CC BY
2УДК: 602.643.66.633.491
Е.В. Исаенко, И.Н. Бердичевец, Т.В. Манешина, Н.А. Картель
СТАБИЛЬНОСТЬ НАСЛЕДОВАНИЯ ВЕКТОРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ С ГЕНОМ cry3aM В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ КАРТОФЕЛЯ
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
В процессе создания трансгенных растений главное внимание уделяется получению трансформантов с высокой экспрессией целевого гена и стабильности его наследования. Уровень экспрессии трансгена обычно определяется методом ОТ-ПЦР или иммуноферментным анализом. Что же касается стабильности наследования целевого гена, то здесь требуется проводить анализ трансформантов в процессе семенного или вегетативного размножения как отбором на селективной среде, так и ПЦР-анализом. Стабильное наследование транс-
гена является необходимой предпосылкой для заключения об успехе применения генно-инженерных линий в последующем селекционном процессе.
В данной статье приводятся результаты исследования стабильности наследования генов созданных нами векторных систем в трансгенных растениях картофеля. В качестве целевого гена использовался cry3aM ген из Bacillus thuringiensis, белковый продукт которого проявляет инсектицидные свойства в отношении колорадского жука.
Материалы и методы
В работе использованы растения картофеля сорта Скарб. Для создания векторных экспрес-сионных систем был использован модифицированный cry3aM ген с оптимизированным кодонным составом для более эффективной экспрессии в растениях [1, 2, 3].
Методы трансформации и молекулярно-генетического анализа материала подробно изложены в предыдущих публикациях [3, 4].
Исследование сохранности гетерологичных генов в пробирочной культуре трансформантов картофеля изучали методом мультиплексной ПЦР [6]. Реакционная смесь для мультиплексной ПЦР содержала: 50 мМ KCl (pH
9,0); 0,1% тритон-Х100; 2,5 мМ MgCl2; 0,2 мМ каждого dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 5-10 пмоль каждого праймера; 150 нг геномной ДНК картофеля и 1 ед.акт. Taq-полимеразы (Силекс, Россия). ПЦР проводили в амплификаторе Peltier Thermal Cycler ("Bio-Rad", США) при следующих условиях 94°С - 5 мин; 94°С - 1 мин, 61 °С - 1 мин, 72°С - 1 мин 30 сек (30 циклов); заключительная элонгация: 72°С - 4 мин. Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле в трис-ацетатном буфере. Результаты гель-электрофореза документировали с помощью системы GelDoc 2000 ("Bio-Rad", США).
Результаты и обсуждение
В результате молекулярного клонирования созданы системы экспрессии гена cry3aM под управлением индуцируемого светом rbcS промотора малой субъединицы гена РБФК Arabidopsis thaliana, а также конститутивного промотора 35Б РНК вируса мозаики цветной капусты (35SCaMV). Использованы
также последовательности, кодирующие ли-дерные пептиды, которые определяют разную локализацию генного продукта в клетке, а именно, последовательность лидерного пептида гена rbcS гороха - обеспечивает локализацию в хлоропластах растения и последовательность лидерного пептида экстенсина
моркови - локализация в межклеточном пространстве. Использование данных лидерных последовательностей предполагает более высокую доступность молекул токсина для про-цессирования и последующего связывания с рецепторами при попадании в кишечник насекомого.
В экспрессионных системах использована
также термостабильная лихеназа как трансляционный репортер. Использование такого типа репортера значительно облегчает процедуры скрининга трансформантов с повышенным уровнем экспрессии, а также позволяет определять массу белка и его выход [7].
На рисунке 1 представлены схемы созданных экспрессионных систем.
гЬсБ ЬсЬ сгу3аМ ро1уА
гЬсБ ЬсЬ сгу3аМ НсБ ро1уА
гЬсБ сгу3аМ НсБ ро1уА
гЬсБ ЬСБ сгу3аМ НсБ ро1уА
35Б
сгуЗаМ
ро1уА
35Б сгу3аМ НсБ ро1уА
Рис. 1. Схема экспрессионных систем с геном cry3aM. rbcS - светоиндуцибельный промотор малой субъединицы гена РБФК, cry3aM - модифицированный ген cry3a, licB - ген лихеназы, ЬсИ - последовательность лидерного пептида гена rbcS гороха, Ьбс - последовательность лидерного пептида гена экстенсина моркови, 358 - конститутивный промотор 358 РНК CaMV, ро1уА - область
полиаденилирования.
Экспрессионные кассеты для cry3aM и cry3aM-licB генов под управлением светоинду-цибельного промотора гЫ8 созданы на основе вектора для экспрессии в растениях рс29 [8]. Для получения векторных молекул, в которых целевые гены находятся под контролем кон -ститутивного промотора 35БСаМУ , использовали плазмиду р135Б-агоА (Институт общей генетики РАН).
Оба вектора несут селекционный маркер устойчивости к антибиотику канамицину прШ. В результате проведения работы по молекулярному клонированию создано 6 оригинальных векторных конструкций, содержащих экспрес-сионные системы генов cry3aM и cry3aM-licB под управлением указанных выше регулятор-ных элементов.
Созданные вектора использованы для трансформации растений картофеля сорта Скарб
методом агробактериальной трансформации путем обработки листовых дисков суспензией AgroЪacterium tumefaciens AGLO, содержащей соответствующие генетические конструкции.
Первичный отбор трансформантов проводили на среде, содержащей селективный агент - канамицин (50 мг/л). Отобранные на селективной среде регенеранты для подтверждения наличия в них целевого гена анализировали методом ПЦР и методом блот-гибридизации по Саузерну. Изучалась также экспрессия целевого гена методом ОТ-ПЦР, а также экспрессия гена лихеназы методом энзимограмм [7,9]. В результате были отобраны трансгенные растения по всем экспрессионным кассетам с относительно высокой экспрессией целевого гена cry3aM.
Линии растений-трансформантов, полученные от трансформации ДНК конструк-
ции 35S-cry3aM-licB обозначены 35Б-С-Ь, линии от трансформации ДНК конструкции 35S-cry3aM названы 35Б-С. От трансформации ДНК конструкцией rbcS-Lch-cry3aM и rbcS-Lch-cry3aM-licB полученные трансгенные линии названы КБСВ-ЬсЬ-С и КБСВ-ЬсЬ-С-Ь соответственно. Для конструкций rbcS-cry3aM-licB и rbcS-Lsc-cry3aM-licB линии трансформантов несут обозначения соответственно КБСБ- С-Ь и ЯБСБ-Ьвс-С-Ь.
Успешная интродукция гетерологичных генов в настоящее время не представляет больших трудностей для многих растений. Однако введение в растительный геном чужеродной генетической информации не всегда обеспечивает стабильное фенотипическое проявление
и классическое менделевское наследование. Такая генетическая нестабильность может быть связана как с делецией или мутацией введенной ДНК, так и с инактивацией трансгена [10, 11, 12].
Для определения характера наследования целевых генов, а также выяснения расположения двух выявленных методом блот-гибридизации по Саузерну копий целевых генов в геноме модифицированных линий проводили скрещивание трансгенных линий картофеля с исходным сортом Скарб и самоопыление трансгенных линий с последующим анализом семян на устойчивость к канамицину. Результаты фенотипиче-ского расщепления по признаку устойчивости к канамицину приведены в таблице 1.
Таблица1
Анализ расщепления популяции сеянцев по признаку устойчивости к канамицину
Линии растений Количество семян V MS, шт. Количество семян V MS + Km75, шт. Количество проростков на V2 MS + Km75, шт. Отношение res/sens проростков Модель расщепления
а b % а b % res sens Ф Т
82-2с 14 12,0 85,7±14,3 25 21,5 86,0±6,0 31 12 31:12 32:11* 3:1
86-2с 16 14,0 87,5 ± 8,9 25 19,5 78,0±7,3 28 11 28:11 29,5:9,5* 3:1
36-6с 19 15,5 81,6±2,6 25 21,5 86,0±2,0 41 2 41:2 40:3* 15:1
54-5 х Скарб 25 15,5 62,0±6,0 25 18,5 74,0±6,0 19 18 19:18 18,5:18,5* 1:1
155-1с 12 9,0 75,0±8,3 23 17 73,9±4,3 26 8 26:8 25,5:8,5* 3:1
161-1с 10 7,5 75,0±5,0 25 20,5 82,0±2,0 32 9 32:9 31:10* 3:1
15-3 х Скарб 16 12,0 75,0±12,5 25 19 76,0±4,0 0 38 0:38 - -
16-6 х Скарб 22 15,0 68,2±4,5 25 18 72,0±8,0 16 20 16:20 18:18* 1:1
15-3с 14 3,0 21,4±14,3 25 9 36,0±4,0 0 18 0:18 - -
38-3 х Скарб 17 17,0 100,0±0,0 25 24 96,0±0,0 26 22 26:22 24:24* 1:1
169-1с 19 14,5 76,3±7,9 24 19,5 81,3±6,3 31 8 31:8 29:10* 3:1
Примечание. а - высажено семян в каждой повторности; b- среднее количество проростков; res - устойчивые к канамицину проростки; sens - чувствительные к канамицину проростки; Ф - фактическое соотношение устойчивых и неустойчивых к канамицину проростков; Т - теоретически ожидаемое соотношение; после процентного показателя приведено отклонение среднего;
* - фактическое значение х2 > 3,841 - гипотеза достоверна.
У растений четырех тестируемых линий (82-2, 155-1, 161-1, 169-1) наблюдаются расщепления близкие к 3:1, что является результатом самоопыления родительских растений. В результате анализирующего скрещивания родительских форм наблюдается ожидаемое расщепление 1:1. Эти данные согласуются с гипотезой моногенного наследования признака и соответствуют расщеплению симплексной гетерозиготы Аааа, что в данном случае является следствием интеграции одной или нескольких копий трансгена в одну гомологичную хромосому.
У линии 36-6 при самоопылении 41 проросток оказался устойчивым к канамицину и только 2 чувствительных, что можно объяснить расщеплением гетерозиготы по двум неаллельным генам 15:1 при полном доминировании. В случае линии 15-3 наблюдается отсутствие устойчивости к канамицину у всех проростков без исключения как при самоопылении, так и в результате скрещивания с исходным сортом. Данный феномен, возможно, обусловлен явлением сайленсинга.
Полученные данные, несмотря на различное количество вставок гетерологичной последо-
вательности и различное положение их в геноме растений, соответствуют схеме менделев-ского расщепления и могут служить основой для заключения о стабильном и предсказуемом характере наследования интегрированной в геном трансгенной вставки, содержащей гены nptII и cry3aM.
Созданная коллекция трансгенных растений картофеля поддерживалась в течение 3 лет в культуре in vitro на стандартной среде MS (Sigma) c добавкой хлор-холин-хлорида (70 мг/л) и селективного агента канамицина (50 мг/л). Пересадка на свежую среду производилась каждые 3-4 месяца. В этой связи представляло интерес изучить стабильность наследования целевого гена cry3aM и гена лихеназы в пробирочной культуре в течение 3 лет. Для анализа был использован метод мультиплексной ПЦР, разработанный в ИОГен РАН [6]. Данный метод позволяет за один раунд ПЦР провести эффективный скрининг трансформантов и выявить наличие последовательностей целевого, репортерного и селективного генов, а также оценить качество препарата выделенной геномной ДНК.
Пример результатов ПЦР-анализа представлен на рисунке 2.
M w 1 2 3 4 5 б 7 S 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Рис. 2. Результаты ПЦР-анализа растений картофеля поколения Т3 с геном cry3aM. M - маркер молекулярного веса GeneRuler Express DNA Ladder («Fermentas», Литва), w - контроль чистоты реакции (вместо проб ДНК
взята вода), 1-17 - трансформанты картофеля.
Как видно из представленных на рисунке данных, не во всех образцах ДНК, выделенных из трансформантов картофеля, присутствуют последовательности всех исследуемых генов. В ряде образцов не обнаружены последовательности ни целевого (cry3aM), ни репортерного (licB) генов (дорожки 5, 9, 14). Однако, присутствие ПЦР-фрагмента гена домашнего хозяйства act свидетельствует о
хорошем качестве препарата ДНК.
В ряде образцов обнаружены последовательности целевого гена и гена домашнего хозяйства, но не обнаружена последовательность репортерного гена licB (дорожки 10 и 17). Мультиплексному ПЦР-анализу были подвергнуты 115 линий, представляющих все 6 экспрессионных кассет. Результаты анализа представлены в таблице 2.
Таблица 2
Наличие трансгенов в трансгенных растениях картофеля после 3-х лет выращивания
в культуре in vitro.
Экспрессионные кассеты Варианты опыта К-во линий Линии, исходно содержащие гены Линии, содержащие гены после культивирования in vitro Линии, у которых отсутствуют оба гена (cry3aM и licB)
cry3aM, шт. licB, шт. cry3aM licB
шт. % шт. % шт. %
RBCS-Lch-C 1 9 9 - 9 100 - - - -
RBCS-Lch-C-L 2 15 15 15 15 100 2 13,3 - -
35S- C-L 3 25 25 25 19 76 15 60,0 5 20,0
35S-C 4 7 7 6 85,7 - - - -
RBCS- C-L 5 30 30 30 26 76,7 23 76,7 4 13,3
RBCS-Lsc-C 6 29 29 29 23 79,3 21 72,4 6 20,6
Всего 115 115 99 98 85,2 61 61,6 15 15,2
Как видно из таблицы, в варианте 2 (RBCS-Lch-C-L) все 15 трансгенных линий сохранили целевой ген. В то же время репортерный ген лихеназы licB сохранился лишь у двух линий. В опыте 3 (35S- C-L) наблюдаются потери как целевого, так и репортерного гена, причем у 5 линий отсутствуют оба гена. Сходная картина наблюдается также в вариантах 5 (RBCS-Lsc-C) и 6 (RBCS-Lsc-C). В общей сложности по всем 6 вариантам опыта из 115 проанализированных линий целевой ген стабильно наследовался у 98 линий или у 85,2%. Репортерный ген лихеназы
сохранился у 61,6% трансгенных линий. У 15 линий (15,2%) не обнаружены оба гена.
Таким образом, из полученных данных следует, что длительное поддержание трансформированных растений в пробирочной культуре, их вегетативное размножение влияет на стабильность наследования трансгенов.
Проведенный анализ позволил эффективно проанализировать трансформанты картофеля и исключить из дальнейших экспериментов растения, не содержащие в геномной ДНК последовательностей перенесенных генов.
Список использованных источников
1. Salehi Jozani, G.R. Full modification of the coding sequence for enhancing potato expression of insect control protein cry3a gene/
G.R. Salehi Jozani, I.V. Goldenkova, E.S. Piru-zan // Genetic variation for plant breeding: proceeding book of XVII European Association for Research on plant Breeding conference, Tulln, Austria, - 2004. - P. 239-245.
2. Салехи Джузани, Г.Р. Модификация последовательности гена g-эндотоксина Bt var tenebrionis для эффективной экспрессии в двудольных растениях // Г.Р. Салехи Джузани, К.А. Мусейчук // Актуальные проблемы генетики: материалы II конф. МОГИС им.
H.И. Вавилова, Москва, 20-21 февраля 2003 г. / ИОГен им. НИ. Вавилова РАН, МГУ им.
М.В. Ломоносова, Вавиловское общество генетиков и селекционеров; редколл.: И.Ф. Жи-мулев [и др.] - Москва, 2003. - С. 112.
3. Экспериментальные модели для создания трансгенных растений, устойчивых к стрессовым факторам / И.В. Голденкова-Павлова, Е.В. Исаенко, Н. Мирахорли, А.Р. Маали, Н А. Картель, НО. Юрьева, И.А. Абдеева // Цитология и генетика. - 2007. -№ 3. - С. 44-49.
4. Исаенко, Е.В. Перенос гена сгуЗаМв геном растений картофеля / Е. В. Исаенко, И. В. Голденкова-Павлова, Н.А. Картель // Картофелеводство: сб. науч. тр. / РУП науч. практ. Центр НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству; редкол. В.Г. Иванюк
[и др.] - Минск, 2007 - Т. 12. - С. 14-21.
5. Экспрессия и сайленсинг гетерологич-ных трансгенов cry3aM и chiA в картофеле белорусских сортов / Е.В. Исаенко, А.В. Шах-базов, А.С. Панюш, Н.А. Картель // Вестник Фонда фундаментальных исследований. -2008. - № 3. - С. 36-41.
6. Berdichevets, I.N. Multiplex PCR assay for detection of recombinant genes encoding fatty acid desaturases fused with lichenase reporter protein in GM plants / I.N. Berdichevets [et all.] // Anal. Bioanal. Chem. - 2010. - V. 397. -P. 2289-2293.
7. Новая репортерная система, основанная на высокой термостабильности лихеназы для изучения регуляции экспрессии генов у растений / Э.С. Пирузян [и др.] // Физиология растений - 2000. - Т. 47. - № 3 - С. 382-389.
8. Plant expression vectors with the origin of replication of the W-type plasmid Sa / T. Allote
[et all.] // Plasmid - 1988. - V. 19. - P. 251-254.
9. Голденкова, И.В. Бифункциональные репортерные гены: конструирование и экспрессия в клетках про- и эукариот / И.В. Гол -денкова, К. А. Мусейчук, Э.С. Пирузян // Молекулярная биология - 2003. - № 37. - С.1-9.
10. Генетическая трансформация растений, процессы рекомбинации и регуляции экспрессии генов у трансгенных растений / Курочкина С. Д. [и др.] // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология - 1988. -№ 4. - С. 3-12.
11. Frequent occurance of trancgent deletion in transgenic plant / Kim Y.S. [et. all] // Mol. Cells - 1998. - V. 8. - P. 705-708.
12. Frequent spontaneous deletion of Ri T-DNA in Agrobacterium rizogenes transformed potato roots and regenerated plants / Hanish ten Cate C.H. [et. all] // Plant Mol. Biol. - 1990. -V. 14. - P. 735-741.
Дата поступления статьи 24 июня 2011 г.
