CC BY
7УДК 604.6:635.21
Д.В. Савчин, А.С. Панюш, Н.А. Картель
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТЕНИЙ ВЕКТОРНЫМИ КОНСТРУКЦИЯМИ С ГЕНОМ GOX PENICILLIUM FUNICULOSUM
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Наряду с методами традиционной селекции, используемыми для получения высокопродуктивных сортов растений, все большее распространение получают генно-инженерные подходы. Их основным преимуществом являются возможности создания растений, обладающих принципиально новыми признаками, которых невозможно добиться с использованием селекционных методов. Так, в работах G. Wu с соавторами (Monsanto Company) было показано, что трансгенные растения картофеля, экс-прессирующие глюкозооксидазу, ген gox, обладают повышенной устойчивостью к мокрой бактериальной гнили, вызываемой Erwinia carotovora ssp. Carotovora, вертициллезному увяданию, вызываемому Verticillium dahliae и фитофторозу, вызываемому Phytophtora infes-tans [1, 2]. Другими авторами были получены трансгенные линии риса и капусты с геном глюкозооксидазы, которые обладали повышенной устойчивостью к некоторым бактериальным и грибным патогенам [3, 4]. Сообщается, что экспрессия глюкозооксидазы может приводить к запуску защитных механизмов растений, таких как образование активных форм кислорода [5, 6], активация защитных генов, локальная клеточная гибель [7] и гиперчувствительный ответ [8, 9], и таким образом, повышать защитные свойства растений.
Известно, что в результате гиперчувствительного ответа происходит быстрая запрограммированная гибель клеток в области внедрения патогена, продукция супероксид-аниона и пероксида водорода, образование сшивок между полимерами клеточной стенки, а также синтез вторичных метаболитов и белков с антимикробной активностью [8, 10]. Данные события блокируют распространение
авирулентного патогена. Следует отметить, что клеточная гибель наступает не вследствие токсического действия активных форм кислорода, а как результат запуска сигнальных каскадов [11].
Гиперчувствительный ответ часто сопровождается развитием приобретенной устойчивости, специфического состояния растения, во время которого оно характеризуется значительным повышением устойчивости к широкому ряду неродственных патогенов [12, 13].
Образование и аккумуляция в большом количестве пероксида водорода приводит к ряду физиологических эффектов: клеточной гибели при гиперчувствительном ответе; формированию системной приобретенной устойчивости; закрытию устьичных щелей; образованию окислительных сшивок между белками и другими полимерами растительных клеточных стенок, а также их лигнификации, в результате чего, повышаются их барьерные свойства [11, 14]. В то время как для активных форм кислорода в целом, показано ингибирующее действие на процесс клеточного деления, в случае пероксида водорода - выявлено его стимулирующее влияние на соматический эмбриогенез [15].
Пероксид водорода характеризуется и прямым антимикробным эффектом. Множество мицелиальных грибов, в первую очередь As-pergillus и Penicillium, секретируют в окружающую среду глюкозооксидазу, ингибирующую развитие других организмов [16]. Возможно также участие пероксида водорода и в непосредственном ингибировании ферментных систем патогенов, участвующих в деградации растительных клеточных стенок [1].
Таким образом, можно предположить, что
экспрессия гена глюкозооксидазы будет положительно влиять на процессы развития защитно-приспособительных реакций растений, способствующих развитию их устойчивости к разнообразным стрессовым факторам внешней среды, в том числе и к патогенным организмам.
С целью изучения влияния экспрессии гена глюкозооксидазы на образование и аккумуля-
цию пероксида водорода и усиления защитных реакций растений были созданы векторные конструкции с геном глюкозооксидазы Penicillium funiculosum и осуществлена агробак-териальная трансформация растений. Среди полученных линий растений были отобраны растения, экспрессирующие данный ген, что было доказано методом ПЦР и проверкой активности фермента глюкозооксидазы.
Материалы и методы
Фермент глюкозооксидаза. Глюкозоок-сидаза (P-D-глюкозо: 02-1-оксидоредуктаза, КФ 1.1.3.4) катализирует реакцию окисления
Р-О-глюкозы до Р-О-глюконо-б-лактона и сопряженное восстановление молекулярного кислорода до пероксида водорода (рис. 1).
Рис. 1. Реакция окисления p-D-глюкозы.
Образующийся Р-Б глюконо-5-лактон после этого подвергается спонтанному гидролизу до Р-О-глюконата (рис. 2).
Рис. 2. Гидролиз P-D глюконо-5-лактона
Молекулярная масса глюкозооксидазы P. funiculosum составляет 140±10 кДа, молекулярная масса каждой субъединицы - порядка 70кДа. Фермент обладает высокой субстратной специфичностью к P-D-глюкозе (Km = 3,3 мМ; при значении рН 7,0; 25оС). Фермент характеризуется большей pH- и температурной стабильностью, по сравнению с глюкозо-оксидазой штаммов рода Aspergillus, что, по-видимому, указывает на различия в структуре активных центров этих ферментов [17].
В качестве источника гена глюкозооксидазы (gox), в данной работе использовали штамм 46.1 P. funiculosum. Глюкозооксидаза этого штамма отличается высокой каталитической активностью при значении рН выше 6.0.
Кроме Р-Б-глюкозы, данный фермент окисляет также 2-дезокси-О-глюкозу мальтозу и галактозу [18, 19].
Трансформация агробактерий. Для проведения экспериментов по агробактериальной трансформации табака и картофеля использовали штамм Agrobacterium tumefaciens АОЬО. Агробактерии трансформировались методом замораживания-оттаивания [20]. Клетки бактерий культивировали на стандартной агари-зованной среде ЬБ при температуре 28°С. В среду добавляли антибиотики рифампицин (50 мг/л) для избирательного роста агробактерий и канамицин (50 мг/л) как селективный маркер. Отбор клонов проводился методом ПЦР. Полученные агробактериальные штаммы с не-
обходимыми плазмидами использовались для трансформации растений табака и картофеля.
Трансформация растений картофеля. Для
трансформации картофеля был выбран сорт Скарб. Молодые листья разрезали на несколько частей, на которых делали надсечки. Листовые диски выдерживали в суспензии агро-бактерий в течение 15-30 мин. Затем листовые диски отмывали в чашках Петри со стерильной Н2О и помещали на чашку с агаризованной МБ-ЬЬ (соли МБ, витамины по Морелю [21], сахароза 30 г/л, цитокинины: 2,5 мг/л БАП (6-бензиламинопурин), 1 мг/л зеатин, ауксины: 0,1 мг/л НУК (нафтилуксусная кислота), агар 7 г/л рН 5,8) в количестве 15-20 дисков на чашку. Чашки инкубировали в темноте при температуре 24° С до появления светлого агро-бактериального ореола. Затем экспланты переносили на среду МБЯ2 (соли МБ, витамины по Морелю [21], сахароза 30 г/л, 1 мг/л БАП (6-бензиламинопурин), 2 мг/л зеатин, 0,1 мг/л НУК (нафтилуксусная кислота), 0,5 мг/л кине-тин, 0,1 мг/л гибберелиновая кислота, агар 7 г/л рН 5,8) с добавлением антибиотика тимен-тина (тикарциллин+клавулановая кислота) в концентрации 200 мг/л и селективного агента (канамицина в концентрации 50 мг/л). Через 5 дней пересаживали экспланты на свежую среду с антибиотиками того же состава. Далее экспланты пересаживали, удаляя некрозы, с интервалом 10-20 дней.
Для повышения эффективности каллусоге-неза использовали контрастную стимуляцию: помещали чашки с эксплантами в темноту на 2
суток при температуре 24-25°С, переносили на неделю на свет (5000 Лк) на 25 °С с фотопериодом 16/8 часов, далее помещали чашки с экс-плантами в холодильник (+4°С) на 12 часов, снова переносили на неделю на свет (5000 Лк) на 25°С с фотопериодом 16/8 часов. Регенеран-ты срезали по достижении ими длины 1 см и высаживали на среду MS для черенкования с добавлением 200 мг/л тиментина, 1 мг/л НУК, 1 мг/л гибберелиновой кислоты и антибиотика канамицина. После 2-3 пассажей переносили на стандартную среду MS.
Трансформация растений табака. Для трансформации табака использовали линию N.tabaccum cv. Petit Havana SR. Молодые листья табака нарезали на небольшие фрагменты и помещали в чашку с разбавленной суспензией агробактерий. Чашки заворачивали в па-рафильм и 2-3 суток выдерживали в темноте при 22°C. Затем экспланты извлекали из жидкой среды и помещали на агаризованную среду CIM (соли и витамины MS, 30 г/л сахарозы, 0,2 мг/л БАП, 1 мг/л НУК, рН 5,8) с добавлением 50 мг/л канамицина и 200 мг/л тиментина. Через 2 недели проводили пересадку на агаризованную среду SIM (соли и витамины MS, 30 г/л сахарозы, 8 г/л агара, 1 мг/л БАП, 0,1 мг/л НУК, 50 мг/л канамицина, 200 мг/л тиментина, рН 5,8). Регенеранты отсаживали на агаризованную среду RIM (соли и витамины MS, 30 г/л сахарозы, 8 г/л агара, 0,05 мг/л ИУК, 50 мг/л канамицина, 200 мг/л тиментина, рН 5,8). После 2-3 пассажей регенеранты переносили на стандартную среду MS.
Результаты и обсуждение
Создание векторных конструкций с геном глюкозооксидазы. Ген gox был выделен из грибного штамма 46.1 P. funiculosum и клонирован в плазмиду pUC18 по сайтам NdeI и EcoRI. Полученная плазмида была обработана ферментами NdeI и затем Pfu ДНК-полимеразой для образования тупых концов. Затем плазмида была рестрицирована по сайту EcoRI. Плазмида pGem5Zf(+), несущая по сайту PstI вставку гена лихеназы с лидерной последовательностью экстенсина моркови под контролем CaMV 35S промотора, была обработана рестриктазами HindIII и EcoRI. Сайт узнавания рестриктазы HindIII был затуплен
Pfu ДНК-полимеразой. В полученный вектор клонирован фрагмент, содержащий ген gox. В результате получена плазмида, которая несет в одной рамке считывания лидерную последовательность секреции в апопласт и ген глюкозооксидазы P funiculosum. Это позволяет белку секретироваться в апопласт и, таким образом, защищает клетку от возможных неблагоприятных эффектов, связанных с внутриклеточной экспрессией глюкозооксидазы.
В дальнейшем полученная кассета, состоящая из лидерного пептида и гена глюкозоок-сидазы, была переклонирована в плазмиду pND706 по сайтам SalI и EcoRI. Из этой плаз-
миды вставка была вырезана рестриктазой сайтам 8ша1 и Ес113611. Полученный вектор БшаТ и клонирована в плазмиду рБ1121 по назван рБТ-Ь-вОХ (рис. 3).
Рис. 3. Схема растительного вектора рБ1121 с геном глюкозооксидазы, рБ1-Ь-вОХ.
Так же был создан вектор с промотором СаМУ 35Б, энхансером омега и геном gox. Это должно привести к увеличению уровня транскрипции гена, и таким образом, увеличить количество фермента глюкозооксидазы. Из плазмиды рСё промотор СаМУ 35Б с энхансером омега был вырезан по сайтам Бша1 и ЕсоМ и клонирован в плазмиду рБ1иевспр-
Ш КБ (+) по сайтам ЕсоЯУ и ЕсоЫ. Затем фрагмент полученной плазмиды, содержащий промотор, был переклонирован в плаз-миду рБШп по сайтам НтёШ и 8ша1. По сайту 8Ш1 клонирована кассета поБ-прИ! В полученный вектор клонирован ген gox по сайтам Бша1 и Ес113611. Полученный вектор назван рБТ-Б-ООХ (рис. 4).
Рис. 4. Схема растительного вектора рБ1121 с геном глюкозооксидазы, рБ1-Р-вОХ.
Полученные векторы были использованы для проведения агробактериальной трансформации растений табака и картофеля.
Трансформация растений. В ходе проведения агробактериальной трансформации растений картофеля сорта Скарб, было получено, 120 регенерантов с векторной конструкцией рБ1-Ь-ООХ и 80 регенерантов с векторной конструкцией рБ1-Б-ООХ, укоренившихся на среде с канамицином. В эксперименте по трансформации табака было отобрано по 10 регенерантов с каждым растительным вектором. Первичные трансформанты, проявившие способность образовывать корневую систему в присутствии канамицина, были отобраны для дальнейших исследований. Из данных растений была выделена ДНК для проведения ПЦР.
Молекулярный анализ полученных растений. С целью обнаружения вставки целевого фрагмента, гена глюкозооксидазы, была использована следующая пара праймеров: 5'-ТОАААТТООСОААОААОАСООС -3' и 5'- ТООААТТОООАСААСАТОТТСОАОТ -3', генерирующих фрагмент длиной 673 п.н.. Реакцию ПЦР проводили в буфере для Taq-полимеразы, с добавлением 0.02 мМоль каждого из ёКТР, 0.2 мкМоль каждого из праймеров, 150-200 нг ДНК картофеля либо табака и 1-2И Taq-полимеразы. Амплификация проводилась по следующей программе: 94°С - 5 мин, 30 циклов [94°С - 30 сек, 54°С - 30 сек, 72°С - 45 сек], 72°С - 7 минут. Продукты амплификации разделялись в 1,5% агарозном геле (рис. 5).
Рис. 5. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации ДНК растений картофеля, отобранных на канамицине. М - маркер молекулярного веса, 1-15 - образцы растений, проявляющих устойчивость к канами-цину, 16 - положительный контроль, плазмида с геном глюкозооксидазы. Присутствие продукта амплификации свидетельствует о наличии встроенного гена gox в геном растения.
Так же были подобраны пары праймеров для определения наличия последовательности поб-терминатора, фрагмент 180 п.н. и контрольного резидентного гена актина, фрагмент 550 п.н.,
который экспрессируется во всех растениях картофеля, и может быть использован как положительный контроль для проверки качества выделенной ДНК и проведения ПЦР (рис. 6).
Рис. 6. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации ДНК трансгенных и контрольных растений картофеля. М - маркер молекулярного веса, 1-6 - образцы трансгенных растений, 7-8 - образцы нетранс-формированных растений картофеля, 9 - положительный контроль, 10 - отрицательный контроль. Верхний фрагмент, 550 п.н. - ген актин. Нижний фрагмент, 180 п.н. поБ-терминатор.
Присутствие рекомбинантных агробакте-риальных штаммов, потенциально являющихся источником ложно-положительных результатов при ПЦР-анализе трансформантов, проверяли методом ПЦР с праймерами 5'-СОААТАСАТТСТСОТОСОТСАААСО-3' и 5'-ТТТСОАОТСАТОСАТААТОССТОАС-3', специфичными к агробактериальному гену У1гБ2, по следующей программе: 95°С - 5 мин, 30 циклов [94°С - 30 сек, 60°С - 30 сек, 72°С - 42 сек], 72°С - 7 мин. Продукты амплификации разделялись в 1,5% агарозном геле. Отсутствие ПЦР-продукта свидетельствует об отсутствии агробактерий в проводящих путях растений и, соответственно, подтверждают достоверность результатов, свидетельствующих о наличии целевых генов в геномном составе
отобранных первичных трансформантов табака и картофеля.
Таким образом, в результате молекулярно-генетического анализа, были отобраны растения, которые несут в своем геноме вставку гена gox.
Проверка активности фермента глюкозооксидазы чашечным тестом. Для доказательства того, что в растениях табака и картофеля эффективно синтезируется ре-комбинантный белок, был проведен следующий эксперимент: листья, части корней и стеблей предположительно трансгенных растений помещали на 1%-ный агарозный гель, содержащий 50 мМ йодида калия, 5% крахмала, 200 мМ D-глюкозы. В результате чего, глюкозооксидаза окисляла глюкозу и
образовывался пероксид водорода. Образование пероксида водорода регистрировали по развитию синей окраски вокруг расти-
тельных тканей [15]. Вокруг контрольных растений окрашивания не происходило (рис. 7).
Рис. 7. Определение активности гена глюкозооксидазы. Ь и Б - линии трансгенных растений,
К - контрольные растения.
Полученные результаты в ходе проведения ПЦР и чашечного теста свидетельствуют о наличии и экспрессии гена глюкозооксидазы в полученных трансгенных растениях.
В результате проведенных экспериментов было отобрано 53 растения картофеля, трансформированных вектором рБ1-Ь-вОХ и 24 растения картофеля, трансформированных вектором рБ1-Р-вОХ, что составляет 44% и 30% среди отобранных на канамицине растений. Среди рас-
тений табака было отобрано по 3 регенеранта с каждой векторной конструкцией.
Все растения, которые давали окрашивание при проведении чашечного теста, являлись положительными при проведении амплификации с праймерами к гену gox, что может свидетельствовать о высокой эффективности данного подхода при отборе трансформантов и исключить растения, в которых имеется вставка целевого гена, но экспрессия не происходит.
Заключение
Таким образом, в результате выполненной работы были созданы векторы для трансформации растений с геном глюкозооксидазы gox Р. funiculosum. В результате агробактериаль-ной трансформации табака и картофеля генетическими конструкциями получены линии трансгенных растений, в которых при помощи ПЦР обнаруживается вставка данного гена.
Активность глюкозооксидазы выявлена в растениях по способности генерировать большое количество перекиси водорода в присутствии глюкозы. Можно ожидать, что экспрессия глю-козооксидазы приведет к повышению устойчивости растений к неблагоприятным факторам и широкому ряду патогенов, что будет проверено последующими экспериментами.
Список использованных источников
1. Disease Resistance Conferred by Expression of a Gene Encoding H2O2-Generating Glucose Oxidase in Transgenic Potato Plants / Gusui Wu [et al.] // The Plant Cell. - 1995. - Vol. 7. -P. 1357-1368.
2. Activation of Host Defense Mechanisms by Elevated Production of H2O2 in Transgenic Plants / Gusui Wu [et al.] // Plant Physiology. -
1997. - Vol. 115. - P. 427-435.
3. Induction of H2O2 in transgenic rice leads to cell death and enhanced resistance to both bacterial and fungal pathogens / A. Kachroo [et al.] // Transgenic Research. - 2003. - Vol. 12. -P. 577-586.
4. Enhanced disease resistance in transgenic cabbage and tobacco expressing a glucose
oxidase gene from Aspergillus niger / Y.H. Lee [et al.] // Plant Cell Rep. - 2002. - Vol. 20. -P. 857-863.
5. Elicitor- and wound- induced oxidative cross-linking of a praline-rich plant cell wall protein: A novel, rapid defense response / D.J. Bradley [et al.] // Cell. - 1992. - Vol. 70. - P. 21-30.
6. Activation, structure and organization of genes involved in microbial defenses in plants / R.A. Dixon [et al.] // Adv. Genet. - 1990. -Vol. 28. - P. 165-234.
7. Keen, N.T. The molecular biology of disease resistance / N.T. Keen // Mol. Biol. - 1992. -Vol. 19. - P. 109-122.
8. Greenberg, J.T. Programmed cell death in plant-pathogen interactions / J.T. Greenberg // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. -
1997. - Vol. 48. - P. 25-45.
9. The role and regulation of programmed cell death in plant-pathogen interactions / J.T. Greenberg [et al.] // Cellular Microbiology. -2004. - Vol. 6. - P. 201-211.
10. Resistance gene-dependent plant defense responses / K.E. Hammond-Kosack [et al.] // Plant Cell. - 1996. - Vol. 8. - P. 1773-1791.
11. Defense activation and enhanced pathogen tolerance induced by H2O2 in transgenic tobacco / S. Chamnongpol [et al.] // Plant Biology. -
1998. - Vol. 95. - P. 5818-5823.
12. Gozzo, F. Systemic acquired resistance in crop protection / F. Gozzo //Outlooks on Pest Management. - 2004. - P. 20-23.
13. Attitalla, I. H. Biological and molecular characteristics of microorganism-stimulated
defence response in Lycopersicon esculentum
- L / I. H. Attitalla // Acta Universitatis Upsa-liensis. - 2004. - P. 1-82.
14. The involvement of hydrogen peroxide in the differentiation of secondary walls in cotton fibers / T. S. Potikha [et al.]. // Plant Physiology. - 1999. - Vol. 119. - P. 849-858.
15. Signal transduction during oxidative stress / E. Vranova [et al.] // J. of Exp. Botany. - 2002. -Vol. 53. - P. 1227-1236.
16. Isolation of the glucose oxidase gene from Talaromyces flavus and characterisation of its role in the biocontrol ofVerticillium dahliae / F.R. Murray [et al.] // Current Genetic. - 1997. - Vol. 32. -P. 367-375.
17. Стабильность и каталитические свойства глюкозооксидазы из Penicillium funiculosum G-15 / Давыдова М. Е. [и др.] // Вестник Московского Университета. - 2002.
- Т. 43. - С. 366-370.
18. Внеклеточная глюкозооксидаза Penicillium funiculosum 46.1 / Семашко Т. В. [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. -2003.- Т. 39. - С. 419-426.
19. Glucose oxidase from Aspergillus niger / K. R. Frederic [et al.] // The Journal of Biological Chemistry. - 1990. - Vol. 265. - P. 3793-3802.
20. Transfection and transformation of A. tu-mefaciens / M. Holsters [et al.] // M GG. - 1978. -Vol. 163. - P. 181-187.
21. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures / T. Murashige [et al.] // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 15. -P. 473-497.
Дата поступления статьи 23 февраля 2011 г.
