1:552 1:552 1:552
F Клетки Клетки 1:184 1:184 1:184 1:184 1:184 1:184 1:184 1:184 1:184 1:184
G Клетки Клетки 1:61 1:61 1:61 1:61 1:61 1:61 1:61 1:61 1:61 1:61
H Клетки Клетки 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20
(только клетки); полученное частное умножается на 100% с использованием формулы: Нейтрализация (%) = 100% х (RLU - RLU ) /
1 —1\/ \ кл. + сыв. + вир. кл/ '
(RLU - RLU ),
v кл. + вир. кл/
где RLU - интенсивность люминесценции в лунке в относительных единицах.
Титр нейтрализующих антител IC50 (50% inhibition concentration) выражается в обратной величине разведения сыворотки, при которой обеспечивается 50%-ное подавление люминесценции. Если известна концентрация общего IgG в исследуемой сыворотке, то IC50 можно выражать в мкг/мл общего IgG, что позволит сравнивать полученные данные с результатами, известными и опубликованными данными IC50 для широко нейтрализующих моно-клональных антител или других нейтрализующих антител. Расчет показателя IC50 и его 95%-ного доверительного интервала проводится методом про-бит-анализа с использованием результатов измерения нейтрализации (%) для каждого из восьми разведений сыворотки. Величина интенсивности люминесценции для образцов ненейтрализующей контрольной сыворотки К(-) должна укладываться в пределы 95%-ного доверительного интервала, определенного для вирусного контроля (вирус + клетки).
Результаты и обсуждение
Результаты исследования вируснейтрализую-щей активности сывороток крови мышей, иммунизированных вакциной КомбиВИЧвак, для псевдовирусов SF162 и PVO4 приведены в таблице 3
с расчетом нейтрализующей IC50 как величины total IgG (мкг/мл) с указанием доверительного интервала на уровне значимости 5%.
Исследовали сыворотки, полученные до вакцинации и после двукратной вакцинации с интервалом 14 суток. Забор крови проводили на 14-е сутки после завершения прививок. Как видно из таблицы 3, титры образцов сывороток на 14-е сутки после иммунизации варьировали от IC50 = 1:1315 до IC50= 1:5000 для клона SF162 и от 1:556 до 1:53 для клона PVO4, что подтверждает крайне высокую чувствительность к нейтрализации клона SF162. При этом результаты исследования отрицательных сывороток, взятых до вакцинации, показывают IC50 > 1:20, что значимо отличается от результатов, полученных для иммунизированных мышей. Референс-сыворотка с высокой вируснейтрализующей активностью характеризовалась в проведенном опыте высоким уровнем титра антител (IC50 < 1:45 000 для клона SF162 и 1:5000 для клона PVO4). Пересчет значений IC50 как концентрации общего IgG иммунной сыворотки, соответствующей 50%-ной нейтрализации, на основании измерения уровня общего иммуноглобулина в сыворотке крови каждой мыши позволяет провести сравнение полученных значений нейтрализующей активности иммунных сывороток с активностью признанных мировых стандартов ВИЧ-нейтрализации - таких, как моноклональные антитела IgG 1b12, 2G12 и 2F5.
Полученные с помощью технологии использования псевдовирусов данные подтверждаются
Таблица 3.
Нейтрализация псевдовирусных клонов ВИЧ-1 субтипа В сыворотками крови иммунных мышей, двукратно вакцинированных КомбиВИЧвак, и контрольной нейтрализующей сывороткой крови (К+) ВИЧ-инфицированного пациента
IC50 как разведение иммунной сыворотки крови мыши, мкг/мл Ю50 как концентрация общего 1дв в иммунной сыворотке крови мыши, мкг/мл
Псевдовирус Env-клон SF162 Env-клон PVO4 Env-клон SF162 Env-клон PVO4
Образцы сывороток крови мыши разведение сыворотки 95%-ный доверительный интервал разведение сыворотки 95%-ный доверительный интервал общий IgG 95%-ный доверительный интервал общий IgG 95%-ный доверительный интервал
1 - 14 0,00051 0,0009 -0,0003 0,019 0,013 - 0,028 1,58 0,93 - 2,79 58,9 40 - 87
1 - 0 < 0,05 - < 0,05 - > 155 - > 155 -
2 - 14 0,00076 0,00045 -0,00135 0,028 0,019 - 0,042 4,6 2,7 - 8,1 169,5 117 - 252
2 - 0 < 0,05 - < 0,05 - > 302 - > 302 -
3 - 14 0,0002 0,00012 -0,00036 0,023 0,016 - 0,034 0,49 0,29 - 0,86 55,2 37 - 81
3 - 0 < 0,05 - < 0,05 - > 120 - > 120 -
К+ > 0,00002 - 0,0002 - < 0,05 - 6,0 -
TriMab* - - - - 0,03** - 4,2** -
Примечание:*ТпМаЬ представляет собой смесь трех широко нейтрализующих моноклональных антител IgG 1Ь12, 2G12 и 2F5. **Данные взяты из статьи и М. и соавт. [5].
результатами исследований, проведенных ранее с живым вирусом [2, 3], когда постановка реакции вируснейтрализации заключалась в определении in vitro нейтрализующих свойств сывороток крови иммунизированных вакциной лабораторных животных на модели острой инфекции референс-штаммом ВИЧ-1 в перевиваемых лимфоидных клетках человека МТ-4. Нейтрализующая активность антител определялась по ингибированию вирусной инфекции, путем измерения содержания р24-антигена ВИЧ-1 в культуральной жидкости с помощью ИФА [1, 4]. Этот метод измерения нейтрализации ВИЧ зависит от способности вируса, адаптированного к Т-клеточной линии, инфицировать эту линию, производить детектируемые вирусные белки или формировать гигантские клетки (синцитии), что в конечном итоге можно было количественно выразить как меру уменьшения инфекции под воздействием антител. Метод достаточно простой при постановке, однако обладает рядом недостатков, в первую очередь связанных с тем, что в этом случае в реакции используется один и тот же адаптированный лабораторный штамм вируса. Изучение нейтрализации одного штамма ВИЧ-1 не обеспечивает полного представления о нейтрализующей, протективной активности сывороток крови животных или человека, иммунизированных вакциной против ВИЧ, против других актуальных штаммов ВИЧ, многообразие которых определяется их антигенной изменчивостью, и нейтрализация вирусов, адаптированных к культуре Т-клеток, очень плохо предсказывает нейтрализующие свойства первичных ВИЧ-изолятов.
Технология, основанная на использовании псевдовирусов, лишена вышеуказанных недостатков. Она позволяет работать с вирусными частицами из множества вирусных субтипов, используя простые и безопасные реагенты, обеспечивает высокий уровень воспроизводимости и производительности.
Метод оценки вируснейтрализующей активности образцов иммунных сывороток с использованием псевдовирусов ВИЧ-1, полученных на культуре клеток 293Т/17, и проведение теста нейтрализации в культуре клеток TZM-bl c учетом люминесценции люциферазы занимает примерно 10 - 12 суток. Метод, несмотря на большую продолжительность и проведение в пять этапов до получения результатов, достаточно точен и воспроизводим. Полученные псевдовирусы имеют только один цикл размножения, работа с ними не требует особых условий защиты исследователя.
При внедрении данного метода в других научно-исследовательских лабораториях для оценки вируснейтрализующей активности необходимо выполнить следующие рекомендации:
Культуры клеток 293Т/17 и TZM-bl должны быть паспортизированы, на их основе должны быть приготовлены, аттестованы и заложены на хранение рабочие банки клеток.
Рекомбинантные плазмиды, используемые при котрансфекции для наработки псевдовирусов, также следует охарактеризовать, изучить их стабильность и заложить на хранение.
Для сокращения времени и упрощения постановки теста нейтрализации сывороток целесообразно вышеуказанные пять этапов постановки теста свести к двум:
• получение псевдовирусов ВИЧ-1 на культуре клеток 293Т/17, изучение условий хранения и стабильности готовых псевдовирусов, включая лиофильное высушивание; определение инфекционной активности при одном цикле инфекции в культуре клеток TZM-bl, закладка этих псевдовирусов на хранение и распределение их между организациями - участниками клинических испытаний вакцины ВИЧ-1;
• проведение теста нейтрализации в течение одного рабочего дня с использованием стандартизованных псевдовирусных реагентов и исследуемых сывороток в культуре клеток TZM-bl с учетом инфекционности по уровню люминесценции.
Наряду с расчетом величины ВИЧ-нейтра-лизующего титра сыворотки следует проводить нормировку на индивидуальный уровень общего иммуноглобулина и представлять результаты ВИЧ-нейтрализации в виде ингибирующей концентрации иммуноглобулинов 1С50 в мкг/мл.
Выводы
1. Апробирован в доклинических испытаниях метод определения вируснейтрализующей активности вакцины-кандидата против ВИЧ-1 Комби-ВИЧвак с применением технологии использования псевдовирусов.
2. Технология использования псевдовирусов с целью определения вируснейтрализующей активности сывороток должна найти широкое применение, особенно при проведении клинических испытаний, когда требуется проводить стандартизованное исследование вируснейтрализующей активности достаточно большого количества образцов. ш
Литература
1. Карамов Э.В., Павлова Т.В., Корнилаева Г.В. и др. Кандидатные анти-ВИЧ-вакцины индуцируют сильный нейтрализационный ответ // Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2003. № 9. С. 151 - 158.
2. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Ерошкин А.М. и др. Вакцина КомбиВИЧ-вак, содержащая полиэпитопные В- и Т-клеточные иммуногены ВИЧ-1 // ДАН. 2007. Т. 413. № 4. С. 553 - 556.
3. Чеканова Т.А. Методы лабораторной оценки и стандартизации кандидатных вакцин против ВИЧ-инфекции / СПИД: Дис. ... к.б.н. - М., 2006.
4. End Point Neutralization Assay. WHO Guidelines for Standart HIV Isolation Procedures 1994, 1998 update.
5. Li M., Gao F., Mascola J.R. et al. Human immunodeficiency virus type 1 env clones from acute and early subtype B infections for standardized assessments of vaccine-elicited neutralizing antibodies // J. Virol. 2005. V. 79 (16). P. 10108 - 10125.
6. Karpenko L.I., Ilyichev A.A., Eroshkin A.M. et al. Combined virus like particle-based polyepitope DNA / protein HIV-1 vaccine. Design, immunogenicity and toxicity studies // Vaccine. 2007. V. 25. P. 4312 - 4323.
7. Mascola J.R., D'Souza P, Gilbert P et al. Recommendations for the design and use of standard virus panels to assess
neutralizing antibody responses elicited by candidate human immunodeficiency virus type 1 vaccines // J. Virol. 2005. V. 79 (16). R 10103 - 10107.
8. Mascola J.R., Montefiori D.C. The role of antibodies in HIV vaccines // Annu. Rev. Immunol. 2010. V. 28. R. 413 - 444.
Сравнительная оценка активности анти-HBs, индуцированных естественным путем или вакцинацией, в отношении различных вариантов HBsAg
А.И. Баженов2, Д.А. Эльгорт1, А.А. Фельдшерова1, П.З. Будницкая1, Г.И. Никитина1, Ю.С. Хац1, М.В. Коноплева1, М.А. Годков2, В.Н. Борисова3 (borisova@combiotech.com), Т.А. Семененко1 (semenenko@gamaleya.org), А.П. Суслов1
1ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России, Москва 2НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, Москва 3ЗАО «НПК «Комбиотех», Москва
Резюме
Проведена сравнительная оценка активности анти-HBs в отношении природных и рекомбинантных вариантов HBsAg «дикого»типа и HBsAg с заменами в 143-м и 145-м положениях. Объектом исследования служили образцы сывороток крови лиц, вакцинированных против гепатита В или переболевших им. Активность анти-HBs измерялась при помощи теста нейтрализации, основанного на конкуренции различных вариантов HBsAg за связывание со специфическими антителами. Установлено, что в сыворотках переболевших гепатитом В людей содержатся выскоактивные антитела против HBsAg«дикого» типа, HBsAg G145R и HBsAg S143L. Напротив, у лиц, иммунизированных против гепатита В, практически полностью отсутствуют анти-HBs к HBsAg G145R. Обнаружена высокая гетерогенность активности анти-HBs к HBsAg G145R по сравнению с активностью анти-HBs к HBsAg «дикого» типа и HBsAg S143L в группе переболевших гепатитом В. Выявлены значительные различия результатов, полученных при использовании в качестве конкурирующего антигена природных вариантов HBsAg и соответствующих им по аминокислотной последовательности рекомбинантных пептидов. Полученные данные показывают важную роль выработки анти-HBs к HBsAg G145R в процессе развития эффективного иммунного ответа в ходе естественного течения ВГВ-инфекции; необходимость оценки соответствия антигенных свойств рекомбинантных пептидов и их природных аналогов в случае использования этих пептидов в составе вакцин против гепатита В; высокую актуальность создания средств активной и пассивной иммунопрофилактики, разработанных с учетом серологического «ускользания»ВГВ.
Ключевые слова: ВГВ-инфекция, анти-HBs, HBsAg G145R, S143L, вакцины против гепатита В
The Comparative Estimation of Anti-HBs Activity against Native and Recombinant Type HBsAg
A.I. Bazhenov2, D.A. Elgort1, A.A. Feldsherova1, P.Z. Budnitskaya1, G.I. Nikitina1, Yu.S. Hats1, M.V. Konopleva1, M.A. Godkov2, V.N. Borisova3 (borisova@combiotech.com), T.A. Semenenko1 (semenenko@gamaleya.org), A.P. Suslov1 1Federal State Budgetary Institution «Research Institute of Epidemiology and Microbiology named N.F. Gamaleya», Health and Social Development Ministry of Russia, Moscow 2 N.V. Sklifosovsky Research Institute of Emergency Care, Moscow 3Scientific and Production Company «Combiotech», Moscow Abstract
The comparative estimation of anti-HBs activity against native and recombinant «wild» type HBsAg and HBsAg with the amino acid substitution in 143, 145 positions was carried out. Samples of blood sera taken from individuals vaccinated against hepatitis B and had hepatitis B. The anti-HBs activity were measured with the help of the neutralisation test in which various HBsAg variants compete for linkage to specific antibodies against «wild» type HBsAg, HBsAg G145R, HBsAg S143L.
It was shown, that there are highly active antibodies against «wild» type HBsAg, HBsAg G145R, S143L in sera of individuals who had hepatitis B. On the contrary, anty-HBs to HBsAg G145R are practically absent in blood sera of immunized individuals. High heterogeneity of anti-HBs activity against HBsAg G145R was detected in comparison with the activity of anti-HBs to «wild» type HBsAg and HBsAg S143L in the group of individuals who had hepatitis B. Different results in the neutralisation test were detected when using recombinant HBsAg (analogues of the native HBsAg) as competing antigen.
The obtained data show a big importance of anti-HBs G145R for developing of effective immune response, the need to estimate
