Научная статья на тему 'Изменение содержания фенольных соединений в листьях ольхи черной под действием различных факторов'

Изменение содержания фенольных соединений в листьях ольхи черной под действием различных факторов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
232
38
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ОЛЬХА ЧЕРНАЯ / СТАБИЛЬНОСТЬ / ГИПЕРОЗИД / ЭЛЛАГОВАЯ КИСЛОТА / УСКОРЕННОЕ СТАРЕНИЕ

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Моисеев Дмитрий Владимирович

Изучены количественные изменения содержания эллаговой кислоты и гиперозида в листьях ольхи черной при различных условиях хранения. Представлены данные об изменении содержания биологически активных веществ в измельченном (2000 мкм) и цельном растительном сырье, хранившемся в интервале температур от 20 до 60 °С и влажности сырья от 9 до 25%. Образцы анализировались методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) через 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24 и 36 месяцев хранения. Результаты данного исследования указывают на то, что присутствующие вещества растительного происхождения стабильны в условиях хранения при комнатной температуре (20 °C) и низкой влажности сырья в течение 36 месяцев. Деструкция гиперозида усиливается с повышением температуры хранения и исходной влажности растительного сырья. Содержание эллаговой кислоты увеличивается в первый год хранения в несколько раз, а затем уменьшается. Данные о кинетике деструкции изученных активных компонентов и предлагаемый метод исследования могут использоваться в фитофармацевтической промышленности с целью получения эффективных и стабильных лекарственных средств на основе растений.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Моисеев Дмитрий Владимирович

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Изменение содержания фенольных соединений в листьях ольхи черной под действием различных факторов»

DOI: 10.14258/jcprm.201503723

УДК 615.32/.31

ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В ЛИСТЬЯХ ОЛЬХИ ЧЕРНОЙ ПОД ДЕЙСТВИЕМ РАЗЛИЧНЫХ ФАКТОРОВ

© Д.В. Моисеев

Витебский государственный медицинский университет, пр. Фрунзе, 27, Витебск, 210000 (Республика Беларусь), e-mail: ussr80@yandex.ru

Изучены количественные изменения содержания эллаговой кислоты и гиперозида в листьях ольхи черной при различных условиях хранения. Представлены данные об изменении содержания биологически активных веществ в измельченном (2000 мкм) и цельном растительном сырье, хранившемся в интервале температур от 20 до 60 °С и влажности сырья от 9 до 25%. Образцы анализировались методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) через 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24 и 36 месяцев хранения. Результаты данного исследования указывают на то, что присутствующие вещества растительного происхождения стабильны в условиях хранения при комнатной температуре (20 °C) и низкой влажности сырья в течение 36 месяцев. Деструкция гиперозида усиливается с повышением температуры хранения и исходной влажности растительного сырья. Содержание эллаговой кислоты увеличивается в первый год хранения в несколько раз, а затем уменьшается. Данные о кинетике деструкции изученных активных компонентов и предлагаемый метод исследования могут использоваться в фитофармацевтической промышленности с целью получения эффективных и стабильных лекарственных средств на основе растений.

Ключевые слова: ольха черная, стабильность, гиперозид, эллаговая кислота, ускоренное старение.

В связи с устойчивым спросом в аптеках на фитопрепараты возрастает необходимость поиска новых источников биологически активных веществ и внедрения в практику отечественного здравоохранения новых видов лекарственного растительного сырья (ЛРС) и продуктов их переработки. Одним из новых видов ЛРС, вызывающим интерес своей фармакологической активностью и химическим составом, являются листья ольхи черной (Alnus glutinosa (L.) Gaertn., сем. Betulaceae). В Государственную фармакопею Республики Беларусь (ГФ РБ) они внесены как лекарственное растительное сырье, обладающее противовоспалительной и антиоксидантной активностью. Методом ВЭЖХ в листьях ольхи черной было подтверждено присутствие в значительных количествах следующих фенольных соединений: эллаговая кислота (до 2,1%) и гиперозид (до 2,3%), а также хлорогеновая и кофейная кислоты, кверцетин [1-3]. Согласно ГФ РБ листья ольхи черной стандартизируются по количественному содержанию эллаговой кислоты не менее 0,5%, гиперозида - не менее 0,3% (методом ВЭЖХ) и не менее 5% суммы фенольных соединений в пересчете на эллаговую кислоту (методом спектрофотометрии) [4].

При стандартизации лекарственного растительного сырья по количественному содержанию биологически активных веществ (БАВ) в фармакопейных статьях обычно используется подход, при котором указывается не «коридор» допустимых значений, как для большинства синтетических лекарственных средств, а только нижняя граница содержания. Поэтому содержание биологически активных веществ, а следовательно, и фармакологической активности для разных серий одного и того же наименования растительного сырья может различаться в несколько раз. Еще одним важным отличием лекарственного растительного сырья от синтетических лекарственных средств является то, что при хранении деструкция биологически активных веществ (эфирные масла, алкалоиды), по которым проводится стандартизация, в течение срока

Введение

Моисеев Дмитрий Владимирович - заведующий кафедрой стандартизации лекарственных средств, кандидат фармацевтическийх наук, доцент, e-mail: ussr80@yandex.ru

годности может достигать 50%. Однако в руководящих документах Комитета по лекарственным растениям Европейского медицинского агентства

(EMEA/HPMC) считается приемлемым отклонение в количественном содержании вещества, по которому проводится стандартизация, (аналитический маркер) в ±10% от начальной величины в течение предполагаемого срока годности [5]. Поэтому первостепенную важность для увеличения сроков годности ЛРС приобретает упаковка, в максимальной степени обеспечивающая сохранность БАВ в растительном сырье при хранении.

Для оценки влияния внешних факторов на стабильность синтетических фармацевтических субстанций и выработки решений по упаковке в настоящее время широко используются стресс-тесты (кислотный и щелочной гидролиз, нагревание, окисление, действие катионов железа и меди, а также облучения) [6]. Для оценки стабильности синтетических лекарственных средств при хранении используются ускоренные испытания. Для стран Европейского региона согласно действующей редакции они проводятся при температуре 40±2 °С и влажности 70±5% в течение периода не менее 6 месяцев [6].

Методология проведения подобных испытаний и результаты оценки деструкции активных веществ в лекарственном растительном сырье, в частности для листьев левзеи сафлоровидной и листьев брусники обыкновенной, были подробно рассмотрены в наших публикациях [7, 8], а методология исследований лекарственных средств на основе растительного сырья представлена в работах З.А. Темердашева с соавт. и H. Khalid et al. [9, 10].

Цель данной работы - оценка степени влияния деструктирующих факторов (температура и влажность) и измельченности на сохранность БАВ в листьях ольхи черной при длительном хранении в различных условиях в герметичной и негерметичной видах упаковки.

Экспериментальная часть

Исследования выполняли на жидкостном хроматографе фирмы Agilent 1100, в комплекте с системой подачи и дегазации на четыре растворителя G1311A, диодно-матричным детектором G1315B, термостатом колонок G1316A, устройством для автоматического ввода образцов (автосэмплер) G1313A. Сбор данных, обработку хроматограмм и спектров поглощения проводили с помощью программы Agilent ChemStation for LC 3D. Условия хроматографирования воспроизводили в соответствии с фармакопейной статьей [4]. Перед проведением анализов сырье измельчали до размера частиц 500 мкм.

При проведении исследований использовали стандартные образцы гиперозида (кверцетин-3р^-галактозида) и эллаговой кислоты (пр-во «Sigma-Aldrich»). Градуировочный график линеен при концентрациях эллаговой кислоты в диапазоне 0,24-250 мкг/мл (R=0,99995), гиперозида 0,49-500 мкг/мл (R=0,99995). Заготовку листьев ольхи черной проводили в окрестностях г. Витебска (Республика Беларусь) в начале июня в соответствии с рекомендациями GACP (Надлежащая практика сельскохозяйственного производства лекарственного растительного сырья) [11]. Исходное содержание эллаговой кислоты в листьях ольхи черной в пересчете на абсолютно сухое сырье составляло 0,9%, гиперозида - 0,7%. Листья высушивали (воздушно-сухое сырье) и измельчали до размера частиц 2000 мкм (порошкообразное) или использовали цельные. Сырье помещали в контейнеры (стеклянные флаконы), как допускающие газообмен с внешней средой, так и герметично укупоренные (резиновая пробка под обкатку). Для оценки влияния влажности на сохранность БАВ в герметично укупоренных контейнерах искусственным путем создавали влажность (потерю в массе при высушивании) для сырья около 9% (кратковременно подсушивали сырье при температуре 85 °С), около 12% (естественная влажность при воздушно-теневой сушке) и 25% (к навеске сырья с установленной влажностью добавляли рассчитанный объем воды до влажности сырья 25%, перемешивали на вортекс-шейкере и сразу укупоривали). Для оценки влияния температуры на ускорение процессов деструкции использовали метод «ускоренного старения». Суть данного метода заключается в том, что при увеличении температуры хранения на каждые 10 °С скорость химических реакций деструкции БАВ, происходящих в субстратах, увеличивается в 2-4 раза (правило Вант-Гоффа). Хранение с периодическим переконтролем осуществляли в естественных условиях (20±5 °С в течение трех лет), при 40 °С (270 сут.) и при 60 °С (68 сут.), что соответствовало трем годам при условии, что при увеличении температуры хранения на каждые 10 °С скорость химических реакций увеличивается в 2 раза.

Обсуждениерезультатов

На рисунке 1 представлены хроматограммы листьев ольхи черной (измельченное сырье) в начале хранения и после хранения при повышенной температуре и влажности. Наблюдается уменьшение площади пика гиперозида (пик 1) и, соответственно, увеличение площади пика кверцетина (пик 3), что можно объяснить гидролизом. Увеличение содержания эллаговой кислоты при хранении, по всей видимости, связано с гидролизом более сложных по химической структуре фенольных соединений до эллаговой кислоты.

Результаты изменения количественного содержания БАВ в цельном и измельченном сырье при различных условиях хранения представлены в таблицах 1 (для гиперозида) и 2 (для эллаговой кислоты).

Как следует из данных таблицы 1, полученные данные изменения количественного содержания гиперозида на всем протяжении хранения для всех температурных режимов хранения и влажности хорошо коррелируются между собой. Используя данные таблицы 1, можно установить порядок и скорость реакций деструкции гиперозида в процессе хранения, а также предварительно рассчитать сроки годности лекарственного растительного сырья. Методика расчетов приведена в наших публикациях [7, 8].

ЦАЫ е. Б1а=255,1в Г4[=&Н

тАи ; 200 150 - 100 зо 0- _А 2

в 10 1в го 25 30 35 43 <Ып

одел в. 5 ;■-** "й р«*"оп

тАи 200 150 100 50 0 2 J

1 1 1 1 1 ....... ...... .1 ' ..1 5 10 16 20 25 30 35 43 пмп

Рис. 1. Хроматограмма листьев ольхи черной до хранения (вверху) и после хранения в течение 36 месяцев при влажности 25% (внизу). Порядок выхода пиков веществ: 1 - гиперозид, 2 - эллаговая кислота, 3 - кверцетин

Таблица 1. Изменение содержания гиперозида в листьях ольхи черной в процессе хранения (по месяцам)

для измельченного и цельного сырья

Месяцы °С 0 3 6 9 12 18 24 36

изм цел изм цел изм цел изм цел изм цел изм цел изм цел изм цел

Открытое 20 100 100 99 98 96 97 95 97 95 97 94 95 93 94 92 93

сырье 40 100 100 98 99 95 95 94 95 94 95 92 93 89 92 87 91

60 100 100 97 97 93 95 92 94 91 94 86 92 84 90 83 89

Минимальная 20 100 100 98 99 97 99 97 98 97 98 97 97 95 96 94 95

влажность 40 100 100 98 98 96 97 95 97 94 96 92 95 90 95 88 92

(9%) 60 100 100 88 93 85 90 82 86 80 83 75 80 72 78 68 78

Средняя 20 100 100 99 99 98 98 96 97 96 96 95 95 93 94 91 93

влажность 40 100 100 97 98 96 98 94 96 94 95 93 93 89 91 86 90

(12%) 60 100 100 83 93 73 87 68 81 63 76 56 66 51 58 42 54

Высокая 20 100 100 60 50 59 44 55 40 49 34 41 22 37 13 27 9

влажность 40 100 100 60 70 51 53 43 41 37 33 30 31 13 18 12 13

(25%) 60 100 100 53 63 37 53 28 46 20 39 15 23 12 18 6,5 11

Примечания: изм - измельченное сырье, цел - цельное сырье.

Таблица 2. Изменение содержания эллаговой кислоты в листьях ольхи черной в процессе хранения (по месяцам) для измельченного и цельного сырья

Месяцы ос 0 3 6 9 12 18 24 36

изм цел изм цел изм цел изм цел изм цел изм цел изм цел изм цел

Открытое 20 100 100 113 106 123 114 139 149 170 173 139 132 124 117 121 110

сырье 40 100 100 216 233 235 288 211 266 185 223 137 179 128 134 116 107

60 100 100 124 139 161 295 198 273 222 265 246 233 226 232 205 221

Минимальная 20 100 100 119 100 129 114 144 145 168 171 132 98 122 95 115 93

влажность 40 100 100 210 211 234 200 182 165 165 121 150 95 147 95 134 90

(9%) 60 100 100 234 140 309 237 387 234 458 231 444 230 437 227 415 220

Средняя 20 100 100 130 151 165 175 173 179 188 188 184 216 178 179 170 173

влажность 40 100 100 227 232 257 220 209 217 163 208 159 196 148 174 145 169

(12%) 60 100 100 345 134 393 414 428 473 495 546 525 534 512 514 501 517

Высокая 20 100 100 346 448 379 549 386 573 403 586 469 565 411 507 374 443

влажность 40 100 100 399 419 444 563 467 594 482 626 536 602 506 577 465 513

(25%) 60 100 100 423 486 453 577 511 613 595 646 629 637 613 621 580 596

Примечания: изм - измельченное сырье, цел - цельное сырье.

Через три года хранения в естественных условиях, как в открытых, так и в герметичных упаковках, количественное содержание гиперозида колеблется в пределах ±10% от исходного содержания (рис. 2). По изменению количественного содержания гиперозида как маркерного компонента данное сырье соответствует рекомендациям Комитета по лекарственным растениям Европейского медицинского агенства [5] и требованиям фармакопейной статьи [4].

Интересно отметить, что содержание эллаговой кислоты в листьях ольхи черной вне зависимости от измельченности сырья, влажности и условий хранения в начальном периоде хранения во всех случаях увеличивается, а затем снижается (рис. 3). Данный факт, по всей видимости, можно объяснить следующим: в начальном периоде хранения процессы деструкции более сложных компонентов до эллаговой кислоты преобладают над собственной деструкцией эллаговой кислоты. Данный процесс заканчивается через 9-12 месяцев хранения, и в дальнейшем деструктируется только эллаговая кислота.

На примере изменения содержания эллаговой кислоты можно убедиться в несовершенстве рекомендаций ЕМЕА/НМРС к изменению содержания маркерных соединений в лекарственном растительном сырье при хранении [5]. При этом изученное сырье на всем протяжении срока годности соответствует требованиям фармакопейной статьи [4].

Рис. 2. Изменение содержания гиперозида для цельного и измельченного сырья при хранении в естественных условиях в герметичной и негерметичной упаковке (представлен коридор значений ±10% и нижний предел содержания)

Рис. 3. Изменение содержания эллаговой кислоты для цельного и измельченного сырья при хранении в естественных условия в герметичной и негерметичной упаковке (представлен коридор значений ±10% и нижний предел содержания)

Выводы

Установлено, что в зависимости от условий хранения содержание гиперозида в листьях ольхи черной может снижаться до 10 раз. Основным деструктирующим фактором является исходная влажность сырья (при хранении в герметичной упаковке). Данный процесс происходит примерно с одинаковой скоростью как в измельченном, так и в цельном сырье. Содержание эллаговой кислоты вне зависимости от температуры хранения и влажности увеличивается к 9-12 месяцам хранения (в аналогичные периоды в пересчете по правилу Вант-Гоффа для 40 и 60 °С), а затем снижается. Одним из основных факторов, влияющих на ее содержание, является исходная влажность сырья. Поэтому логично предположить, что накопление эллаговой кислоты происходит за счет гидролиза более сложных структурных соединений. Содержание эллаговой кислоты при влажности 25% и хранении при 40 и 60 °С увеличивается в 5-6 раз и составляет до 6% в пересчете на абсолютно сухое сырье. Следовательно, гидролиз при повышенной температуре можно рассматривать как перспективный путь для получения эллаговой кислоты из растительного сырья.

Учитывая то, что процессы и направления деструкции БАВ в листьях ольхи черной коррелируются для всех температур хранения, можно использовать метод «ускоренного старения» для данного сырья с целью обоснования выбора упаковочных материалов и подтверждения стабильности при хранении.

Список литературы

1. Моисеев Д.В., Шелюто В.Л., Бузук Г.Н. Идентификация флавоноидов в растениях методом ВЭЖХ // Химико-фармацевтический журнал. 2011. №1. С. 35-38.

2. Моисеев Д.В. Определение фенольных кислот в растениях методом ВЭЖХ // Химия растительного сырья. 2014. №3. С. 171-174.

3. Моисеев Д.В., Мушкина О.В. Влияние сроков заготовки и условий первичной переработки на содержание фенольных соединений в листьях ольхи серой и ольхи черной // Рецепт. 2012. №2. С. 39-46.

4. Государственная фармакопея Республики Беларусь. Т. 2: Контроль качества вспомогательных веществ и лекарственного растительного сырья / Центр экспертиз и испытания в здравоохранении / под общ. ред. А.А. Шерякова. Молодечно, 2008. 472 с.

5. Guideline on quality of herbal medicinal products/ traditional herbal medicinal products EMA/CPMP/QWP/2819/00 Rev. 2. London, September. 2011. 13 p.

6. Stability testing of new drug substances and products EMA/CPMP/ICH/2736/99 Q1A(R2). London, February. 2003. 18 p.

7. Моисеев Д.В. Новый метод определения сроков годности лекарственного растительного сырья (листьев Rhaponticum Carthamoides) на основе стресс-теста «ускоренное старение» // Рецепт. 2012. №2. С. 47-54.

8. Моисеев Д.В. Кинетика реакции деструкции арбутина в листьях брусники обыкновенной при хранении в естественных и стрессовых условиях // Курский научно-пракгический вестник «Человек и его здоровье». 2013. №2. С. 106-111.

9. Khalid H. Accelerated Stability and Chemical Kinetics of Ethanol Extracts of Fruit of Piper sarmentosum Using High Performance Liquid Chromatography // Iranian Journal of Pharmaceutical Research. 2011. Vol. 10, N3. Pp. 403-413.

10. Темердашев 3.A., Фролова H.A., Цюпко Т.Г., Чупрынина Д.А. Оценка стабильности фенольных соединений и флавоноидов в лекарственных растений в процессе их хранения // Химия растительного сырья. 2011. №4. С. 193-198.

11. Guideline on good agricultural and collection practice (GACP) for starting materials of herbal origin EMEA/HMPC/246816. London, February. 2006. 11 p.

Поступило в редакцию 3 мая 2015 г.

Moiseev D.V. CHANGES IN THE CONTENT OF PHENOLIC COMPOUNDS IN THE ALDER BLACK LEAVES UNDER THE INFLUENCE OF VARIOUS FACTORS

Vitebsk State Medical University, Frunze Avenue, 27, Vitebsk, 210023 (Republic of Belarus), e-mail: ussr80@yandex.ru

The quantitative content of ellagic acid and hyperoside in the leaves of Black alder under various conditions of storage were studied. Data about maintenance change of active components in powdered (2000 microns) and leaves of Black alder which were stored at interval of temperature from 20 to 60 °C and humidity of herbal substances from 9 to 25%. The samples were analyzed at 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24 and 36 months by high performance liquid chromatography (HPLC). Results of this study indicate that herbal substances are stable at room temperature (20 °C) and low humidity for 36 months. Destructions hyperoside are amplified with increase in temperature of storage and humidity of herbal substances. The maintenance of ellagic acid increases in the first year of storage in several times, and then decreases. The chemical kinetic data of the changes in the content analytical markers used to quantify the markers may be useful for phytopharmaceutical industry to produce efficacious and stable the herbal substances and the medicinal preparations.

Keywords: Black alder, stability, hyperoside, ellagic acid, accelerated tests.

References

1. Moiseev D.V., Sheliuto V.L., Buzuk G.N. Khimiko-farmatsevticheskii zhurnal, 2011, no. 1, pp. 35-38. (in Russ.).

2. Moiseev D.V. Khimiia rastitel'nogo syr'ia, 2014, no. 3, pp. 171-174. (in Russ.).

3. Moiseev D.V., Mushkina O.V. Retsept, 2012, no. 2, pp. 39-46. (in Russ.).

4. Gosudarstvennaia farmakopeia Respubliki Belarus'. T. 2. Kontrol' kachestva vspomogatel'nykh veshchestv i lekar-stvennogo rastitel'nogo syr'ia. [The State pharmacopoeia of the Republic of Belarus. Vol. 2. Quality control auxiliaries and le medicament vegetable raw materials.]. Ed. A.A. Sheriakov. Molodechno, 2008, 472 p. (in Russ.).

5. Guideline on quality of herbal medicinal products/ traditional herbal medicinal products EMA/CPMP/QWP/2819/00 Rev. 2. London, September. 2011. 13 p.

6. Stability testing of new drug substances and products EMA/CPMP/ICH/2736/99 Q1A(R2). London, February. 2003. 18 p.

7. Moiseev D.V. Retsept, 2012, no. 2, pp. 47-54. (in Russ.).

8. Moiseev D.V. Kurskii nauchno-prakticheskii vestnik «Chelovek i ego zdorov'e». [Kursk scientific-practical herald «Man and his health»]. 2013, no. 2, pp. 106-111. (in Russ.).

9. Khalid H. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 2011, vol. 10, no. 3, pp. 403-413.

10. Temerdashev Z.A., Frolova N.A., Tsiupko T.G., Chuprynina D.A. Khimiia rastitel'nogo syr'ia, 2011, no. 4, pp. 193-198. (in Russ.).

11. Guideline on good agricultural and collection practice (GACP) for starting materials of herbal origin EMEA/HMPC/246816. London, February. 2006. 11 p.

Received May 3, 2015 Revised May 28, 2015

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.