CC BY
44
т.е. расстояний между центрами облаков соответствующих групп и радиуса облака - г, с использованием тех же значений, на основании которых производилось построение визуальной картины распределения групп в трёхмерной плоскости. При анализе межклассовых различий (таблица 5) следует отметить, что с высокой степенью достоверности показатели групп животных, получавших резвератрол с высокой степенью достоверности отличаются от группы с Ь-МАМЕ и перекрываются между собой и с группой интактных животных.
Таким образом, способ визуализации в трёхмерном пространстве позволяет более наглядно продемонстрировать взаимообусловленные и потенцирующие эндотелио- и кардиопротективные эффекты резвератрола.
6ЪУ, о
L-NAME
_ _ _ _____II iii »
Рис 1. Пространственное положение групп животных, с фармакологической коррекцией резвератролом экспериментальной модели дефицита оксида азота, при проведении функциональных проб
L-NAME+Резвератрол ОП Резвератрол
Интактные
Ось х - процентное отношение величины ЛЖД на 25-й секунде пережатия аорты по сравнению с 5-й; Ось у - коэффициент эндотелиальной дисфункции; Ось 2 - прирост ЛЖД в абсолютных значениях после реоксигенации (градуирована оттенками серого, градация цветов представлена внизу рисунка).
Таблица 5
Межклассовые расстояния между группами животных в зависимости от показателей функциональных проб групп животных, с фармакологической коррекцией _резвератролом экспериментальной модели дефицита оксида азота_
№ Группа I II III IV г
I Интактные • 15,1
II L-NAME гипертензия 71,3 • 10,6
III Острая проба с Резвератролом 12,5* 79,8 • 5,9
IV L-NAME + Резвератрол 9,2* 63,1 20,8* • 17,4
Примечание. 1)г - радиус облаков соответствующих групп 2) * -границы облаков взаимно перекрываются
Выводы:
1. Показателем эндотелиальной дисфункции в условиях нарушения обмена оксида азота в эксперименте является коэффициент эндотелиальной дисфункции
2. Резвератрол при хроническом введении предотвращает развитие эндотелиальной дисфункции при введении L-NAME.
3. Резвератрол улучшает показатели сократимости в ответ на нагрузку сопротивлением при пережатии аорты и при реоксигенации после 3-х минутной гипоксии, на модели L-NAME - индуцированного дефицита оксида азота, что свидетельствует о его кардиопротективном действии.
Список литературы
1. Галаган, М.Е. Гипотензивное действие оксида азота, продуцируемого из экзо-и эндогенных источников/ М.Е.Галаган, А.В.Широколова, А.Ф. Ванин// Вопр. мед. химии.-1991.-Т.37, № 1. -С. 67-70
2. Исследование кардиопротективного действия каптоприла в эксперименте с регистрацией транс-муральной компрессии в очаге ишемии/ М.В.Покровский, Д.Е.Скопин, Е.Б.Артюшкова и др.//Человек и лекарство: Тез.докл. IV Российк. Нац. Конгр. - М., 1997. - С. 102.
3. Меерсон, Ф.З. Метаболизм и функция кардиомиоцита. Руководство по кардиологии / Ф.З.Меерсон.-М., 1982. -С.112-141 .
4. Меерсон, Ф.З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца / Ф.З.Меерсон.- М.: Медицина, 1984. -272с.
5. Пашин, Е.Н. Кардиопротективное действие эмоксипина на модели гипоксия-реоксигенация / Е.Н.Пашин // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины и фармации: Матер, конф. - Курск, 1993 - С. 171
6. Пичугин, В.В. Биохимические и функциональные аспекты экспериментальной терапии расстройств кровоснабжения и биоэнергетики миокарда в острой стадии регионарной ишемии сердца: Автореф. дис. д-ра мед. наук./ В.В.Пичугин.- М., 1979. -25 с.
7. Применение дибунола для стимуляции репаративных процессов в сердечной мышце при инфаркте миокарда у крыс / В.В.Пичугин, J1.A. Конорев, В.Ю.Полумисков и др. // Фармакология и токсикология. -1989. - Т.52, №6. -С. 52-56.
8. Deng, L.Y. Effect of hypertension induced by nitric oxide synthase inhibition on structure and function of resistance arteries in the rat / L.Y.Deng, G.Thibault, E.L.Schiffrin // Clin. Exp. Hypertens. -1993. -Vol.15. -P.527-537.
9. Fremont L. Biological effects of resveratrol. Life Sciensis -2000, 66: 663-673.
10. Gehm BD, et all. Resveratrol, a polyphenols compound found in in grapes and wine, is an agonist for the estrogen receptor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997 Dec.9; 94:14138-14143.
11. Jager U, Nguyen-Duong H. Relaxant effect of trans-resveratrol on isolated porcine coronary arteries. Arzneimittelforschung / Drug Research. 1999; 49: 207-211.
12. J. F. Leikert;, T. R. Rathel;, P. Wohlfart, V. Cheynier, A. M. Vollmar, and V. M. Dirsch Red Wine Polyphenols Enhance Endothelial Nitric Oxide Synthase Expression and Subsequent Nitric Oxide Release From Endothelial Cells Circulation, September 24, 2002; 106(13): 1614 - 1617.
13. Pendurthi UR, et al. Resveratrol, a polyphenols compound found in wine, inhibits tissue factor expression in vascular cells: A possible mechanism for the cardiovascular benefits associated with moderate consumption of wine. Arterioscler. Throb. Vase. Biol. 1999 eb;19 (2):419-426.
14. Role of superoxide in angiotensin II-induced but not catecholamine-induced hypertension J.B.Laursen, S.Rajagopalan, Z.Galis et al. // Circulation.- 1997,-Vol. 95.-P. 588-593
15. T. Wallerath, G. Deckert, T. Ternes, H. Anderson, H. Li, K. Witte, and U. Forstermann Resveratrol, a Polyphenolic Phytoalexin Present in Red Wine, Enhances Expression and Activity of Endothelial Nitric Oxide Synthase Circulation, September 24, 2002; 106(13): 1652 - 1658.
УДК 665.3:547.979.8
СТАНДАРТИЗАЦИЯ КАРОТИНСОДЕРЖАЩИХ ПРЕПАРАТОВ «МАСЛО ОБЛЕПИХОВОЕ» И «АЕКОЛ»
1 ^ з
A.A. Зинченко , JI.B. Кричковска , В.Н. Бузов
!ГП «Научно-экспертный фармакопейный центр», НТУ "ХПИ" (г. Харьков), эООО "Сайбервижн" (г. Москва)
Изучен жирнокислотный состав образцов концентратов масла облепихового различных производителей и каротинсодержащего препарата «Аекол» по модифицированной методике, исключающей окисление ненасыщенных жирных кислот. Получен-
ные результаты позволили предложить новый критерий качества препарата, использование которого позволяет достаточно надежно выявлять фальсифицированные и некачественные препараты.
Препараты на основе каротина (концентрат масла облепихового, получаемого из плодов облепихи, и «Аекол» на основе микробиологического каротина), обладают противовоспалительным и репаративным действием и часто используются при лечении термических и химических ожогов, лучевых поражений кожи и слизистых оболочек, применяют для комплексной терапии язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки [1,2]. Относительно высокая стоимость этих препаратов, их широкий спрос и популярность применения лекарственных средств на основе природного растительного сырья спровоцировали появление в аптечной сети Украины, Российской Федерации и других стран СНГ некачественных и фальсифицированных препаратов. Поэтому разработка новых подходов для надежного выявления фальсифицированной продукции является актуальной задачей в сложившейся ситуации.
По действующим в Украине и РФ нормативно-аналитическим документам (НАД) подлинность каротинсодержащего облепихового масла в лекарственных средствах определяют двумя методами. Спектрофотометрическим методом устанавливают наличие каротиноидов и методом газовой хроматографии, с использованием насадочной колонки, определяют присутствие пальмитолеиновой кислоты, высокое содержание которой характерно для масла облепихи. Такой подход к идентификации препаратов на основе масла облепихи оказывается в настоящее время явно недостаточным, поскольку каро-тиноиды могут быть получены из другого сырья (например, микробиологически из моркови), а пальмитолеиновая кислота в концентрации до 3,5 % часто присутствует в других растительных маслах.
В значительных количествах (до 27%) пальмитолеиновая кислота присутствует в жирах животного происхождения [3]. На основании проведенных исследований явно фальсифицированных препаратов масла облепихового можно сделать заключение, что значительная часть этих препаратов представляют собой раствор микробиологически полученных каротиноидов в подсолнечном масле, возможно с добавками жира животного происхождения.
Для подтверждения такого предположения был взят препарат "Аекол" на основе микробиологического каротина с суммарным содержанием кароти-ноидов около 220 мг %. На хроматограмме метиловых эфиров жирных кислот этого образца (рис. 1) явно наблюдается пик метилового эфира пальмитолеиновой кислоты. Таким образом, препарат на основе микробиологического каротина формально полностью соответствует требованиям всем
сэ о
К
§ 5
а сэ
5 о
ы Ч О
а
СЭ
о
ы о
оэ о ЕС
к
Он
5
оэ
о «
5
03 о ЕС
ы
4
О
Рис. 1 Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот раствора каротиноидов полученных микробиологическим методом в подсолнечном масле.
Для выявления новых критериев подлинности препаратов на основе облепихового масла были исследованы образцы концентратов полученных из облепихи, выращенной в разных регионах выращенной - Бурятия, концентрат ОАО "Алтайвитамины" (г.Бийск, РФ) и концентрат полученный из облепихи Харьковской области (Украина). Все концентраты облепихового масла были получены путем экстракции сырья легко кипящим гексановым растворителем под торговым названием «Нефрас П1-65/71» с температурой кипения до 71 °С по ТУЗ8.1011228-90.
Прежде всего, дополнительно, было проведено изучение жирно-кислотного состава концентратов масла облепихового с использованием растворов метиловых эфиров для дальнейшего хроматографирования [4,5]. Хроматографирование проводили на хроматографе ОС-14В, оснащенном автоинжектором АОС-14 и интегратором С-Я7а, производства фирмы "ЗЫтаёги" (Япония) в двух вариантах условий приведенных в табл. 1. Первые условия были близки к условиям приведенным в действующих в Украине и РФ НАД на концентрат облепихового масла, а вторые - с использованием специализированной для разделения метиловых эфиров жирных кислот капиллярной колонки подобраны таким образом, чтобы обеспечить максимальное разделение метиловых эфиров жирных кислот [6,7]. В этих же условиях хроматографировали смесь стандартных образцов метиловых эфиров насыщенных жирных кислот Си - С20, олеиновой кислоты и метиловых эфиров жирных кислот подсолнечного масла. Условия хроматографирования исследуемых растворов метиловых эфиров жирных кислот концентрата масла облепихового и Аекола: Т = 190°С, сорбент- хроматон N А\¥, размер частиц 0,160 -0,200 мм, с нанесенной в количестве 9% неподвижной фазой полидиэтиленгликольсук-цинат, скорость газа-носителя (гелий)-35 мл/мин.
Типичные хроматограммы метиловых эфиров жирных кислот концентрата масла облепихового, полученные в обоих условиях показаны на рис. 3 и 4.
Как видно на хроматограмме, полученной в условиях 2, сразу за пиком метилового эфира олеиновой кислоты наблюдается дополнительный пик, превосходящий по величине пик метилового эфира олеиновой кислоты. На этой же хроматограмме и на хроматограмме полученной в условиях 1, между пиками метиловых эфиров пальмитоолеиновой и стеариновой кислот присутствует пик время удерживания, которого близко, но не совпадает со временем удерживания пика метилового эфира гептадекановой кислоты.
Исходя из положения пиков на хроматограмме, полученной в условиях 2, и сравнивая с хроматограммами стандартной смеси метиловых эфиров жирных кислот и метиловых эфиров подсолнечного масла, можно предположить, что пик, следующий за пиком метилового эфира олеиновой кислоты, принадлежит метиловому эфиру цис-вакценовой кислоты.
Пик, который расположен между пиками метиловых эфиров пальмитолеиновой кислоты и стеариновой кислоты принадлежит метиловому эфиру, редко встречающейся в таких количествах в растительных маслах, гексадекадиеновой кислоты.
I
\
1
Рнс. 3. Хроматограмме метиловых эфиров жирных кислот концентрата масла облепихового полученная в условиях 2. (капиллярная колонка)
I I I I I I I I 1 '
о.о г. о- л. о е. о а: о ю. о 12.0 14.0 16. о 18,0
Рис. 4. Хромятогрямма метиловых эфиров жирных кислот концентрата
масла облепихового полученная в условиях 1 (насадочная колонка)
Для подтверждения этого предположения, полученные по описанной выше методике метиловые эфиры жирных кислот растворяли в 2 мл н-ундекана и гидрировали при Т-120°С в присутствии катализатора - пироморфного никеля, полученного путем термического разложения 0,1 г формиата никеля при температуре 130-140 С в атмосфере водорода. Гидрирование проводили в той же установке, в которой получали метиловые эфиры (рис 2). Вместо инертного газа в капилляр, длина которого была увеличена до дна колбы, подавали со скоростью 10 мл/мин водород. Хроматограммы гидрированных метиловых эфиров жирных кислот показаны на рис. 5.
При сравнении хроматограмм до и после гидрирования видно, что метиловые эфиры пальмитолеиновой кислоты и гексадекадиеновой кислоты гидрируются до метилового эфира пальмитиновой кислоты, а метиловые эфиры олеиновой, вакценовой, лино-левой и линоленовой кислот гидрируются до стеариновой кислоты.
Рис.5. Хроматограммы метиловых эфиров жирных кислот масла облепихового полученные в процессе гидрирования
Таким образом было установлено, что пики расположенные за пиком метилового эфира стеариновой кислоты соответствуют метиловым эфирам ненасыщенных жирных кислот, а пик расположенный между пиками метиловых эфиров пальмитолеиновой и стеариновой кислот соответствует метиловому эфиру гексадекандиеновой кислоты.
Интересной особенностью концентрата облепихового масла является значительное преобладание вакценовой кислоты (двойная связь в 11 положении) над олеиновой кислотой (двойная связь в 9 положении). По-видимому, биосинтез ненасыщенных жирных кислот в облепихе в значительных количествах происходит не по преобладающей для большинства растений схеме А [8,9], а по схеме Б с предварительным преобладанием окислительных процессов образования двойных связей над процессами наращивания углеродной цепи. Данную особенность можно использовать для идентификации препаратов содержащих концентрат облепихового масла. В таблице приведены результаты определения состава жирных кислот в исследуемых образцах концентратах масла облепихового.
о. о г. о 4. о о. о е. о 1 о. о I г. о 1 о
Рис.7 Хроматограмма метиловых эфиров жирных кисло! качественного образца образца масла облепихового
Как видно из приведенных результатов, во всех исследованных образцах концентрата концентрация пальмитолеиновой кислоты превосходит концентрацию пальмитиновой кислоты, а концентрация вакценовой кислоты превосходит концентрацию олеиновой кислоты. Поэтому, для такого часто фальсифицируемого препарата как масло об-лепиховое, критерием подлинности может быть не только наличие пиков соответствующих пальмитолеиновой и вакценовой кислот, а и отношение площадей пиков метиловых эфиров кислот пальмитолеиновой и пальмитиновой, а так же вакценовой и олеиновой кислот.
Рассчитать значение отношений концентраций пальмитиновой и пальмитолеиновой кислот для качественного препарата можно, принимая во внимание то, что в действующих НАД на готовые препараты количественное содержание концентрата облепихового масла (или самого масла) оценивается спектрофотометрическим методом по количественному содержанию каротиноидов.
Так, в НАД, действующей на масло облепиховое в РФ и в Украине, указано содержание каротиноидов не менее 180 мг %.
В тоже время максимальная концентрации каротиноидов в концентрате масла облепихового, установленная за период наблюдений более 15 лет, составляет 640 мг %, поэтому при приготовлении готовой лекарственной формы масла облепихового макси-
мально возможное разведение концентрата подсолнечным маслом не должно превышать 3,5.
Таблица 1
Жирно-кислотный состав различных образцов масла облепихового и
«Аекола»
Наименование и обозначение жирной кислоты Содержание жирной кислоты в % (отн.)
Аекол (2003) АКХ «Облепиховый», РФ (2001 г) ОАО «Алтайвитами-ны» РФ (2001 г) Харьковская обл. (Украина) (2001 г)
С14:0 0,69 0,670 0,62 0,72
С 16:0 29,2 31,2 30,0 33,3
С16:1,п9 38,3 36,1 37,6 35,0
С16:2,п 9,6,12 1,31 1,3 1,0 1,1
С 18:0 1,4 1,3 1,9 1,5
C18:l, п 9 5,0 4,7 5,0 5,2
C18:l, п 11 8,0 8Д 8,3 6,9
С18:2, п 9,12 13,6 13,6 13,3 14,2
С18:3п 9,12,15 1,5 1,6 1,4 1,5
Другие кислоты 1,0 1,4 0,9 0,5
В самом подсолнечном масле, по требованиям действующего в большинстве стран СНГ ГОСТа 30623-98, содержание пальмитиновой кислоты должно быть в пределах от 5,6 до 7,6 %, а пальмитолеиновой кислоты от 0 до 0,3 %
а. о 2. о -л. а о. а е. о i о. о i г. а i 4. □
Рис fit Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот некачественного обраазца масла облепихового
Исходя из этих данных, и данных приведенных в таблице 1, видно, что максимально возможная концентрация пальмитиновой кислоты в готовом продукте после разведения в 3,5 раза концентрата масла облепихового маслом подсолнечным, может составлять 15%, а минимально возможная концентрация пальмитолеиновой кислоты - 10 %. Следовательно, если оба компонента препарата соответствовали требованиям нормативных документов, максимально допустимое соотношение концентраций пальмитиновой и пальмитолеиновой кислот в готовой лекарственной форме должно быть не более 1,5. Рассчитанное таким же образом значение отношения концентраций олеиновой и вакценовых кислот должно быть не более 15.
Для надежного разделения пиков метиловых эфиров олеиновой и вакценовой кислот необходимо использовать специальную капиллярную колонку, что для большинства предприятий - изготовителей препаратов на основе растительного сырья и контролирующих лабораторий экономически может быть невозможным из-за высокой стоимости колонки (около ЮООеиг). Поэтому, в качестве основного критерия подлин-
ности препаратов на основе облепихового масла в настоящее время целесообразно использовать наличие на хроматограммах испытуемых образцов пика метилового эфира пальмитолеиновой кислоты и соотношение площадей пиков метиловых эфиров пальмитиновой и пальмитолеиновой кислот. Предлагаемый критерий оценки качества и подлинности масла облепихового был использован при анализе 12 образцов препарата 5 украинских (7 образцов) и 4 российских производителей.
Результаты анализа показали, что все образцы масла облепихового украинских производителей не соответствовали предлагаемому критерию подлинности, при этом минимальное значение отношения концентраций пальмитиновой и пальмитолеиновой кислот имело значение 4,5, а в 5 образцах содержание пальмитолеиновой кислоты не превышало 1%.
Из образцов российских производителей 2 образца препарата имели значение отношения концентраций пальмитиновой и пальмитолеиновой кислот равное 1,02 и 1,50, т.е. практически полностью соответствовали предлагаемому критерию, а остальные образцы имели значение отношения концентраций пальмитиновой и пальмитолеиновой кислот от 1,77 до 2,4, причем значение 2,4 имел образец не лекарственного препарата, а пищевой добавки, качество которой регламентировано ТУ 9197-065-21-428156-2000 РФ.
Интересно отметить, что полностью соответствовали предлагаемому критерию подлинности только те образцы лекарственного препарата «Облепиховое масло», которые были произведены на предприятиях, перерабатывающих растительное сырьё и выпускающие концентрат облепихового масла в качестве сырья для других предприятий. Типичные хроматограммы метиловых эфиров жирных кислот образцов облепихового масла, для которых значение отношения концентраций пальмитиновой и пальмитолеиновой кислот соответствует и не соответствует предлагаемому критерию показаны на рисунках 7 и 8.
Предложенный критерий контроля качества препаратов на основе облепихового масла позволяет более объективно, чем используемые в настоящее время показатели оценить качество препарата, поскольку фармакологические свойства масла облепихового определяются не только наличием и количеством каротиноидов и ненасыщенных жирных кислот, айв значительной мере содержанием фитостеринов, витаминов и других биологически активных веществ [10], наличие и количество которых в препаратах в действующих НАД не нормируется.
Выводы
1. Проведены исследования жирнокислотного состава концентрата маслаоблепи-хового, различных производителей по методике, исключающей окисление ненасыщенных жирных кислот. Методика может быть выполнена как на насадочной, так и на капиллярной колонке и доступна для выполнения в большинстве контрольно-аналитических лабораторий.
2. На основании полученных результатов предложен новый критерий оценки качества облепихового масла - отношение концентраций пальмитиновой и пальмитолеиновой кислот. Предложенный критерий, позволяющий объективно выявлять фальсифицированные и не качественные препараты.
3. Предлагаемый критерий подлинности препарата применен при анализе 12 образцом масла облепихового, при этом было выявлено, что значительная часть образцов представляют собой фальсифицированные препараты.
Литература
1. Машковский М.Д., Лекарственные средства. - 13-е издание, Харьков: Торгсин, 1997. Т. 1-2.
2. Кричковская Л.В. Химия, биохимия, и технология биологически активных каротинсодержащих средств на основе растительного масла и жиров,- Харьков,-1997г.- 210 с.
3. Беззубов Л.П. Химия жиров,- М.: Пищевая промышленность, 1975, С. 280.
4. Лурье А.А. Хроматографические материалы,- М.: Химия, 1978. - 438 с.
