CC BY
2УДК: 602.643.66.633.491
Е.В. Исаенко, Н.А. Картель
ПОВЫШЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ К КОЛОРАДСКОМУ ЖУКУ ПУТЕМ ТРАНСГЕНОЗА ДНК-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ cry3aM
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Технология рекомбинантных ДНК нашла свое применение во многих областях науки, медицины, промышленности и сельского хозяйства. Ярким достижением в этой области явились работы по генетической трансформации растений, обеспечившие возможность контролируемого улучшения ряда агрономически полезных признаков. В отношении борьбы с опасным вредителем картофеля колорадским жуком эффективным является подход, основанный на введении генов, ко -дирующих инсектицидные белки, в геном растений. К таким белкам относятся токсины Bacillus thuringiensis, которые в настоящее время используются в составе биопрепаратов для борьбы с вредными насекомыми. Наиболее важными из них являются параспораль-ные кристаллические белки (СГу-токсины). В настоящее время идентифицировано около 150 cry-генов, продукты которых оказывают инсектицидное действие на различные группы насекомых (жесткокрылых, двукрылых, чешуекрылых), а также на нематод [1]. В настоящее время получены трансгенные растения многих видов (кукурузы, хлопка, риса и т.д.) экспрессирующие cry-гены, в том числе и картофеля. Этот метод борьбы с вредителями экономически оправдан, т.к. позволяет преодолеть нестабильность инсектицидных препаратов на основе Bacillus thuringiensis и/или их
метаболитов. Экспрессия нативных cy-генов Bacillus в растениях малоэффективна. Причина низкого уровня экспрессии этих генов в эукариотических системах обусловлена рядом факторов, в частности различным содержанием A+T в нуклеотидных последовательностях, разными частотами использования кодонов в генах. При замене нуклеотидов в последовательностях Bacillus синонимичными кодона-ми растений экспрессия модифицированных генов в растениях значительно увеличивается. [2] Для получения растений, синтезирующих оптимальное количество генного продукта, важным является создание эффективных систем экспрессии, обуславливающих высокий уровень экспрессии исследуемого гена, возможность включения\выключения его транскрипции, направленная компартментализа-ция генного продукта как в органах и тканях растений, так и в растительной клетке. Для обеспечения высокого уровня экспрессии генов используются различные регуляторные элементы, такие как сильные промоторы, эн-хансеры. Для направленного синтеза и функционирования генных продуктов в различных органах и тканях и различных компартментах растительной клетки (апопласт, вакуоли, хлоропласт, ядро) используются соответствующие тканеспецифичные регуляторные элементы и сигналы внутриклеточной локализации.
Материалы и методы
Процедуры молекулярного клонирования Получение агробактериальных трансконью-
проводились согласно методическому руко- гантов, содержащих векторную конструкцию
водству Маниатиса (1984) с использованием проводили посредством трехродительского
штамма Escherichia coli XL1-blue[3]. скрещивания с использованием бактериально-
го штамма E.coli НВ101, несущего плазмиду рКК2013. Ночные культуры бактериальных штаммов: E.coli ХЬ1-Ь1ие, несущие созданные векторные конструкции, E.coli НВ 101 с плазмидой рКК2013, и реципиентный штамм Agrobacterium tumefaciens Л0Ь0, смешивали в соотношении 1:1:2 путем центрифугирования в течение 5 минут при 5 000 g и высевались на чашку Петри с агаризованной ЬВ средой без селективных агентов. После культивирования в течение 16 часов при 28°С, клетки высевали на среду ЬВ с селективными антибиотиками и культивировали в течение двух суток при 28°С. Выросшие агробактериальные трансформанты троекратно пассировались на селективной среде. Наличие векторных плазмид в клетках A. tumefaciens Л0Ь0 подтверждали методом ПЦР.
Растительный материал. В работе использовали растения картофеля сорта Скарб. Данный сорт является столовым и характеризуется высокой урожайностью, отличной лежкостью, содержанием крахмала 12,0-17,0 %.
Агробактериальную трансформацию растений проводили методом листовых дисков. Для трансформации использовалась асептическая культура картофеля сорта Скарб, выращиваемая на стандартных агаризованных средах МБ (сахароза 20 г/л). Для инокуляции растительных эксплантов использовали жидкую среду МБ с добавлением 150 мкмоль ацетосеринго-на, а также агаризованную (0,7 %) МБ среду с добавлением БАП (1мг/л), НУК (0,2 мг/л) и зеатина (2 мг/л). Для каллусообразования и инокуляции использовали агаризованную среду МБ с добавлением сахарозы в концентрации 30 г/л и фитогормонов: БАП (1мг/л), НУК (0,2 мг/л), зеатина (2 мг/л), кинетина (0,5 мг/л), гиббереллина (1 мг/л) и антибиотиков: тиментина (200 мг/л) и канамицина (50 мг/л). В эксперименте использовалась асептическая культура картофеля, возрастом 1-1,5 месяцев. Растения выдерживали в течение двух суток при температуре +4°С. В стерильных условиях листья отделяли от стеблей картофеля, вырезали срединную жилку и культивировали в суспензии агробактерий, подготовленных в жидкой МБ среде в течение 40 минут. Далее листовые диски отмывали стерильной водой, и для дальнейшей инокуляции инкубировали на агаризованной МБ-среде в течение двух-трех
суток в темноте при 20-24°С. После инокуляции листовые диски подсушивали на фильтровальной бумаге и помещали на селективные среды. Культивацию проводили при 20°С на свету. Экспланты переносили на свежую среду каждые 3 недели. Образовавшиеся каллусы вырезали и переносили на новые среды. Через 6-8 недель регенеранты растений срезали и помещали на агаризованную среду MS с добавлением канамицина (50 мг/л) и тиментина (200 мг/л) [4].
Регенеранты картофеля поколения Т0 анализировались на устойчивость к канамицину посредством их укоренения на селективной среде. Концентрация канамицина составляла 50 мг/л. В качестве контроля использовали ре-генеранты нетрансформированного картофеля. Первичные трансформанты, проявившие способность образовывать корневую систему в присутствии селективного агента, далее поддерживались в культуре in vitro с добавлением канамицина 50 мг/л.
ПЦР и RT-ПЦР анализ проводили с использованием праймеров специфических к нуклео-тидной последовательности гена cry3aM:
5'-AATTCCATGCCTTCCTTTGCAATCT-3'
5'-CCCTGCATCAAGAAGCACATAACATAG-3'
Для ПЦР-анализа использовалась плазмид-ная ДНК из клеток A.tumefaciens и E.coli и геномная ДНК растений картофеля. Для RT-ПЦР анализа использовалась кДНК растений картофеля, синтезированная на основе мРНК, выделенной посредством реагента TRIreagent (Sigma).
Адаптация растений к условиям открытого грунта осуществлялась с использованием ио-нитопонного подхода. Пробирочные растения весной (в апреле) черенковали и высаживали в емкости с ионитными смолами. Через 3-5 недель растения переносили в грунт в условиях закрытого полигона для проведения дальнейших исследований.
Изучение коллекции картофеля по показателю поврежденности растений колорадским жуком в полевых условиях проводили согласно методическим указаниям по оценке устойчивости картофеля к колорадскому жуку РАСХН [5]. Растения трансгенного картофеля высаживали полосками по 5-10 по-вторностей в условиях закрытого полигона и анализировали по показателю поврежденности
надземных частей растений личинками и имаго колорадского жука. Для оценки повреждений использовали международную фитопатологи-ческую шкалу. Поскольку требования биобезопасности предписывают проведение такого рода исследований в условиях закрытых полигонов, где не может быть естественного фона
вредителя, заселение анализируемого участка картофеля колорадским жуком проводилось искусственно через 3 недели после высадки растений в грунт.
Статистический анализ данных (однофак-торный дисперсионный анализ) проводили с помощью пакета Microsoft Excel.
Результаты и обсуждение
В нашей работе используется последовательность гена cry3a B. thuringiensis, белковый продукт которого проявляет инсектицидные свойства в отношении колорадского жука. С целью повышения уровня экспрессии в клетках растений нуклеотидная последовательность гена (сгуЗаМ) была изменена и приближена по кодонному составу к ДНК генома растений [6, 7].
В результате молекулярного клонирования была создана система экспрессии гена сгуЗаМ,,
в которой модифицированный ген cry3a находится под контролем индуцируемого светом промотора малой субъединицы гена РБФК Arabidopsis thaliana, обеспечивающий преимущественную экспрессию контролируемого гена только в зеленых тканях растения. Для компартментализации в растительных клетках белкового продукта в хлоропластах растений использовали слияние последовательности целевого гена с последовательностью лидерного пептида гена rbcs гороха (Рис. 1).
Рис. 1. Схема экспрессионной системы гена сгуЗаМ; гЪс$ - светоиндуцибельный промотор малой субъединицы гена РБФК AraЪidopsis ЛаНапа; ЬеИ - лидерный пептид гена гЪа' гороха; сгуЗаМ - модифицированный ген сгуЗа; ро1уА - область полиаденилирования.
Данная система экспрессии была введена в состав Т-ДНК векторной молекулы рС29 посредством расщепления ДНК эндонуклеа-зами рестрикции ВадаН1-Ара1 и последующего лигирования. Для получения трансформирующего агробактериального штамма проведено трехродительское скрещивание бактериальных клеток Е.соЫ, содержащих векторную молекулу, вспомогательного штамма Е.соЫ НВ101, несущего плазми-ду рЯК2013 и АЛише/аЫет АОЬО. После троекратного пассирования на селективных средах отобранные клоны тестировались на присутствие в клетках последовательности гена сгуЗаМ методом ПЦР с использованием специфических праймеров.
Агробактериальные клетки с векторной конструкцией использовались для введения Т-ДНК со вставкой целевого гена в геном растений картофеля. Методом агробактери-альной трансформации листовых дисков растений картофеля сорта белорусской селекции
Скарб получено 126 независимых трансгенных линий.
Образовавшиеся на каллусных массах реге-неранты помещали на культуральные среды, содержащие канамицин. После троекратного пассирования на селективных культуральных средах растения, образующие корневую систему в присутствии канамицина, подвергали анализу методом ПЦР с использованием специфических праймеров к последовательности гена сгуЗаМ.
В общей сложности получено 135 реге-нерантов из 69 исходных эксплантов после обработки суспензией агробактерий, содержащих векторную ДНК с целевым геном. В контрольном варианте, где листовые диски культивировались на гормональных средах, не содержащих селективный агент, из 50 экс-плантов получено 85 регенерантов. Эффективности регенерации в условиях трансформации растительных клеток бактериальной ДНК и контрольном варианте соответственно равны 1,957 и 1,700 (Табл. 1).
Примечание.
Я общ. - общее количество регенерантов;
Я КтЯ - общее количество устойчивых к канамицину регенерантов;
Яобщ. - количество регенерантов в пересчете на один эксплант (эффективность регенерации); Я и.э.
ЯКтЯ - количество устойчивых к канамицину регенерантов в пересчете на один эксплант (эффективность трансформации); Я и.э.
ЯКтЯ - доля регенерантов, устойчивых к канамицину, в пересчете на общее число полученных регенерантов. Я общ.
Таблица 1
Основные показатели агробактериальной трансформации
Количество исходных эксплантов Я общ Я КтЯ Яобщ. Я и.э. ЯКтЯ Я и.э. ЯКтЯ Я общ.
гЪс8-ЬсЬ-сгу3аМ 69 135 126 1,957 1,826 0,933
контроль 50 85 - 1,700 - -
С регенерирующих каллусных масс удаляли побеги, достигшие 1 см в длину и помещали на селективные МБ среды для последующего отбора первичных трансформантов. Как видно из таблицы 1, было отобрано 126 независимых линий, дающих корни на селективных средах в присутствии канамицина (Рис. 2).
Укоренившиеся растения подвергали исследованию методом ПЦР (Рис. 3). Проанализирована совокупность из 85 образцов. Поскольку вставка обнаружена во всех исследованных линиях, отбор трансформантов картофеля по факту формирования корневой системы в селективных условиях признали эффективным и достаточным. В результате эффективность трансформации растений сорта Скарб ДНК векторной плазмиды р С29 со вставкой cry3аМ составляет 1,826 регенеранта на 1 эксплант и доля регенерантов, устойчивых к канамицину, в пересчете на общее число полученных регенерантов - 0,933.
Рис. 2. Укоренение контрольных растений и трансформированных регенерантов. А. Регенерант-трансформант сорта Скарб, укоренившийся на селективной среде (канамицин 50 мг/л). Б. Контрольное растение сорта Скарб, укоренившееся на среде без канамицина. В. Контрольное растение сорта Скарб на селективной среде.
Рис. 3. ПЦР-анализ трансформантов картофеля. Х/РбИ - маркер молекулярных весов. К+ - ДНК плазмиды 35Б-Буп. 1-10 - образцы тотальной ДНК картофеля, показавшие устойчивость к канамицину. С - тотальная ДНК растения сорта Скарб. К- - отрицательный контроль.
Для проведения испытаний полученных трансформированных растений картофеля на устойчивость к колорадскому жуку отобрано 22 случайные линии. Из черенков получили сеянцы, которые были высажены в условиях закрытого полигона. Проводили тестирование опытных растений на наличие экспрессии целевого гена
сгуЗаМ методом КТ-ПЦР (Рис. 4). Выявлено, что только 11, т. е половина растений в исследуемой выборке, содержит в клетках РНК исследуемого гена. Приведенные далее результаты однофак-торного дисперсионного анализа получены для растительных линий с подтвержденной экспрес-сионной активностью целевого гена.
1кб К+ 1 2 3 4 5 6 7 К-
Рис. 4. ЯТ -ПЦР - анализ растений картофеля. 1 кЬ - маркер молекулярных весов. К+ - ДНК плазмиды рС29-Ь-Буи. 1-7 - образцы кДНК картофеля. 6 - кДНК контрольного растения. К- - отрицательный контроль.
Проведены исследования устойчивости отобранных линий растений к колорадскому жуку с использованием критерия поврежденности листовых пластинок личинками и имаго колорадского жука. Для оценки поражения использовалась международная фитопатологическая шкала, включающая цифровые значения от 1 до 9 баллов, причем кустам исследуемых растений без повреждений соответствует значение 9, растениям, поврежденным свыше 80 % - значение 1. Следовательно, чем выше балл, тем меньше повреждены листья растения. В таблице 2 приведены средние значения поврежденности исследуемых линий картофеля колорадским жуком, а также отклонение среднего. Из таблицы 2 видно, что наибольшие повреждения листовой поверхности обнаружены у контрольных растений - около 65-80 % листовой поверхности (средний балл 3,5), трансгенные растения представляют собой спектр устойчивости к повреждениям вредителем. Это, вероятно,
объяснимо различными уровнями экспрессии целевой последовательности гена сгуЗаМ в растительных тканях. Наименьшие повреждения после окончания цветения обнаружены у линий 17-1, 32-1, 53-1, 8-1, 152-1, у которых значения баллов устойчивости приближены к значению 7, что соответствует повреждениям растения на 11-25 %. Повреждения листовой поверхности линий 24-1 и 74-1 в период окончания цветения близки к значению 6, что соответствует повреждениям растений на 25-40 %. Линии 154-1 и 169-1 повреждены на 35-50 %, что выражается в средних баллах, близких к 5. Самый низкий балл повреждений ботвы среди трансгенных линий зафиксирован у линии 2-1 и составляет 4,75. По данным однофакторного дисперсионного анализа различия между исследуемыми линиями и контрольными растениями в вегетационной фазе окончания цветения по поврежденности листовой поверхности являются статистически значимыми.
Таблица 2
Средний балл повреждения листовых пластинок растений картофеля колорадским жуком (¿отклонение среднего)
№ Линия Фаза вегетации
Кущение Начало бутонизации Бутонизация -начало цветения Массовое цветение Цветение -окончание цветения Окончание цветения
1 Скарб 9,00±0,00 7,90±0,54 7,50±0,50 7,60±0,48 6,60±0,48 3,50±0,80
2 17-1 8,67±0,44 9,00±0,00 9,00±0,00 8,67±0,44 8,00±0,00 7,00±0,00
3 32-1 8,80±0,32 8,80±0,32 8,00±0,00 8,00±0,00 7,80±0,32 6,75±0,88
4 24-1 8,25±0,38 8,50±0,50 7,50±0,50 7,50±0,50 6,75±0,38 5,67±1,11
5 53-1 9,00±0,00 8,50±0,50 8,17±0,28 8,00±0,00 7,50±0,50 7,00±0,00
6 74-1 8,80±0,28 8,60±0,48 8,25±0,38 8,00±0,00 7,33±0,44 5,83±0,56
7 8-1 9,00±0,00 8,75±0,38 8,25±0,38 7,50±0,50 7,50±0,50 7,00±0,00
8 154-1 8,80±0,32 8,20±0,32 7,80±0,32 7,60±0,48 7,60±0,48 5,33±0,44
9 152-1 8,75±0,38 8,50±0,50 8,50±0,50 8,50±0,50 8,33±0,44 7,00±0,67
10 161-1 9,00±0,00 9,00±0,00 8,80±0,32 8,20±0,32 7,40±0,48 6,50±0,75
11 169-1 9,00±0,00 9,00±0,00 8,20±0,64 7,80±0,32 7,40±0,48 5,25±0,38
12 2-1 9,00±0,00 8,40±0,48 8,00±0,00 7,80±0,32 6,80±0,64 4,75±0,75
Методом однофакторного дисперсионного анализа выявлены 3 тестируемые линии (17-1, 152-1,161-1), значения поврежденности которых отличаются от контроля статистически
значимо во всех фазах вегетации, начиная с фазы бутонизации. Изменения в целостности листовой массы для линий 17-1, 152-1 и161-1 представлено на рисунке 5.
Рис. 5. Повреждения листовых пластинок колорадским жуком во время различных вегетационных фаз.
Как показано на графике (Рис. 5), средние пределах 8-9, что соответствует 0-10 % по-
баллы поврежденности листовых пластинок вреждений, в то время как значения показа-
у линий 17-1, 152-1 и161-1 до вегетацион- телей контрольных растений снижаются до
ной фазы окончания цветения варьируют в 20 % (7,5), а во второй половине периода цве-
тения опускаются до 6,5 (30-40 %) и после окончания цветения снижаются до 3,5, что соответствует 65-80 % повреждений. Более быстрое падение баллов поврежденности в
период завершения фазы цветения и после обуславливается появлением личинок III и IV возраста, характеризующихся повышенным потреблением биомассы.
Заключение
Получены растения картофеля с целевым геном и клубневое поколение белорусского сорта Скарб, экспрессирующие ген В^токсина сгуЗаМ. Проведен молекулярный анализ растений методами ПЦР и ЯТ-ПЦР, подтверждена вставка трансгена в геном картофеля, отобраны трансформанты, экспрессирующие
заданный белок. Проведено тестирование растений в полевых условиях, исследованы повреждения листовых пластинок. Показано, что трансгенные линии, экспрессирующие В^токсин, повреждаются личинками и имаго колорадского жука в достоверно меньшей степени, чем контрольные.
Список использованных источников
1. Rajamohan, F. Bacillus thuringiensis in-secticidal proteins: molecular mode of action. / M.K. Lee, D.H. Dean // Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology - Academic Press, New York, 1998.- V. 60, P. 335-339.
2. Schnepf, E. Bacillus thuringiensis and Its Pesticidal Crystal Proteins. / N. Crickmore, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, J. Feitelson, D. R. Zeigler, D.H. Dean // Microbiology and Molecular Biology Reviews. Sept., 1998. -P. 775-806.
3. Маниатис Т., Фрич Э.Д. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. с. 480.
4. Исаенко, Е.В. Перенос гена cry3aM в геном растений картофеля / Е.В. Исаенко, И.В. Голденкова-Павлова, Н.А. Картель // Сб. науч. тр. / Ин-т картофелеводства НАН Беларуси. - Минск, 2007.- Т. 12: Картофелеводство. - C. 14-21
5. Методические рекомендации по изучению и оценке форм картофеля на устойчивость к колорадскому жуку РАСХН / Н.А. Вилко-ва [и др.]; под ред. Вилковой Н.А.- Москва: Российская академия сельскохозяйственных наук, 1993.
6. Салехи, Дж. Сравнительный анализ экспрессии нативного и модифицированного генов cry3a B. thuringiensis в прокариотиче-ских и эукариотических клетках / Дж. Салехи, Р.А. Комахин, Э.С. Пирузян // Генетика.-2005. - T. 41, № 1, - C. 171-177.
7. Salehi Jozani, G.R. / Full modification of the coding sequence for enhancing potato expression of insect control protein cry3a gene. / Salehi Jozani, I.V Goldenkova, E.S. Piruzian // Proceeding book of XVII European Association for Research on Plant Breeding conference on «Genetic Variation for Plant Breeding».- 2004.- Tulln, Austria,.- P. 239-245.
Дата поступления статьи 4 декабря 2008 г.
