Научная статья на тему 'Стандартизация листьев ольхи серой и листьев ольхи черной'

Стандартизация листьев ольхи серой и листьев ольхи черной Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

CC BY
712
155
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ОЛЬХА СЕРАЯ / ОЛЬХА ЧЕРНАЯ / СТАНДАРТИЗАЦИЯ

Аннотация научной статьи по промышленным биотехнологиям, автор научной работы — Мушкина О. В.

В статье представлены результаты качественного и количественного анализа новых видов лекарственного растительного сырья листьев ольхи серой и листьев ольхи чёрной. Установлены критерии подлинности и доброкачественности, которые рекомендуется использовать при стандартизации данного вида сырья: потеря в массе при высушивании для обоих видов сырья не более 14%; содержание общей золы для листьев ольхи чёрной не более 5%; для листьев ольхи серой не более 6%; содержание золы, нерастворимой в 10% НСl для листьев ольхи чёрной и листьев ольхи серой не более 1%; содержание дубильных веществ, определённых комплексонометрическим методом, не менее 2,5% для листьев ольхи черной и не менее 0,5% для листьев ольхи серой.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по промышленным биотехнологиям , автор научной работы — Мушкина О. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Стандартизация листьев ольхи серой и листьев ольхи черной»

СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛИСТЬЕВ ОЛЬХИ СЕРОЙ И ЛИСТЬЕВ

ОЛЬХИ ЧЕРНОЙ

МУШКИНА О.В.

УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский

университет» кафедра фармакогнощии и ботаники с курсом ФПК и ПК

Резюме. В статье представлены результаты качественного и количественного анализа новых видов лекарственного растительного сырья -листьев ольхи серой и листьев ольхи чёрной. Установлены критерии подлинности и доброкачественности. которые рекомендуется использовать при стандартизации данного вида сырья: потеря в массе при высушивании для обоих видов сырья не более 14%; содержание общей золы для листьев ольхи чёрной - не более 5%; для листьев ольхи серой - не более 6%; содержание золы. нерастворимой в 10% НС1 для листьев ольхи чёрной и листьев ольхи серой - не более 1%; содержание дубильных веществ. определённых комплексонометрическим методом. не менее 2.5% для листьев ольхи черной и не менее 0.5% для листьев ольхи серой.

Ключевые слова: ольха серая. ольха черная. стандартизация.

Abstract. The results of the qualitative and quantitative analysis of the new types of the crude drug - the leafs of Alni glutinosae and Alni incanae is given in this article. The criterion of the identity and high quality were determined. They are recommended to be used at standardization of this type of the crude drug: loss in mass during drying for both types of the crude drug no more than 14%. the content of the general ashes for Alni incanae leafs - no more than 5%. for Alni glutinosae leafs

- no more than 6%. the content of the ashes no soluble in 10% HCI for Alni glutinosae and Alni incanae leafs - no more than 1%. the content of the tannins defined by chelatometric method no less than 2.5% for Alni incanae leafs and no less than 0.5% for Alni glutinosae leafs.

Адрес для корреспонденции: Республика

Беларусь, 210023, г. Витебск, пр. Фрунзе,27, Витебский государственный медицинский университет, кафедра фармакогнозии и ботаники. - Мушкина О.В.

Листья ольхи применяются в народной медицине для лечения различных патологий [1, 2, 3]. Из литературных данных [3, 4] и проведенных нами исследований [5] известно, что в листьях ольхи содержатся различные группы биологически активных веществ: дубильные вещества (галловая, эллаговая кислоты), флавоноиды (гиперозид, кверцитрин) и ряд фенольных кислот (кофейная, п-кумаровая, хлорогеновая и др.). Целью работы явилось изучение качественного состава листьев ольхи, количественного содержания дубильных веществ в них и числовых показателей доброкачественности сырья.

Для стандартизации и контроля качества нового вида цельного лекарственного растительного сырья использовалась номенклатура числовых показателей, принятая в Государственной Фармакопее Республики Беларусь (издание 1, 2007г.) на официнальные виды лекарственного растительного сырья. К ним относятся: потеря в массе при высушивании; содержание золы общей; содержание золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной; содержание органической и минеральной примеси. К специфичным показателям качества нового сырья относятся: для листьев ольхи чёрной - содержание суммы полифенольных соединений в пересчёте на эллаговую кислоту, для листьев ольхи серой - содержание гиперозида. При обосновании включаемых в проекты ФС на листья ольхи серой и листья ольхи чёрной норм этих показателей использованы результаты анализов проб от 5-ти опытных партий.

Изучение химического состава и разработку методов контроля качества листьев ольхи чёрной и листьев ольхи серой проводили с помощью тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также спектральных и титрометрических методов анализа.

Известно около 100 различных методов количественного определения ДВ [6], которые можно разделить на следующие основные группы:

1. Гравиметрические или весовые - основаны на количественном осаждении ДВ желатином, ионами тяжелых металлов или адсорбцией кожным (гольевым) порошком.

Для технических целей во всем мире стандартным является гравиметрический метод с применением гольевого порошка - весовой единый метод (ВЕМ).

Водный экстракт ДВ делят на две равные части. Одну часть экстракта выпаривают и высушивают до постоянной массы. Другую часть экстракта обрабатывают кожным порошком и фильтруют. ДВ адсорбируются на кожном порошке и остаются на фильтре. Фильтрат и промывные воды выпаривают и высушивают до постоянной массы. Содержание ДВ рассчитывают по разнице в массе сухих остатков.

Для ВЕМ характерны громоздкость метода, непрочность связи между гольевым порошком и дубильными веществами (как правило, получаются завышенные результаты, так как частично осаждаются и другие соединения -фенольные кислоты, простые фенолы, флавоноиды, антоцианы) [7].

2. Титриметрическиеметоды. К ним относятся:

а) Желатиновый метод - основан на способности ДВ образовывать нерастворимые комплексы с белками. Водные извлечения из сырья титруют 1% раствором желатина, в точке эквивалентности комплексы желатинотаннаты растворяются в избытке реактива. Титр устанавливают по чистому таннину. Точку эквивалентности определяют путем отбора наименьшего объема титрованного раствора, вызывающего полное осаждение ДВ.

Метод более точный, т.к. позволяет определить количество истинных ДВ. Недостатки: длительность определения и трудность установления точки эквивалентности.

б) Перманганатометрический метод (метод Левенталя в модификации А.П. Курсанова). Это метод, включённый в ГФ Х1 издания, основан на легкой окисляемости ДВ перманганатом калия в кислой среде в присутствии индикатора и катализатора - индигосульфокислоты, которая в точке эквивалентности переходит в изатин, и цвет раствора меняется от синего до золотисто-желтого. На точность результатов влияют недостаточная специфичность, так как перманганат калия окисляет и другие природные соединения, нечёткий переход окраски растворов при титровании, степень разведения титруемых растворов и т.д.

3. Физико-химические методы.

а) Фотоэлектроколориметрические - основаны на способности ДВ образовывать окрашенные соединения с солями трехвалентного железа, фосфорно-вольфрамовой кислотой, реактивом Фолина-Дениса и др.

б) Хроматоспектрофотометрические и нефелометрические методы

Использованный нами комплексонометрический метод определения

дубильных веществ в ольхе клейкой и серой основан на способности этих веществ осаждаться солями тяжелых металлов; для этой цели используется аммиачный раствор цинка. Выделившийся осадок (комплекс цинк-дубильные вещества) центрифугируют, затем обрабатывают кислотой и титруют катионы цинка раствором трилона Б в присутствии индикатора ксиленового оранжевого [8].

ЦЕЛЬ. Разработка критериев стандартизации нового вида лекарственного растительного сырья - листьев ольхи серой и листьев ольхи черной.

Методы

В исследованиях использовали высушенные листья ольхи серой и ольхи чёрной. Сухое сырье получали согласно правилам сбора и сушки лекарственных растений [9]. Лекарственное сырье во избежание разрушения лекарственных веществ и для удаления излишней влаги высушивали сразу после сбора наиболее распространенным методом - воздушной сушкой, основанной на свободном доступе воздуха к сырью, разложенному в затемненном месте.

Для установления подлинности листьев ольхи чёрной и листьев ольхи серой использовались тесты, основанные на методике ТСХ.

Для анализа получали водно-спиртовые извлечения из листьев ольхи черной и листьев ольхи серой. Для этого к 0,5 г измельчённого (до размера

частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм) сырья прибавляли 30 мл 60% (70%) соответственно раствора спирта этилового. Кипятили с обратным холодильником в течение 40 мин. Охлаждали. центрифугировали в течение 5 мин со скоростью 3000 об/мин и собирали надосадочную жидкость. В качестве неподвижной фазы использовали целлюлозные пластины фирмы «Merk». Хроматографирование проводили в системах растворителей: 2-пропанол - кислота муравьиная безводная - вода (2:5:5, об/об/об) для извлечений из листьев ольхи чёрной; 30% уксусная кислота

- для извлечений из листьев ольхи серой. Хроматографические камеры насыщали парами подвижных фаз в течение 30 минут. В качестве растворов сравнения использовали 0.1% растворы рабочих стандартных образцов эллаговой кислоты и гиперозида. На линию старта наносили по 5 мкл исследуемого раствора и по 10 мкл рабочих стандартных образцов гиперозида и эллаговой кислоты. затем высушивали пластинку на воздухе до полного улетучивания растворителей. Пластинки с нанесенными пробами помещали в камеры и хроматографировали восходящим способом. Длина пробега растворителей составляла 10 см. Пластинку высушивали при комнатной температуре до полного улетучивания растворителей и опрыскивали 2% спиртовым раствором алюминия хлорида.

Результаты

Ниже приведено трёхмерное изображение хроматограмм:

1

Рис.1 Хроматограмма для извлечения из листьев ольхи черной.

На рис. 1 видно, что фенольный комплекс листьев ольхи черной представлен 4 веществами, которые не заметны в видимом свете, в УФ свете вещества 1,4 имеют голубую окраску, 2,3 - желтую окраску. При сравнении со стандартами установлено: вещество 1 - эллаговая кислота, вещество 2 -гиперозид. Вещество 3 - неидентифицированный флавоноид, вещество 4 -неидентифицированная фенольная кислота.

Г.,

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

1 2

3

Рис. 2 Хроматограмма для извлечения из листьев ольхи серой.

На рис. 2 видно, что фенольный комплекс листьев ольхи серой представлен 3 веществами, которые не заметны в видимом свете, в УФ свете вещества 1 имеют желтую окраску, 2, 3 - голубую. При сравнении со стандартами установлено: вещество 1 - гиперозид, вещество 2, 3 -

неидентифицированные фенольные кислоты.

Потерю в массе при высушивании, содержание общей золы и золы, нерастворимой в растворе 10% кислоты хлористоводородной, определяли в соответствии с методикой ГФ РБ. Результаты определений представлены в таблицах 1, 2, 3, 4.

Таблица 1

Результаты определения потери в массе при высушивании (W ) листьев

ольхи чёрной

Характеристика проб сырья (место и время сбора) листья ольхи чёрной Дата анализа и переконтроля Содержание влаги (%) х + Ах

Витебская обл.. май 2006г. 06.06 06.07 7.28 + 0.04 7.27 + 0.06

Витебская обл.. июнь 2006г. 07.06 07.06 6.67 + 0.15 6.67 + 0.14

Витебская обл.. июль 2006г. 08.06 08.06 7.21 + 0.16 7.21 + 0.14

Брестская обл.. май 2006г. 06.06 06.06 9.50 + 0.11 9.50 + 0.21

Брестская обл.. июнь 2006г. 07.06 06.07 8.84 + 0.27 8.84 + 0.24

Таблица 2

Результаты определения потери в массе при высушивании (W) листьев

ольхи серой

Характеристика проб сырья (место и время сбора) листья ольхи серой Дата анализа и переконтроля Содержание влаги (%) х + Ах

Витебская обл.. май 2006г. 06.06 06.07 7.46 + 0.08 7.47 + 0.16

Витебская обл.. июнь 2006г. 07.06 07.06 8.10 + 0.14 8.11 + 0.12

Витебская обл.. июль 2006г. 08.06 08.06 8.42 + 0.12 8.42 + 0.19

Брестская обл.. май 2006г. 06.06 06.06 7.88 + 0.06 7.87 + 0.12

Брестская обл.. июнь 2006г. 07.06 06.07 7.71 + 0.11 7.71 + 0.15

Таблица 3

Содержание общей золы и золы, нерастворимой в 10% HCl в листьях

ольхи чёрной

Характеристика проб сырья (место и время сбора) листья ольхи черной Дата анализа и переконтроля Содержание золы общей (%) х + Ах Содержание золы, не раств. в 10% HCl (%) х + Ах

Витебская обл.. май 06.06 4.68 + 0.21 0.61 + 0.02

2006г. 06.07 4.68 + 0.22 0.61 + 0.02

Витебская обл.. июнь 07.06 4.36 + 0.14 0.54+ 0.01

2006г. 07.07 4.38 + 0.21 0.55 + 0.02

Витебская обл.. июль 08.06 4.42 + 0.06 0.52 + 0.01

2006г. 08.07 4.42 + 0.12 0.52 + 0.02

Брестская обл.. май 06.06 4.46 + 0.05 0.55 + 0.01

2006г. 06.07 4.46 + 0.08 0.55 + 0.03

Брестская обл.. июнь 07.06 4.29 + 0.03 0.52 + 0.01

2006г. 06.07 4.29 + 0.12 0.52 + 0.02

Таблица 4

Содержание общей золы и золы, нерастворимой в 10% HCl в листьях ____________________________ольхи серой_______________________________

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Характеристика проб сырья (место и время сбора) листья ольхи серой Дата анализа и переконтроля Содержание золы общей (%) х + Ах Содержание золы, не раств. в 10% HCl (%) х + Ах

Витебская обл.. май 06.06 5.49 + 0.02 0.32 + 0.02

2006г. 06.07 5.49 + 0.1 0.31 + 0.02

Витебская обл.. июнь 07.06 4.67 + 0.04 0.32 + 0.02

2006г. 07.07 4.67 + 0.11 0.33 + 0.02

Витебская обл.. июль 08.06 5.52 + 0.06 0.43 + 0.02

2006г. 08.07 5.52 + 0.08 0.43 + 0.03

Брестская обл.. май 06.06 5.14 + 0.03 0.32 + 0.01

2006г. 06.07 5.14 + 0.14 0.33 + 0.01

Брестская обл.. июнь 07.06 5.14 + 0.07 0.31 + 0.01

2006г. 06.07 5.13 + 0.17 0.32 + 0.01

Таким образом, для обоих видов сырья в ФС предложено регламентировать этот показатель нормой не более 14%, так как таковой является норма для листьев других видов лекарственных растений.

Из таблиц 1-4 видно, что содержание общей золы в листьях ольхи черной варьирует от 4,29 до 4,68%, в листьях ольхи серой от 4,67 до 5,49%. В проектах ФС рекомендуется установить норму по этому показателю для листьев ольхи черной не более 5%, для листьев ольхи серой не более 6%.

Содержание золы, нерастворимой в 10% НС1, в листьях ольхи чёрной находилось в пределах от 0,52 до 0,61%; в листьях ольхи серой от 0,31 до 0,43%. В проектах ФС рекомендуется норма этого показателя для листьев ольхи черной и листьев ольхи серой не более 1%.

Количественное определение дубильных веществ

Методика: 0,25 г (точная навеска) измельченного до размера частиц 2 мм сырья заливали 25 мл 30% этилового спирта и нагревали в течение 30 мин на кипящей водяной бане с последующим 15-минутным отстаиванием. Полученное извлечение фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу ёмкостью 100 мл. Затем проводили вторую экстракцию (сырьё вновь обрабатывали 25 мл этилового спирта той же концентрации аналогичным способом), экстракт фильтровали в туже мерную колбу и после охлаждения доводили 30% этиловым спиртом до метки.

Отбирали из мерной колбы 5 мл извлечения, помещали в пробирку для центрифугирования вместимостью 25 мл, прибавляли 10 мл реактива осаждения, смесь перемешивали стеклянной палочкой, палочку промывали 5 мл дистиллированной воды, которую прибавляли к основной смеси. Через 30 мин смесь центрифугировали в течение 10-15 мин с частотой вращения 5 тыс.об/мин, жидкость с осадка сливали, а осадок в пробирке взмучивали в 10

мл 0,25%-го раствора аммиака той же палочкой, которую затем промывали в 1 мл аммиака указанной концентрации, присоединяя его к центрифугируемой смеси. После повторного центрифугирования промывную жидкость сливали и отбрасывали. Полученный осадок в пробирке промывали несколько раз 30%-ым раствором этилового спирта до отрицательной реакции на ионы цинка (реакция с дитизоном). Затем отмытый осадок из пробирки количественно переносили в заранее прокаленный и просушенный до постоянной массы тигель. В сушильном шкафу выпаривали остатки этилового спирта, после чего тигель помещали в муфельную печь и сжигали при 500 градусах до постоянной массы. Образовавшуюся при сжигании комплексов окись цинка растворяли в 30%-ном растворе уксусной кислоты. Раствор количественно переносили в колбу вместимостью 250 мл с помощью 80 мл дистиллированной воды, жидкость нейтрализовали 25 мл 5%-го раствора гидрокарбоната натрия, прибавляли 0,5 мл раствора ксиленового оранжевого и титровали 0,01 М раствором трилона Б до изменения красно-фиолетовой окраски раствора в желтую. 1 мл 0,01 М раствора трилона Б соответствует 0,0013 г танина.

Подготовка к анализу: приготовление ацетатного буферного раствора pH 5,5, 5%-го раствора гидрокарбоната натрия, реактива осаждения, 0,01 М раствора трилона Б, 0,01 М раствора цинка проводили в соответствии с ГОСТ 4565-79 [8].

Установка титра 0,01 М раствора трилона Б.

5 мл 0,01 М раствора цинка отмеривали микробюреткой в колбу вместимостью 150-250 мл, содержащую 100 мл дистиллированной воды, прибавляли 0,5 мл раствора ксиленового оранжевого и нейтрализовали по каплям 5%-ным раствором гидрокарбоната натрия до появления краснофиолетового окрашивания. Затем прибавляли 10 мл ацетатного буферного раствора и титровали из микробюретки вместимостью 5 мл 0,01 М раствора трилона Б до изменения красно-фиолетовой окраски раствора в желтую.

Поправочный коэффициент (К) вычисляли по формуле:

к =-------^---------

0,0006538 • V • 500 .

где т - масса навески цинка, г;

V - объем 0,01 М раствора трилона Б, израсходованный на титрование,

мл.

В результате проведенных испытаний был установлен титр трилона Б. который составил К=0.51073.

Обработка результатов

Массовую долю танина (X) в процентах в пересчете на абсолютно сухое сырьё вычисляли по формуле:

х _ V • К •000130•50-100-100

_ т • 2,5 • ^ 100 - Ж) .

где V - расход трилона Б. мл;

К - поправка к титру 0.01 М раствора трилона Б;

т - масса навески сырья, г;

W - влажность, %

Таблица 5

Количественное содержание дубильных веществ в листьях ольхи чёрной _____________________ и в листьях ольхи серой______________________________

Листья ольхи черной Содержание дубильных вв, %, х + Ах Листья ольхи серой Содержание дубильных вв, %, х + Ах

Витебская обл., май 2006г., 400г 3,67 + 0,07 Витебская обл., май 2006г., 400г 1,00 + 0,04

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Витебская обл., июнь 2006г., 700г 3,63 + 0,17 Витебская обл., июнь 2006г., 700г 1,06 + 0,04

Витебская обл., июль 2006г., 680г 2,97 + 0,06 Витебская обл., июль 2006г., 680г 0,84 + 0,04

Брестская обл., май 2006г., 380г 4,2 + 0,06 Брестская обл., май 2006г., 380г 1,19 + 0,05

Брестская обл., июнь 2006г., 540г 3,51 + 0,09 Брестская обл., июнь 2006г., 540г 1,13 + 0,06

Из таблицы 5 видно, что содержание дубильных веществ в листьях ольхи чёрной в 3 с лишним раза выше, содержания их в листьях ольхи серой. Следовательно, в качестве ЛРС, содержащего дубильные вещества, следует рекомендовать листья ольхи чёрной.

Заключение

Установлены критерии подлинности и доброкачественности, которые рекомендуется использовать при стандартизации нового вида лекарственного растительного сырья - листьев ольхи серой и листьев ольхи чёрной:

1) потеря в массе при высушивании для обоих видов сырья не более

14%

2) содержание общей золы для листьев ольхи чёрной - не более 5%; для листьев ольхи серой - не более 6%

3) содержание золы, нерастворимой в 10% НС1 для листьев ольхи чёрной и листьев ольхи серой - не более 1%

4) содержание дубильных веществ, определённых

комплексонометрическим методом, не менее 2,5% для листьев ольхи черной и не менее 0,5% для листьев ольхи серой.

Литература

1. Акопов, И.Э. Кровоостанавливающие растения / И.Э. Акопов. -Ташкент: Медицина УзСССР, 1977. - 268 с.

2. Носаль, М. А. Лекарственные растения и способы их применения в народе / М.А. Носаль, И.М. Носаль. - К., 1956. - 254 с.

3. Хворост. О.П. Химический состав. лекарственное и хозяйственное значение видов А1пш Mill.S.L. / О.П.Хворост. А.Г.Сербин. Н.Ф. Комиссаренко // Растительные ресурсы. - 1984. - № 3. - С. 320-322.

4. Биологически активные вещества растительного происхождения: в 3 т. / Б.Н. Головкин [ и др.]. - М.: Наука . 2002. - Т. 1 - 350 с.

5. Мушкина. О.В. Фитохимический анализ листьев ольхи // О.В.

Мушкина. Н.С. Гурина. И. Матлавска // Достижения фундаментальной и

клинической медицины и фармации: материалы 62 научн. сессии. Витебск. 2223 марта 2007 г. / Витебский мед. ун - т; редкол. А.П. Солодков - С. 78-81.

6. Химический анализ лекарственных растений / под ред. Н.И. Гринкевич. Л.Н. Сафронович. - М .. 1983. - 176 с.

7. Хворост. О.П. Сравнительная количественная оценка содержания дубильных веществ у А1пш glutinosa (L.) Gaertn. // О.П. Хворост // Растительные ресурсы. - 1986. - Т. 22. - Вып. 2 . - С . 258-261.

8. Лист сумаха. Лекарственное растительное сырьё: ГОСТ 4565-79. -Введён 01.07.1980. - Москва: Издательство стандартов. 1980. - 295 с.

9. Правила сбора и сушки лекарственнвх растений (сборник инструкций) / отв. ред. А.И. Шретер. - М.. 1985. - 328 с.

10. Коноплёва. М.М. Диагностические признаки двух видов ольхи /

М.М. Коноплёва.. С.А Гурин.. О.В. Мушкина // Вестник фармации. - 2006. - №

2. - С. 14 - 20.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.