CC BY
115
УДК 615.32/.31
КИНЕТИКА РЕАКЦИИ ДЕСТРУКЦИИ АРБУТИНА В ЛИСТЬЯХ БРУСНИКИ ОБЫКНОВЕННОЙ ПРИ ХРАНЕНИИ В ЕСТЕСТВЕННЫХ И СТРЕССОВЫХ УСЛОВИЯХ
© Моисеев Д.В.
Кафедра стандартизации лекарственных средств с курсом факультета повышения квалификации и переподготовки кадров Витебского государственного медицинского университета, Витебск, Республика Беларусь
E-mail: ussr80@yandex.ru
В статье описаны методические подходы к определению сроков годности лекарственного растительного сырья (листьев брусники обыкновенной) методом «ускоренного старения». Приведены данные об изменении содержания арбутина в измельченном (2000 мкм) и цельном сырье при температуре от 20 до 60°С и влажности сырья от 9 до 25%. Для определения содержания использовали метод ВЭЖХ. Показано увеличение скорости деструкции арбутина в герметичной упаковке при увеличении температуры хранения и влажности сырья. Рассчитаны кинетические параметры протекающих реакций. Рассчитан теоретический срок годности цельных листьев брусники обыкновенной, хранящихся в негерметичной упаковке при температуре 22°С (2 года 3 месяца).
Ключевые слова: брусника обыкновенная, УассШыш vitis-idaea, арбутин, ВЭЖХ, ускоренное старение.
KINETICS OF DESTRUCTION REACTION OF ARBUTIN IN COWBERRY LEAVES STORED IN RELATIVE HUMIDITY AND IN ACCELERATED AGING TEST
Moiseev D. V.
Department of Standardization of Medicinal Preparations of Vitebsk State Medicinal University, Vitebsk, Republic of Belarus
The article describes the methodological approaches for determining the expiry date of herbal medicines (cowberry leaves) by the «accelerated aging» test. The data on content changes of arbutin in powdered (2000 microns) and whole plants stored at temperature from 20 to 60° C and raw material humidity from 9 to 25 % are given. To determine the content we used HPLC method. The increase in speed of destruction of arbutin in airtight packing and in the increase in temperature of storage and plants humidity is shown. The kinetic parameters of processing reactions are calculated. The theoretical expiry date of whole cowberry leaves, stored in untight packing is calculated at temperature 22°C (2 years 3 months).
Keywords: Cowberry, Vaccinium vitis-idaea, arbutin, HPLC, accelerated aging tests.
Фармакологические эффекты лекарственного растительного сырья связаны с содержащимися в них индивидуальными биологически активными веществами (БАВ). Одним из основных параметров, характеризующих качество растительного сырья, является количественное содержание БАВ, которое может изменяться в процессе хранения. Для новых видов растительного сырья стабильность при хранении в естественных условиях изучается в течение двух-трех лет. При изучении стабильности решаются следующие задачи: получение новых данных о качественных и количественных изменениях в составе лекарственного растительного средства, происходящих в процессе хранения, устанавливается влияние различных факторов (температура, влажность, степень из-мельченности) на параметры качества и на их основе вырабатываются рекомендации по условиям хранения и срокам годности. Большая часть ЛРС применяется, а соответственно и хранится в виде цельного или измельченного расфасованного растительного сырья или крупного порошка в фильтр-пакетах. Поэтому интерес представляет
исследование влияния герметичности упаковки (наличие или отсутствие газообмена с внешней средой) и сравнение процессов деструкции веществ в цельном и измельченном сырье. Кроме того, интересным представляется изучение возможности применения стресс-теста «метода ускоренного старения» для определения сроков годности растительного сырья.
Суть данного метода заключается в том, что при увеличении температуры хранения на каждые 10°С скорость химических реакций деструкции БАВ, происходящих в субстратах, увеличивается в 2-4 раза (правило Вант-Гоффа). Данный метод широко используется для оценки сроков годности синтетических лекарственных средств. В 2011 году H. Khalid и соавт. опубликована статья, посвященная исследованию стабильности при повышенной температуре и влажности, а также расчетам кинетических параметров реакций деструкции трех веществ (пеллиторин, сарментин и сарментозин) в спиртовом экстракте из плодов Piper sarmentosum [7]. Хранение экстрактов проводилось при комнатной температуре и темпера-
турах 30, 40 и 60°С при влажности атмосферы от 60 до 85% в течение 6 месяцев. В данной работе отмечена как научная новизна данного направления, так и особая практическая значимость для фармацевтической промышленности. Хочется отметить, что для лекарственного растительного сырья методология подобных исследований в отечественной и зарубежной литературе не описана.
Целью данной работы являлось экспериментальное обоснование возможности использования метода «стрессового тестирования» для прогнозирования сроков годности ЛРС при хранении в различных условиях. В качестве модельного объекта были выбраны листья брусники обыкновенной - вид лекарственного растительного сырья, включенный в Государственную фармакопею Республики Беларусь и Государственную фармакопею Российской Федерации. Основным биологически активным веществом в листьях брусники является арбутин (до 9%), обладающий бактерицидным и мочегонным действием. В ягодах брусники также содержится арбутин, но в меньшей концентрации. Кроме арбутина в листьях брусники содержатся метиларбутин; флавоноиды -кемпферол, кверцитрин, изокверцитрин, рутин, авикулярин, кемпферол-3'-рамнозид; фенолкар-боновые кислоты - хлорогеновая, кофейная, изохлорогеновая, ферруловая и эллаговая, а также микроэлементы [5, 6].
В данной статье представлены результаты исследований стабильности листьев брусники, проводившихся в течение трех лет.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования - листья брусники обыкновенной, заготовленные в Витебской и Минской областях Республики Беларусь и Псковской области (РФ) в 2009 году в соответствии с рекомендациями GACP (Надлежащая практика сельскохозяйственного производства лекарственного растительного сырья). Часть серии растительного сырья измельчали до размера крупного порошка (2000 мкм), другую часть оставляли целой. Сырье помещали в контейнеры как допускающие газообмен с внешней средой, так и герметично укупоренные. При этом в герметично укупоренных контейнерах создавали искусственную влажность (потерю в массе при высушивании) для сырья около 9% (кратковременно подсушивали сырье при температуре 85°С), около 12% (естественная влажность при воздушнотеневой сушке) и 25% (к навеске сырья с влажностью 12% добавляли рассчитанный объем воды до влажности 25%, перемешивали на вортекс-
шейкере и сразу укупоривали). Закладку на хранение осуществляли при температуре 20±2°С и в термостатах при 40°С и 60°С [2].
Для проведения исследований по влиянию условий хранения на деструкцию действующих веществ в листьях брусники разработана и вали-дирована высокоселективная и чувствительная методика определения методом ВЭЖХ [3]. Про-боподготовка проводилась согласно рекомендациям ГФ РБ [1], т.е. путем нагревания водного экстракта навески измельченного образца на водяной бане в течение 30 минут при температуре 85-90°С. Соотношения сырья и растворителя подбиралось экспериментально [3]. Определение количественного содержания арбутина проводили с периодичностью раз в 3 месяца в течение первого года хранения, через 6 месяцев в течение второго года и по истечении трех лет хранения при температуре 20±2°С. При повышенных температурах контроль количественного содержания арбутина проводили через такие же промежутки времени, как и для хранения в естественных условиях, пересчет делался в соответствии с правилом Вант-Гоффа, при минимальном увеличении скорости реакций (при повышении температуры на 10°С скорость увеличивается в 2 раза). То есть при 60°С одному году хранения соответствуют 23 дня, при 40°С - 92 дня.
Определение проводили на хроматографической колонке Zorbax StableBond С-18 250x4,6 мм, размер частиц 5 мкм. Подвижная фаза: ацетонитрил («Merck») и 0,01 M KH2PO4 (х.ч.) рН 3,0 (градиентный режим), скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин, объем инжектируемой пробы 10 мкл. Рабочая длина волны 280 нм выбрана на основании анализа спектра поглощения арбутина в области максимума его пика на хроматограмме с помощью фотодиодноматричного детектора и программы Agilent ChemStation for LC 3D. Разделение проводили при температуре колонки 30°С, давление в системе около 100 bar. В исследованиях использовали стандартный образец арбутина (Sigma-Aldrich, Lot 087К1179).
Вещество считали идентифицированным при совпадении времени удерживания и спектра поглощения со стандартом (рис. 1). В каждой серии анализов использовали рабочий раствор стандартного образца (РСО) с точно известной концентрацией примерно соответствующей ожидаемой концентрации арбутина в образцах. Раствор РСО хранился при -20°С (стабилен в течение 12 месяцев). Пересчет проводили по площади пика
РСО.
Порядок реакций определяли графическим методом [2, 4]. Для реакции нулевого порядка прямолинейная зависимость соблюдается для уравнения:
к^ = С0 - C (1);
для реакции первого порядка: kxt = Ь^С) (2);
для реакции второго порядка:
kxt = (1/С - 1/Ос) (3);
где к - константа скорости реакции,
1 - время от начала реакции (суток),
С0 - концентрация вещества в начале реакции, С - концентрация вещества в текущий момент времени.
Химическое взаимодействие между молекулами происходит при их столкновении, однако частота столкновений неизмеримо выше, чем число молекул, реагирующих в единицу времени. Для того, чтобы произошло химическое взаимодействие, необходимо, чтобы молекула обладала избыточной энергией по сравнению со средней энергией частиц, так называемой энергией активации (Еа). Данная энергия представляет собой повышенную поступательную, вращательную, колебательную, электронную энергию взаимодействующих частиц. Их активация происходит при столкновении между собой и со стенками реакционного сосуда, поглощении электромагнитного излучения. Константу скорости реакции можно выразить через долю частиц, энергия которых превышает энергию активации еЕа / ЯТ (закон Больцмана). Она рассчитывается по интегральной форме уравнения Аррениуса (4): к = АеЕа / ЯТ (4);
Энергию активации (Еа) и предэкпоненци-альный множитель (А) удобнее рассчитывать при помощи графика зависимости 1п к от 1/Т (уравнение 5), т.е. логарифмической форме уравнения Аррениуса:
1п к = 1п А - Еа /ЯТ (5); где к - константа скорости реакции,
Еа - энергия активации реакции (Дж/моль),
А - предэкпоненциальный множитель,
Т - температура (в градусах Кельвина),
Я - универсальная газовая постоянная (8,314 Дж/мольК).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исходное содержание арбутина для трех серий листьев брусники составляло 6,31% (Псковская область, РФ), 6,90% (Витебская область, РБ) и 7,13% (Минская область, РБ). Для удобства расчетов исходное содержание арбутина в сырье принимали за 100%, а убывание считали как отношение среднего содержания для опыта, выполненного в текущий момент времени, к среднему значению исходного содержания, выраженному в процентах. После обработки результатов оказалось, что деструкция арбутина протекает во всех трех сериях по одинаковому пути. В табл. 1 и 2 представлены усредненные для трех серий результаты по хранению измельченного и цельного сырья.
Таблица 1
Убывание количественного содержания арбутина в измельченном растительном сырье (Р=0,95; п=3)
Концентрация 20Е (%) через определенный период времени
Продолжительность хранения, суток 0 90 180 270 360 540 720 1080
20°С открытое 100 99,8 98,3 98,1 96,8 93,8 94,2 91,0
9% 100 98,7 97,2 98,4 95,9 96,1 94,2 91,2
13% 100 97,5 95,6 92,2 90,2 84,8 82,3 71,7
25% 100 76,0 76,4 67,8 39,3 18,5 5,2 3,9
Продолжительность хранения, суток 0 23 46 69 92 138 184 276
40°С открытое 100 97,9 95,6 96,4 93,0 91,5 90,0 86,3
9% 100 96,2 95,5 94,2 92,1 86,8 85,8 77,0
13% 100 97,7 94,3 91,8 88,0 84,4 77,3 64,1
25% 100 91,3 83,5 68,6 52,2 20,5 9,1 7,3
Продолжительность хранения, суток 0 6 11,5 17,5 23 34,5 46 69
60°С открытое 100 97,6 94,5 94,1 91,5 90,7 85,9 79,9
9% 100 96,0 95,5 92,7 90,9 85,7 83,8 74,9
13% 100 93,3 90,0 87,2 86,4 74,0 67,5 53,1
25% 100 96,5 92,0 88,4 78,8 63,4 55,6 37,8
Таблица 2
Убывание количественного содержания арбутина в цельном растительном сырье (Р=0,95; п=3)
Концентрация 20Е (%) через определенный пе риод времени
Продолжительность хранения, суток 0 90 180 270 360 540 720 1080
20°С открытое 100 99,6 97,2 96,4 95,3 93,5 91,6 88,8
9% 100 99,0 97,0 96,6 95,0 93,0 93,0 87,6
13% 100 98,8 98,2 96,6 94,5 92,3 90,3 89,7
25% 100 96,0 93,4 91,4 87,5 82,5 76,7 62,2
Продолжительность хранения, суток 0 23 46 69 92 138 184 276
40°С открытое 100 98,1 98,3 97,1 95,7 93,1 90,7 86,2
9% 100 99,7 98,2 97,2 94,6 92,0 88,5 84,8
13% 100 97,6 95,3 92,6 87,9 83,4 77,4 70,4
25% 100 96,8 93,2 85,3 78,2 67,6 57,4 43,1
Продолжительность хранения, суток 0 6 11,5 17,5 23 34,5 46 69
60°С открытое 100 98,4 96,0 94,8 94,6 88,5 84,1 81,0
9% 100 98,4 97,3 92,9 88,7 86,1 84,0 80,7
13% 100 97,9 91,7 87,3 86,7 75,3 66,8 57,8
25% 100 92,4 83,0 79,0 70,0 45,9 40,9 26,3
Таблица 3
Константы скоростей для реакций второго порядка (3)
Измельченное сырье Цельное сырье
открытое 9% 13% 25% открытое 9% 13% 25%
20°С 0,933х10"4 0,887х10"4 3,38х10-4 194х10-4 1,23х10-4 1,27х10-4 1,27х10-4 4,89х10-4
40°С 6,15х10"4 10,3х10"4 17,7х10-4 41,5х10-4 5,58х10-4 6,46х10-4 15,1х10-4 42,0х10-4
60°С 35,8х10"4 46,6х10-4 114х10-4 199х10-4 35,5х10-4 39,1х10-4 101х10-4 350х10-4
Таблица 4
Определенные в эксперименте коэффициенты уравнения (5)
И змельченное сырье Цельное сырье
открытое 9% 13% 25% открытое 9% 13% 25%
Энергия активации (Еа) 7,39х104 8,06х104 7,11х104 1,13х103 6,79х104 6,92х104 8,89х104 8,65х104
Предэкспоненциальный множитель (А) 1,393х109 2,34х1010 1,508х109 0,039 1,448х108 2,684х108 9,656х10П 1,254х1012
Коэффициент корреляции графика зависимости 1п к от 1/Т 0,9997 0,9902 0,995 0,004 0,9909 0,9955 0,999 0,999
Как видно из табл. 1 и 2, во всех случаях при повышении температуры содержание арбутина в исследуемых образцах уменьшилось. Наиболее полная сохранность арбутина обеспечивалась при хранении сырья в условиях, допускающих воз-
можность газообмена с внешней средой. Деструкция арбутина увеличивалась с повышением влажности сырья. В измельченном сырье арбутин сохранялся лучше.
Рис. 1. Хроматограммы: вверху - стандартного образца арбутина (концентрация 500 мкг/мл); внизу водного экстракта из листьев брусники.
При определении порядка реакции графическим способом оказалось, что наиболее высокие коэффициенты корреляции уравнений 1, 2 и 3 достигаются при подстановке концентраций арбутина в уравнения реакций второго порядка. Поэтому в дальнейших расчетах считали данные процессы относящимися к реакциям второго порядка.
Для прогнозирования сроков годности растительного сырья необходимо рассчитать такие параметры протекающих реакций, как энергия активации и предэкспоненциальный множитель (уравнение 5).
Зная порядок реакции, значения величин уравнения 5, можно рассчитывать сроки годности растительного сырья при хранении при различных температурах. Например, при хранении цельного сырья в негерметичной упаковке при температуре 22°С рассчитаем, через какой промежуток времени количественное содержание арбутина снизится на 10%.
По уравнению 5 находим константу скорости реакции при температуре 22°С (295 К):
1п к22С = 1п (1,448x108) - 6,79x104/8,314/295 = -8,894
к22С = 1,373x10-4
По уравнению (3) находим срок годности:
г = (1/0,9 - 1/1)/(1,373x10-4) = 810 суток или
2 года 3 месяца.
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Изучено влияние способа упаковки листьев брусники на сохранность арбутина в условиях длительного хранения при различных температурах. Рассчитаны основные кинетические параметры протекающих реакций деструкции арбутина (константа скорости, энергия активации и др.), происходящих при хранении сырья, как в негерметичной упаковке, так и в герметичной при различных исходных уровнях влажности. Установлено, что реакция деструкции арбутина как в измельченном, так и в цельном сырье относится к реакциям второго порядка. Предложены новые методические подходы к определению срока годности лекарственного растительного сырья на примере листьев брусники обыкновенной, в основе которых лежит стресс-тест «ускоренное старение».
2. Экспериментально доказано, что в упаковке, допускающей газообмен с внешней средой, при температуре 20°С и в измельченном, и в цельном сырье арбутин сохраняется в большей степени. Скорость реакции деструкции арбутина увеличивается как с увеличением температуры хранения, так и с увеличением влажности сырья. Теоретически рассчитан срок годности измельченных листьев брусники обыкновенной в негерметичной упаковке при температуре 22 °С (2 года
3 месяца).
Работа выполнена при поддержке Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований (грант Б11М-139 от 15.04.2011).
ЛИТЕРАТУРА 4
1. Государственная фармакопея Республики Беларусь. Контроль качества вспомогательных веществ 5
и лекарственного растительного сырья / под ред.
А.А. Шерякова. - Молодечно: «Победа», 2008. -
Т. 2. - 472 с.: ил. 6
2. Моисеев Д.В. Новый метод определения сроков
годности лекарственного растительного сырья (листьев Rhaponticum Carthamoides) на основе 7
стресс-теста «ускоренное старение» // Рецепт. -
2012. - № 2. - С. 47 - 54.
3. Моисеев Д.В. Определение арбутина в листьях брусники обыкновенной методом ВЭЖХ // Вестник фармации. - 2011. - № 1 (51). - С. 40 - 45.
Поленов Ю.В., Егорова Е.В. Кинетика химических реакций: учеб. пособие. - Иваново: Иван. гос. хим.-технол. ун-т, 2010. - 68 с.: ил.
Соколов С.Я. Фитотерапия и фитофармакология: Руководство для врачей. - М.: Медицинское информационное агентство, 2000. - 976 с.: ил. Фитотерапия с основами клинической фармакологии / под ред. В.Г. Кукеса. - М.: Медицина, 1999. - 192 с.: ил.
Khalid H. Accelerated Stability and Chemical Kinetics of Ethanol Extracts of Fruit of Piper sarmentosum Using High Performance Liquid Chromatography // Iranian Journal of Pharmaceutical Research. - 2011. -10 (3). - P. 403-413.
