CC BY
35
Выявление антител к мутантным формам
HBsAg у лиц, иммунизированных
против гепатита В вакцинами разных субтипов
А.И. Баженов2, Д.А. Эльгорт1, А.А. Фельдшерова1, П.З. Будницкая1, Г.И. Никитина1, Ю.С. Хац1, М.В. Коноплева1, М.А. Годков2, В.Н. Борисова3, Л.В. Ярош1, Т.А. Семененко1 (semenenko@gamaleya.org), А.П. Суслов1
1ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России, Москва
2Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского, Москва
3ЗАО «НПК «Комбиотех», Москва
Резюме
Распространение «ускользающих» («эскейп») мутантов вируса гепатита В (ВГВ) снижает эффективность вакцинации против ГВ. Проведено изучение способности вакцин разных серологических типов индуцировать выработку антител против мутантов ВГВ й145Н и 31431. Иммуногенность вакцин в отношении мутантов ВГВ оценивали по оригинальной методике - модификации теста нейтрализации, в ходе которого различные варианты НБвА£ конкурируют за связывание со специфическими антителами. Показано, что вне зависимости от серологического типа вакцины индуцируются антитела, способные взаимодействовать с НБэА^ «дикого» типа и 31431, но не с НБэА^ й145Н. Полученные данные позволяют рассматривать предложенную методику как удобный инструмент для оценки эффективности вакцин против ГВ. Отмечается необходимость создания вакцины против ГВ с высоким профилактическим потенциалом против наиболее значимых мутаций вакцинального «ускользания», таких как й145Н.
Ключевые слова: вакцины против гепатита В, мутанты вакцинального «ускользания» ВГВ й145Н и 31431, эффективность иммунизации
Detection of Antibodies to HBsAg Mutant Forms
in Individuals Immunized of Different Subtypes Hepatitis B
Vaccines
A.I. Bazhenov2, D.A. Elgort1, A.A. Feldsherova1, P.Z. Budnitskaya1, G.I. Nikitina1, Yu.S. Hats1, M.V. Konopleva1, M.A. Godkov2, V.N. Borisova3, L.V. Yarosh1, T.A. Semenenko1 (semenenko@gamaleya.org), A.P. Suslov1 1Federal State Budgetary Institution «Research Institute of Epidemiology and Microbiology Named Honorary Academician N.F. Gamaleya», Health and Social Development Ministry of Russia, Moscow
2N.V. Sklifosovsky Research Institute of Emergency Care, Moscow 3Scientific and Production Company «Combiotech», Moscow Abstract
The distribution of«escaping» mutants of hepatitis B virus (HBV) reduces vaccination efficiency against hepatitis B. The study of the ability of different serological types of vaccines to induce development of antibodies against HBV-mutants G145R and S143L was carried out. The vaccines immunogenicity concerning HBV-mutants was estimated by the original method - modification of the neutralisation test in which various HBsAg variants compete for linkage to specific antibodies. It was shown, that irrespective of serological types of vaccines, antibodies capable to interact with HBsAg «wild» type and S143L, but not with HBsAg G145R, are induced. The obtained data allows to consider the offered method as the convenient tool for an estimation of efficiency of vaccines against hepatitis B. The necessity of creation of a vaccine against hepatitis B with high preventive potential against the most significant «escape»-mutants, such as G145R, was emphasized.
Key words: vaccines against hepatitis B, HBsAg «escape» -mutants G145R and S143L, immunization efficiency
Введение
За последнее десятилетие эпидемический процесс гепатита В (ГВ) в России приобрел принципиально новый качественный характер: на фоне снижения заболеваемости острым ГВ регистрируется
устойчивый рост клинически выраженных хронических форм инфекции, исходом которых являются цирроз печени и гепатоцеллюлярная карцинома. Показатель заболеваемости острым ГВ в 2010 году составил 2,24 на 100 тыс. населения, что является
рекордно низким значением за все годы наблюдения. Вакцинация, признанная основным средством профилактики ГВ, бесспорно внесла значительный вклад в этот процесс. Наиболее ощутимые результаты были достигнуты при реализации приоритетного Национального проекта «Здоровье», когда за 2006 - 2009 годы было дополнительно привито более 40 млн детей, подростков и взрослых в возрасте 18 - 55 лет [5].
Несмотря на выраженную эффективность специфической профилактики ГВ, существует целый ряд вопросов, которые требуют ответа: какова длительность и напряженность иммунитета, в чем причина феномена наличия 5 - 10% здоровых лиц, не отвечающих на вакцинацию (нон-респондеры), и др. Кроме того, массовая вакцинация против ГВ, реализуемая во многих странах мира в рамках национального календаря прививок, а также использование противовирусных препаратов для лечения заболевания способствуют преимущественной селекции и распространению мутантных форм вируса гепатита В (ВГВ), которые не выявляются тестами, основанными на иммунодетекции HBsAg и «ускользают» от протек-тивного действия поствакцинального иммунитета [17]. Существование и распространение «ускользающих» («эскейп») мутантов, отличительной чертой которых является экспрессия HBsAg с атипичными серологическими свойствами, представляют большую опасность, особенно для донорства, так как, будучи невыявленными в ходе стандартного тестирования, они могут беспрепятственно распространяться с кровью бессимптомных носителей. Кроме того, с повышением частоты появления «эскейп»-мутантов снижается эффективность современной стратегии вакцинации. Некоторые мутации S-гена приводят к изменениям серологических свойств универсальной детерминанты и, как следствие, к снижению способности протективных специфических антител взаимодействовать с му-тантным HBsAg [19]. Это определяет высокую актуальность исследований по выявлению мутантов ВГВ, изучению их серологических и генетических свойств, оценке потенциала вакцин, созданию диагностикумов, позволяющих проводить дифференцированный скрининг мутантных форм вируса.
ВГВ является чрезвычайно вариабельным, что выражается в существовании его различных генотипов и серотипов [19]. В России наиболее широко распространены генотип D и серотип ay (до 95% на отдельных территориях) [16]. Ранее нами был установлен факт циркуляции на территории Московского региона мутантных штаммов ВГВ, экспрессирующих HBsAg разных серотипов (ay и ad) с заменами G145R и S143L [3].
Мутант ВГВ G145R, открытый в 1991 году W.F. Carman с соавт., характеризуется выраженной серологической модификацией детерминанты малого поверхностного S-белка [6]. Эта детерминанта представляет собой совокупность кон-
формационных эпитопов, образованных гидрофильной двухпетельной структурой, сформированной и поддерживаемой дисульфидными связями между парами цистеинов, находящимися в 124-й и 137-й, а также в 139-й и 147-й позициях Б-белка. Мутант 0145Я, затрагивающий позицию 145 во второй петле Б-белка, - наиболее типичный и стабильный мутант ВГВ диагностического и вакцинального «ускользания» [6, 16, 19]. Другая широко распространенная серологически значимая мутация - Б1431. - также затрагивает вторую петлю Б-белка, но глубина серологических изменений, вызываемых ею, относительно незначительна [6, 13, 14].
Данные, представленные в литературе, указывают на возрастающее накопление HBsAg-мутантов у вакцинированных детей [7, 11]. Эта информация вызвала серьезную обеспокоенность относительно политики вакцинации против ГВ, которая проводится в настоящее время. Подразделение ВОЗ, занимающееся вакцинопрофилактикой вирусных гепатитов, решило пересмотреть свои стратегические планы с учетом возрастающей проблемы распространенности мутантов, «ускользающих» от вакцинации, а также рекомендовать создание независимой глобальной сети для мониторинга таких мутантных форм [9, 22].
В современных вакцинах против ГВ используется рекомбинантный HBsAg разных серологических субтипов ^ или ау). Кроме того, в некоторых вакцинах кроме рекомбинантного HBsAg присутствуют антигены к другим патогенам (поливалентные вакцины). Ранее считалось, что применение любых из вышеперечисленных видов вакцин обеспечивает универсальную защиту от ВГВ различных серотипов [20]. Однако в последнее время появляются данные, ставящие под сомнение эту точку зрения [4, 21]. Так, использование вакцин без учета се-ротипа ВГВ, распространенного на данной территории, может привести к недостаточной эффективности иммунизации - снижению порога инфицирования и увеличению случаев заражения ВГВ среди вакцинированного населения. Вместе с тем нам не удалось обнаружить в литературе данных о влиянии серотипа рекомбинантного HBsAg и моно/по-ливалентности вакцины на способность индуцировать антитела к мутантам ВГВ 0145Я и Б1431..
Цель работы - оценить способность различных типов вакцин против ГВ индуцировать выработку антител, способных реагировать с мутантны-ми HBsAg 0145Я и Б1431_.
Материалы и методы
Способность анти-HBsAg-антител взаимодействовать с разными вариантами HBsAg оценивали при помощи оригинальной методики - модификации теста нейтрализации, в ходе которого происходит конкуренция различных мутантных вариантов HBsAg за связывание со специфическими антителами [1]. Постановку теста проводили с исполь-
зованием коммерческого набора реагентов, в состав которого входят 96-луночный планшет с им-мобилизированным и рекомбинантным HBsAg субтипов ау и а^ а также конъюгат - нативный HBsAg «дикого» типа, связанный с пероксидазой хрена. В ходе постановки теста каждый образец сыворотки, содержащий анти-HBsAg, тестировали в нескольких лунках, в одну из которых добавляли только анализируемый образец, в другие - образец и различные варианты HBsAg. При наличии в сыворотке антител, способных связываться с вариантом HBsAg, антитела блокировались HBsAg и удалялись из лунок на стадии промывки. Это, в свою очередь, приводило к уменьшению количества конъ-югата на твердой фазе и, как следствие, к снижению значений оптической плотности (ОП) в лунках с HBsAg. По результатам тестирования рассчитывали индекс блокировки (ИБ). Величина ИБ прямо пропорциональна способности поствакцинальных антител связываться с той или иной разновидностью HBsAg. Для проведения сравнительного анализа и повышения чувствительности методики сыворотки, содержащие анти-HBsAg, анализировали в оптимальных разведениях. Оптимальным считали разведение, при котором значение ОП сыворотки в использованной тест-системе для выявления анти-HBsAg находилось в зоне прямолинейной зависимости ОП образца от концентрации анти-HBsAg (ОП от 0,5 до 2,5).
В качестве источника различных вариантов HBsAg для нейтрализации анти-HBs использовали:
• Сыворотки крови хронических носителей мутантных штаммов ВГВ с мутацией Б1431. (сыворотки 283, 2323).
• Сыворотки крови хронических носителей мутантных штаммов ВГВ с мутацией 0145Я (сыворотки 111, 2043, 1537).
• Сыворотки крови хронических носителей ВГВ «дикого» типа (сыворотки 2505, 2511, 6492).
Характеристика изолятов мутантных штаммов ВГВ, использованных в работе, представлена в таблице 1.
Объектом тестирования стали образцы крови лиц, привитых следующими препаратами: моновакциной с рекомбинантным HBsAg серотипа ad Энджерикс (13 человек); моновакциной с рекомбинантным HBsAg серотипа ау производства ком-
пании «Комбиотех» (3 человека); поливакциной Твинрикс, в состав которой входят рекомбинант-ный HBsAg серотипа ad и антиген вируса гепатита А (8 человек).
Дополнительное тестирование подтвердило отсутствие в использованных образцах каких-либо других серологических маркеров ВГВ, кроме антител к HBsAg, в концентрации свыше 100 МЕ/мл.
Результаты и обсуждение
Как следует из данных, представленных на рисунке 1, у всех обследованных нами людей, привитых против гепатита В разными вакцинами (Энджерикс, Твинрикс и производства «Комбиотех») - вне зависимости от серологического типа рекомбинантного HBsAg, а также моно- или поливалентности вакцины, - обнаруживается сходный профиль значений ИБ поствакцинальных анти-HBsAg, свидетельствующий о практически полном отсутствии антител, способных связываться с мутантной формой HBsAg 0145Я (изоляты 111, 2043 и 1537). В то же время проведенный анализ не позволил выявить статистически значимых различий в активности поствакцинальных анти-HBs к HBsAg с заменой Б1431. (изоляты 283 и 2323) и HBsAg «дикого» типа (изоляты 2505, 2511/6492).
Мутация 0145Я приводит к значительным кон-формационным модификациям HBsAg. Это сопровождается не только выраженным изменением антигенных свойств «универсальной» детерминанты, но и глубокими биологическим различиями с вирусом «дикого» типа. Так, согласно нашим и литературным данным, до 90% моноклональных антител, специфичных к «универсальной» детерминанте вируса «дикого» типа, не распознают HBsAg с заменой 0145Я [3, 12]. Иммунизация мышей натив-ным или рекомбинантным HBsAg 0145Я индуцирует выработку антител, не способных к перекрестному реагированию с HBsAg вируса «дикого» типа [18]. Антитела, используемые в составе диагностических тест-систем, особенно плохо связываются с HBsAg 0145Я, что приводит к значительному снижению способности диагностикумов выявлять вирус с этой мутацией [2]. Имеются данные, указывающие на способность мутанта 0145Я в ходе скрытой ВГВ-инфекции персистировать не только в гепатоцитах, но и в лейкоцитах периферической крови [8]. Значительные изменения антигенных
Таблица 1.
Характеристика изолятов мутантных штаммов ВГВ
Изолят Генотип Субтип Вариабельность S-гена*
111 D adw3 I110N, G145R, S174N
1537 D ayw2 N52S, Q101R, G145R
2043 D ayw2 F8L, Q101R, M133T, G145R, L162I, S193L, S207R
283 D2 ayw3 S143L
2323 D2 ayw3 S143L
Рисунок 1.
Профиль анти-HBsAg-антительной активности у привитых лиц
о ^
ю
Ü ^
CD Ч
1,0-| 0,80,60,40,2-
Engerix B (ad)
A
0,0
-0,2 -I
S143L
G145R
wt
Комбиотех (ау)
1,00,8 0,6 0,4 0,2' 0,0 -0,2
1,0-i
о а
о ^
ю
о ^
о ч
- 3
¡1
Twinrix (ad)
B
S143L
S143L
G145R
wt
Примечание: Иммунизация: А - вакциной Энджерикс, субтип ас1 («ГлаксоСмитКляйн», Бельгия); В - комбинированной вакциной против гепатит В, субтип аС, и гепатита А Твинрикс («ГлаксоСмитКляйн», Бельгия); С - рекомбинантной вакциной против гепатита В, субтип ау («Комбиотех», Россия). Сыворотки, содержащие поствакцинальные антитела, исследовались в оптимальных разведениях.
свойств HBsAg, вызванные мутацией 0145Я, резко снижают профилактический потенциал вакцинации, позволяя вирусу успешно распространяться [22]. Описаны случаи совместной циркуляции анти-HBs и мутантного 0145Я вируса ГВ у лиц, ранее вакцинированных против ГВ [15].
Это соответствует результатам, полученным в ходе данной работы, - практически полное отсутствие взаимодействия HBsAg 0145Я с поствакцинальными антителами, вне зависимости от вида использованной вакцины. Очевидно, что на фоне драматического снижения способности поствакцинальных антител взаимодействовать с HBsAg 0145Я практически нивелируются особенности антиген-антительного взаимодействия, обусловленные серологическим типом или моно/полива-лентностью вакцины. Полученные данные подтвердили глубинные различия между серологически значимыми мутациями 0145Я и Б1431-.
Ранее другие авторы исследовали способность плазматических и рекомбинантных вакцин против гепатита В индуцировать HBs-антитела, способные связываться с мутантом 0145Я [10]. Они исследовали реакцию с искусственными или ре-комбинантными пептидами, но не с нативными му-тантными вирусами. Тем не менее были получены
данные в отношении мутанта 0145Я, аналогичные нашим. При реакции с мутантом 0145Я ингибиру-ющая активность резко снижалась по сравнению с реакцией на «дикий» тип. Такие же значительные различия были обнаружены при замене субтипа антигена adw2 на а^. При этом лишь очень незначительные различия были получены при индукции анти-HBs-антител плазматической или реком-бинантной вакциной.
В нашем исследовании не было выявлено различий в индукции анти-HBs-антител вакцинами разной конструкции (поли- или моно-), а также разных субтипов (ау или ad). Ни в одном случае не были индуцированы антитела против мутанта 0145Я, но наличествовал ответ против мутанта Б1431_.
Таким образом, нами установлено, что реком-бинантные вакцины против гепатита В, независимо от использованного в них субтипа HBsAg, по-разному индуцируют антитела, направленные против HBsAg-мутантов, с модифицированным HBsAg в 143-й и 145-й позициях. Вакцины одинаково хорошо индуцируют выработку анти-HBs, взаимодействующих с мутацией Б1431. и «диким» типом, однако не способствуют синтезу антител против мутации 0145Я у вакцинированных лиц. Следовательно,
предложенный в данной работе подход может оказаться полезным инструментом для оценки профилактического потенциала существующих вакцин и подбора антигенов, перспективных для создания новых вакцин, способных индуцировать антитела
не только против вируса «дикого» типа, но и против мутантов ВГВ, поскольку позволяет четко охарактеризовать антительный ответ на наиболее значимые мутации вакцинального «ускользания». ш
Литература
Баженов А.И. Совершенствование методов иммунодетекции HBsAg-мутантов вируса гепатита В: Автореф. дис. ... к.м.н. - М., 2009. - 27 с.
Баженов А.И., Коноплева М.В., Фельдшерова А.А. и др. Оценка чувствительности коммерческих тест-систем для иммунодетекции HBsAg по их способности выявлять HBsAg-мутанты вируса гепатита В // ЖМЭИ. 2008. № 3. P. 48 - 53.
Баженов А.И., Коноплева М.В., Эльгорт Д.А. и др. Алгоритм серологического поиска и оценка распространенности серологически значимых HBsAg-мутаций у носителей вируса гепатита В // ЖМЭИ. 2007. № 6. С. 30 - 37.
Крымский М.А., Крымский М.Р, Буданов М.В., Борисова В.Н. Соответствие вакцин против гепатита В типу вируса, превалирующего на территории Российской Федерации // Биофармац. журн. 2010. №. 2 (5). С. 8 - 15.
Онищенко Г.Г. Актуальные проблемы профилактики инфекционных болезней на современном этапе // ЖМЭИ. 2010. № 4. С. 13 - 22. Carman W.F.: The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus // J. Viral. Hepat. 1997. V. 4 (Suppl. 1). P. 11 - 20. Chang M.H. Breakthrough HBV infection in vaccinated children in Taiwan: surveillance for HBV mutants // Antivir. Ther 2010. V. 15 (3 Pt B). P 463 - 469. Datta S., Panigrahi R., Biswas A. et al. Genetic characterization of hepatitis B virus in peripheral blood leukocytes: evidence for selection and compartmentalization of viral variants with the immune escape G145R mutation // J. Virol. V. 83 (1). P. 9983 - 9992. Fitzsimons D., Francois G., Hall A. et al. Long-term efficacy of hepatitis B vaccine, booster policy, and impact of hepatitis B virus mutants // Vaccine. 2005. V. 23. P. 4158 - 4166. 10. Heijtink R.A., van Bergen Р., van Roosmalen M. et al. Anti-HBs after hepatitis B immunization with plasma-derived and recombinant DNA-derived vaccines: binding to mutant HBsAg // Vaccine. 2001. V. 19 (27). P. 3671 - 3680.
3.
4
6.
7.
9.
11. Hsu H.Y, Chang M.H., Ni YH., Chen H.L. Survey of hepatitis B surface variant infection in children 15 years after a nationwide vaccination programme in Taiwan // Gut. 2004. V. 53. P. 1499 - 1503.
12. Ijaz S., Ferns R.B., Tedder R.S. A «first loop» linear epitope accessible on native hepatitis B surface antigen that persists in the face of «second loop» immune escape // J. Gen. Virol. 2003. V. 84 (Pt 2). P. 269 - 275.
13. Jolivet-Reynaud C., Lesenechal M., Odonnell B. et al. Localization of hepatitis B surface antigen epitopes present on variants and specifically recognised by anti-hepatitis B surface antigen monoclonal antibodies // J. Med. Virol. 2010. V. 65 (2). P. 241 - 249.
14. Levicnik-Stezinar S. Hepatitis B surface antigen escape mutant in a first time blood donor potentially missed by a routine screening assay // Clin. Lab. 2004. V. 50 (1 - 2). P. 49 - 51.
15. Lu H.Y, Zeng Z., Xu X.Y et al. Mutations in surface and polymerase gene of chronic hepatitis B patients with coexisting HBsAg and anti-HBs // World J. Gastroenterol. 2006. V. 12 (26). P. 4219 - 4223.
16. Netesova I.G., Swenson P.D., Osipova L.P. et al. Determination of HBsAg subtypes in Western Siberian part of Russia // J. Med.Virol. 2003. V. 71 (2). P. 183 - 187.
17. Pumpens P., Grensa E., Nassal M. Molecular epidemiology and immunology of hepatitis B virus infection - an update // Intervirology. 2002. V. 45. P. 218 - 232.
18. Roohi A., Yazdani Y, Khoshnoodi J. et al. Differential reactivity of mouse monoclonal anti-HBs antibodies with recombinant mutant HBs antigens // World J. Gastroenterol. 2006. V. 12 (33). P. 5368 - 5374.
19. Weber B. Genetic variability of the S gene of hepatitis B virus: clinical and diagnostic impact // J. Clin. Virol. 2005. V. 32. P. 102 - 112.
20. Zanetti A.R., Tanzi E., Romano L. et al. Kinetics of antibody response to hepatitis B virus determinants and to recombinant vaccines in Italy // Journal of Medical Virology. 1990. V. 32. P. 219 - 224.
21. Zhang P., Yu M.W., Venable R. et al. Neutralization epitope responsible for the hepatitis B virus subtype-specific protection in chimpanzees // Proc. Natl. Acad. Sci. 2006. V. 103 (24). P. 9214 - 9219.
22. Zuckerman A.J. Effect of hepatitis B virus mutants on efficacy of vaccination // Lancet. 2000. V. 355 P. 1382 - 1384.
короткой строкой
Дорожная карта по предупреждению и борьбе с лекарственно-устойчивым туберкулезом. Комплексный план действий по профилактике и борьбе с туберкулезом с множественной и широкой лекарственной устойчивостью в Европейском регионе ВОЗ на 2011 - 2015 годы
(Аннотация книги)
В публикации представлен поэтапный план - дорожная карта - наращивания и объединения усилий в решении вызывающей растущую тревогу проблемы лекарственно-устойчивого туберкулеза в Европейском регионе ВОЗ. Направленный на профилактику и борьбу с туберкулезом с множественной и широкой лекарственной устойчивостью (М/ШЛУ-ТБ) в Регионе, Комплексный план действий включает шесть междисциплинарных стратегических направлений и семь областей деятельности. Реализация данного плана, составленного в соответствии с Глобальным планом «Остановить ТБ», позволит спасти 120 тыс. жизней и сэкономить миллиарды долларов. Дорожная карта включает схему мониторинга, оценки, анализа затрат и выгод от их реализации, а также краткие обзоры ситуации в 15 странах Региона с высоким уровнем МЛУ-ТБ.
Публикация предназначена в первую очередь руководителям программ борьбы с туберкулезом в странах Региона, в том числе на уровне министерств здравоохранения и других государственных органов, отвечающих за здравоохранение в местах лишения свободы, финансирование здравоохранения, санитарное просвещение и специалистам социальных служб. Она также должна содействовать более активному вовлечению в борьбу с туберкулезом гражданского общества, уязвимых в отношении туберкулеза групп населения, профессиональных ассоциаций (национальных и международных), партнеров и доноров и всех других заинтересованных структур.
Источник: http://www.euro.who.int/
