CC BY
146
УДК 635.64:577.21
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ТОМАТА №ОЬЛЫиМ ЬУСОРЕВЯЮиЫ Ь.) ГЕНАМИ ЗАЩИТНЫХ ХИТИНСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ И АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ
М.Р. ХАЛИЛУЕВ1, П.Н. ХАРЧЕНКО1, С.В. ДОЛГОВ12
(х Всероссийский НИИ сельскохозя йственной биотехнологии Россельхозакадемии, 2 Филиал института биоогранической химии имени академиков М.М. Шемя кина и Ю.А. Овчинникова РАН)
Проведена агробактериальная трансформация томата хозяйственно ценной селекционной линии ЯЛФ с целью повышения устойчивости к биотическим стрессам. В исследовании были использованы векторные конструкции, несущие растительные гены хитинсвязывающих белков (ас и Rs-intron-Shir) и антимикробных пептидов (ampl и amp2). Получены трансгенные растения томата и проведена оценка эффективности трансформации при использовании каждого из перечисленных выше генов. Интеграция чужеродных генов в растительный геном подтверждена методом ПЦР-анализа. Трансгенные регенеранты были адаптированы к условиям in vivo и выращены в условиях защищенного грунта для получения T1 поколения и последующего выделения гомозиготных линий, а также проведения испытаний на устойчивость к фитопатогенам.
Ключевые слова: томат, регенерация, агробактериальная трансформация.
Генетическая инженерия растений явля ется составной частью современной с.-х. биотехнологии и в настоя щее время находит все большее практическое применение для получения ценных генотипов, обладающих новыми или улучшенными агрономическими характеристиками. Применение трансгенных форм растений позволяет существенно повысить окупаемость с.-х. производства, резко сократить загря знение окружающей среды пестицидами, а также, во многих слу-ча х, реализовать потенциальную урожайность растений.
Устойчивость к биотическим стрессам и, в частности, к грибным и бактериальным патогенам — одно
из приоритетных требований, предъявляемых к современным сортам и гибридам томата. Несмотр на достигнутые успехи в получении генотипов с повышенной устойчивостью к отдельным болезням, проблема комплексной устойчивости к неблагопри тным факторам биотической природы по-прежнему остается неразрешенной. Это относится также и к наиболее опасным болезня м, таким как фитоф-тороз и ря ду других, поражение которыми в годы эпифитотий вызывают существенные потери урожая (60% и более) и снижение качества товарной продукции [2]. Причинами отсутствия решени данной проблемы вл етс генетическая сложность признака,
постоя нные эволюционные процессы в системе хозяин — патоген, а также возникновение высоковирулентных
биотипов патогенов на фоне применения повышенных объемов х имических средств защиты.
Классический селекционно-генетический путь повышения устойчивости растений к болезн м основан на передаче растени м культурного сорта новых генов путем их скрещивания с дикими формами. Однако этот подход трудоемок, требует многолетней работы и ограничен возможно-ст ми близкородственного скрещивания. Методы генетической инженерии позволя ют интегрировать в хромосомы растительной клетки гены любого происхождения (других растений, животных, насекомых, бактерий, вирусов). Установление молекулярной природы защитных механизмов у растений дало возможность разработать новые стратегии борьбы с заболевани ми в дополнение к существующим традиционным подходам. Одной из них вл етс привнесение в геном растений и, в частности, томата чужеродных генов, кодирующих защитные PR-белки (pathogenesis-related protein) и антимикробные пептиды.
В настоящее время различают 14 классов растительных PR-белков и 9 классов антимикробных пептидов по сходству аминокислотных последовательностей, биохимическим характеристикам, биологической активности и клеточной локализации [3, 11, 12]. Все защитные белки и пептиды харак-теризуютс сравнительно небольшим размером, являются положительно заряженными, содержат значительное количество остатков цистеина, стабилизирующих третичную структуру за счет образовани бисульфид-ных св зей, число которых в зависимости от вида составл ет от 2 до
8. Эти классы включают как индуцируемые, так и конститутивные формы белков. В качестве индукторов могут
выступать компоненты клеточного метаболизма, например, гормоны и органические кислоты [5, 10]. Следует отметить, что в процессе развития растения один и тот же PR-белок или антимикробный пептид может обра-зовыватьс в специфичных ткан х, а также накапливаться в других тканя х в ответ на воздействие патогена.
В результате многочисленных исследований было установлено, что многие представители PR-белков и антимикробных пептидов в микро-мол рных концентраци х про вл -ют высокую активность в услови х in vitro против ряда бактериальных и грибных фитопатогенов, которая сравнима с применением химических препаратов [3, 5, 12]. Некоторые из них не оказывают токсического воздействия на клетки животных и человека, что явля ется весьма важным аспектом в отношении биобезопасности трансгенных растений.
В последние годы в литературных источниках по вл етс все большее число сообщений об успешной интродукции генов защитных белков и антимикробных пептидов в геном томата. Однако описанные эксперименты проводились преимущественно на модельных образцах, не пред-ставл ющих коммерческого значени . Целью нашего исследования явля -лось получение трансгенных растений томата, обладающего хозяйственно ценными признаками и содержащего гены защитных хитинсв зывающих (PR-4) белков и антимикробных пептидов, для повышения устойчивости к грибным и бактериальным фитопатогенам.
Материалы и методы
Растительный материал. В качестве растительного материала дл экспериментов была использована перспективна селекционна лини томата ЯЛФ, полученная из сорта Ямал и использующаяся в качестве отцовской линии при получении гиб-
рида F1 Юниор (любезно предоставлена Г.Ф. Монахосом). Для введения томата в культуру in vitro использовали семена, которые подвергали поверхностной стерилизации в течение 30 с в 70%-м этаноле, а затем 7-8 мин в 20%-м водном растворе коммерческого препарата «АСЕ» с добавлением
0,01% детергента Tween 20. Стерилизованные семена 3-4 раза промывали автоклавированной дистиллированной водой и помещали в культуральные сосуды с питательной средой, составленной по прописи Мурасиге-Скуга (MS) [8] и содержащей 3% сахарозы и 0,7% агара. Растения и эксплан-ты культивировали при температуре 23$25°С, освещенности 2500 лк и фотопериоде 16/8 ч (день/ночь).
Генетическая трансформация.
Дл генетической трансформации томата были использованы бинарные векторы, содержащие гены хитин-св зывающих белков и антимикробных пептидов, сконструированные во ВНИИ сельскохозя йственной биотехнологии Россельхозакадемии и любезно предоставленные А.В. Бабаковым, В.Г. Луниным и А.А. Гулевичем (рис. 1). Бинарные векторы pBI121ac и pR830 содержат соответственно хи-тинсвя зывающий ген ас из Amaran-thus caudatus и гибридный ген RS-intron-Shir, кодирующий сигнальную последовательность и первые шесть аминокислот дефензина редьки (Rs) c интроном, и хитинсвя зывающий белок из Amaranthus retraflexus (Shir). Бинарный вектор pB-AMP2 содержит ген amp2, кодирующий лидер-ный пептид, два антимикробных пептида (SmAMP1 и SmAMP2), разделенных спейсером, и С-концевую часть из звездчатки (Stellaria media). В отличие от pB-AMP2, несущего полную копию кДНК гена звездчатки, pB-AMP1 содержит ген ampl, кодирующий только лидерную последовательность и один из антимикробных пептидов (SmAMP1). Плазмиды с генами хитинсвязывающих белков и
антимикробных пептидов были интро-дуцированы в обезоруженные супер-вирулентные штаммы ЛдтоЪа^етшт tumefaciens СВЕ21 и AGL0 соответственно. Все целевые гены находились под контролем сильного конститутивного промотора 35Б РНК вируса мозаики цветной капусты (СаМУЗББ). Дл отбора трансгенных растений векторные конструкции содержали селективный ген прШ, обусловливающий устойчивость к антибиотику канамицину.
Эксперименты по трансформации растений томата проводили методом кокультивации эксплантов с суспензией агробактерии. Ночную культуру агробактерии наращивали в 20 мл жидкой среды Лурия-Бертани (ЬВ) [9], дополненной соответствующими селективными антибиотиками, на качалке (180 мин-1) в течение 24 ч при 28°С в темноте. Затем ее разбавляли жидкой средой МБ, не содержащей фитогормонов, до финальной концентрации, соответствующей оптической плотности, равной 0,4-0,6. Полученную суспензию примен ли дл инфи-цировани эксплантов.
В экспериментах по трансформации использовали семя доли 12-дневных проростков. За трое суток до ин-фицировани экспланты помещали
на агаризованную питательную среду МБ, дополненную 5 мг/л 6-бензила-минопурина (6-БАП) и 0,1 мг/л ин-долилуксусной кислоты (ИУК). После этапа прекультивации у сем долей отсекали небольшую часть у основания и верхушки, а на абаксиальную поверхность наносили 2-5 поперечных надсечек, после чего переносили в подготовленную бактериальную суспензию и, периодически перемешивая , выдерживали в течение 30 мин. Подсушенные на воздухе эксплан-ты переносили на бумажные фильтры, помещенные на поверхность чашки Петри со средой МБ, и ко-культивировали в темноте при температуре 18°С в течение 48 ч. После
Рис. 1. Карты бинарных векторов pBI121 ас, pR830, pB-AMP1 и pB-AMP2: T-DNA left, right border — левая и правая фланкирующие последовательности Т-ДНК;
NOS и pAnos — промотор и терминатор гена нопалинсинтазы; CaMV35S и pA35S — промотор и терминатор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; ас, RS-intron-Shir, amp1 и amp2 — целевые гены; nptII — ген неомицинфосфотрансферазы II; nptIII — ген неомицинфосфотрансферазы III; ori V — сайт инициации репликации
периода кокультивации сем доли отмывали жидкой средой МБ с добавлением 300 мг/л тиментина (тикар-циллин + клавулановая кислота) для элиминации агробактерии и переносили на питательную среду МБ, дополненную 5 мг/л 6-БАП, 0,01 мг/л ИУК и 300 мг/л тиментина, для кал-лусо- и морфогенеза. В последующих пассажах для отбора трансгенного каллуса в состав питательной среды вводили селективный антибиотик
канамицин в концентрации от 10 до 25 мг/л. Длительность каждого пассажа составля ла 15 дней. По достижении регененерирующих предположительно трансгенных побегов размера
1,5 см их отделя ли от каллусной ткани и переносили на среду дл ризогене-за, содержащую 1/2 дозы макросолей от прописи МБ, 2% сахарозы, 0,7% агара, 0,2 мг/л индолилмасля ной кислоты и канамицин в концентрации 50 и 100 мг/л.
Молекулярно-генетический анализ. Выделение тотальной геномной ДНК из предположительно трансгенных растений осуществляли по методике Edwards с соавт. [6] с дополнительной экстракцией фенолом. Подтверждение интеграции чужеродных генов проводили с помощью ПЦР-анализа. Интеграцию в растительный геном селективного гена nptII определяли при помощи следующей пары праймеров: 5'-CGCGGGTTTCTGGAGTTTAAT-GAGCTAAG-3' и 5-GCATGCGCGC-CTTGAGCCTGG-3'; ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента — 742 п.н. Для идентификации присут-стви гена ас использовали праймеры к последовательности промотора CaMV35S (5'-CTGCCGACAGTGGTC-CCAAAGATGGACCC-3') и целевого гена (5'-TTGAACACATTCACCAACT-CCCATAGAT-3'). Дл амплификации последовательности гена Rs-intron-Shir использовали олигонуклеотиды на лидерную часть гибридного гена (5'-CTCTCTTCTAGAATGGCTAAGT-TTGCTTCTATCGTC-3') и терминатора pA35S (5'-TGTCACTGGATTTTG-GTTTTAGGAA-3'). Размеры ампли-фицируемых фрагментов составл ли соответственно 300 и 1050 п.н. Интеграцию генов антимикробных пептидов определ ли при помощи пары праймеров 5'-TCATTCCATAGACTT-GTTTATGA-3' и 5'-CTTACATACAA-AAGCTAGTCAC-3'. Размеры ампли-фицируемых фрагментов у образцов, трансформированных конструкцией рВ-АМР1 и рВ-АМР2, составляли соответственно 445 и 765 п.н. Реакцию проводили на амплификаторе MJ Mini™ Personal Thermal Cycler (BioRad, США). Продукты ПЦР-анализа раздел ли в электрофорезной камере фирмы Hoeffer (США) в 1%-м агарозном геле с добавлением этидиум бромида. Визуализацию продуктов амплификации осуществл ли в проход щем ультрафиолетовом свете трансиллюминатора. Размеры ампли-фицированных фрагментов опреде-
ляли, используя в качестве маркера GeneRulerTM100 bp Plus DNA ladder (Fermentas).
Результаты и их обсуждение
В рамках исследовани была проведена сери экспериментов по трансформации томата методом кокуль-тивации с использованием Agrobacterium tumefaciens. Одним из основных этапов генетической трансформации вл етс эффективна доставка векторных конструкций в клетки-мишени, компетентные к регенерации растений. Проникновение чужеродной ДНК вызывает повреждения в клетке-хозяине, что обусловливает существенное снижение степени выживаемости растительной ткани. Кроме того, высокая чувствительность эксплантов томата к селективным агентам влечет за собой существенную потерю морфогенетического потенциала в результате ингибировани закладки регенерационных зон даже у трансгенных клеток [1]. В св зи с этим нами была использована стратеги постепенной адаптации эксплан-тов к селективному агенту, исключающая их шок и массовую гибель (первый пассаж без канамицина, второй — 10 мг/л, третий и последующие — 25 мг/л). После инфици-ровани бактериальной суспензией и кокультивировани экспланты помещали на среду дл каллусообразова-ния и регенерации, в результате чего в конце пассажа по края м срезов и в местах поранений наблюдалось формирование светлой плотной каллус-ной ткани. Отмечено, что эксплан-ты, трансформированные бинарными векторами, несущими гены хитин-связывающих белков ас и Rs-intron-Shir, отличались меньшей способностью к формированию каллуса по сравнению с семядоля ми, трансформированными рВ-АМР1 и рВ-АМр2 (таблица).
Несмотр на относительную легкость получени каллусных тканей,
Эффективность каллусообразования и селекции эксплантов семядолей при трансформации генетическими конструкциями, несущими гены хитинсвязывающих белков и антимикробных пептидов
Бинарный вектор Количество эксплантов
общее образовавших каллус погибших прошедших селекцию
шт. % шт. % от бактерии от канамицина шт. %
шт. % шт. %
рВ1121ас рР830 рВ-АМР2 рВ-АМР1 90 120 125 115 100 100 100 100 58 69 109 96 64.4 57.5 87,2 83.5 19 7 38 30 21,1 5,8 30,4 26,1 65 103 70 72 6587 ,,,, 6082 6 10 17 13 6,7 8,4 13,6 11,3
регенерация из них полноценных трансгенных побегов оказалась более трудной задачей. После переноса эксплантов на питательную среду с добавлением 10 мг/л селективного антибиотика происходило снижение интенсивности нарастани каллусных тканей, их частичная некротизация, причем степень ее значительно усиливалась при возрастании концентрации канамицина в последующих пассажах. Побеги, регенерировавшие на ранних этапах культивировани , впоследствии про вл ли признаки хлороза и не были трансгенными. В то же время на образовавшейся кал-лусной ткани некоторых эксплантов происходило формирование плотных зеленых глобул рных меристемати-чески активных участков, не проя в-л ющих признаков отрицательного воздействи селективного агента и интенсивно нарастающих на среде, содержащей канамицин в концентрации, летальной для нетрансгенной ткани (25 мг/л). Тем не менее, высока чувствительность эксплантов и каллуса к селективному антибиотику вл лась причиной гибели большей части растительной ткани, которая в зависимости от генетической конструкции составила от 56,0 до 85,8%. Кроме того, во всех экспериментах наблюдалась бактериальна контаминация части эксплантов, которая
также служила причиной исключе-ни их из дальнейшего культивиро-вани .
Вынужденное длительное культивирование растительных тканей на питательных средах с целью получения регенерантов, устойчивых к кана-мицину, способствовало постепенному накоплению веществ токсического действи (фенольных соединений), что приводило к формированию растений с измененной морфологией. Наблюдались такие нежелательные эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных побегов и, как следствие, уменьшение или полна потер способности регенерантов к укоренению. О механизмах витри-фикации и нарушени х нормального развити растений в культуре ткани единого мнени нет. Одни исследователи в качестве причины называют высокий водный потенциал агаризо-ванной среды, другие — длительное использование высоких концентраций цитокининов [4, 7].
В результате экспериментов по генетической трансформации бинарными векторами рВ1121ас, рИ830, рВ-АМР2 и рВ-АМР1 получено соответственно 6, 10, 17 и 13 независимых побегов, интенсивно и полноценно развивающихс из каллусной ткани. Полученные регенеранты фор-
мировали х орошо развитую корневую систему на среде дл я укоренения, дополненной 100 мг/л канамицина, и были признаны как предположительно трансгенные.
Для подтверждения интеграции целевого и маркерного генов в геном томата был проведен ПЦР-анализ. На
рисунках 1, 2 представлены электро-фореграммы разделения продуктов амплификации геномной ДНК предположительно трансгенных растений. При амплификации с использованием специфических праймеров на последовательность гена ирШ были получены фрагменты, соответствующие
А)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Б)
Рис. 2. Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК регенерантов томата, трансформированных конструкциями с генами хитинсвязывающих белков, на наличие фрагмента маркерного (А) и целевого (Б) генов при помощи ПЦР-анализа: 1 — молекулярный маркер; 2 — вода; 3 — отрицательный контроль (дикий тип); 4-9 — регенеранты томата, трансформированные конструкцией рВ1121ас; 11-20 — регенеранты томата, трансформированные конструкцией рР830; 10, 21 — положительный контроль (плазмиды рВ1121ас и рР830)
Рис. 3. Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК регенерантов томата, трансформированных конструкциями с генами антимикробных пептидов, на наличие фрагмента маркерного (А) и целевого (Б) генов при помощи ПЦР-анализа: 1 — молекулярный маркер; 2 — вода; 3 — отрицательный контроль (дикий тип); 4-16 — регенеранты томата, трансформированные конструкцией рВ-АМР1; 18-34 — регенеранты томата, трансформированные конструкцией рВ-АМР2; 17, 35 — положительный контроль (плазмиды рВ-АМР1и рВ-АМР2)
позитивному контролю (плазмидные ДНК) во всех случаях. Интеграция целевых генов ас, Rs-intron-Shir и ampl, как и в случае маркерного гена, показана во всех проанализированных образцах. Полноразмерная копия кДНК гена Stellaria media, ин-тергрированна в геном томата при трансформации бинарным вектором pB-AMP2, отмечена только у 11 из 17 независимо регенерированных побегов. Кроме того, у всех изученных образцов была проведена проверка препаратов тотальной ДНК на отсутствие бактериального гена virB с целью исключения ложноположительных
результатов вследствие бактериальной контаминации. Таким образом, эффективность трансформации при использовании векторных конструкций pBI121ac, pR830, pB-AMp2 и pB-AMP1 составила соответственно 6,7; 8,4; 8,8 и 11,3%.
Трансгенные регенеранты были адаптированы к услови м in vivo и выращены в условиях защищенного грунта для получения T1 поколения и последующего выделени гомозиготных линий, а также проведения
испытаний на устойчивость к фитопатогенам.
Заключение
В рамках исследования была проведена агробактериальная трансформация хозяйственно ценной селекционной линии ЯЛФ при использовании генетических конструкций, содержащих гены растительных хитинсвязывающих белков (ас и Яз-т^ои-ЗЫт) и антимикробных пептидов (атр1 и атр2). Нами было получено 6, 10, 11 и 13 растений, трансформированных соответственно конструкциями рВ1121ас, рИ830, рВ-АМР2 и рВ-АМР1, с подтвержденной интеграцией целевого и маркерного генов методом ПЦР. Эффективность трансформации эксплантов семядолей составила соответственно 6,7; 8,4; 8,8 и
11,3%. Трансгенные растения успешно адаптированы к почвенным услови м; в услови х защищенного грунта получено семенное поколение Т1 р да растений дл выделени гомозиготных линий и проведени испытаний на устойчивость к фитопатогенам.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ № 08-0412203.
Библиографический список
1. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф. и др. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. Пер. с англ. Под ред. Дж. Дрейпера, Р. Скотта, Ф. Армитиджа, Р. Уолдена. М., 1991.
2. Уланова Т.И., Еланский С.Н., Филиппов А.В. и др. Устойчивость к фито-
фторозу некоторых перспективных линий диких Lycopersicon hirsutum // Журнал Российского фитопатологического общества, 2003. № 4. С. 9-15.
3. Broekaert W.F., Cammue B.P.A., De Bolle M.F.C. et al. Antimicrobial peptides from plants. // Crit. Rev. in Plant Sci., 1997. V. 16. № 3. P. 297-323.
4. Curtis O.F., Shetty K. Growth medium effects on vitrification, total phenolics, chlorophyll, and water content of in vitro propagated oregano clones. // Acta Horticuet., 1996. V. 426. P. 498-503.
5. Edreva A. Pathogenesis-related protein: research progress in the last 15 years. // Gen. Appl. Plant Physiol., 2005. V. 31. P. 105-124.
6. Edwards K., Johnstone C., Thompson C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis // Nucleic Acids Res., 1991. V. 19.
7. Kamal G.B., Karlov G.I., Asadollah A. Effects of genotype, explant type and nutrient medium components on canola (Brassica napus L.) shoot in vitro organogenesis // Afr. J. of Biotech., 2007. V. 6. Р. 861-867.
8. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant., 19б2. V. 15. P. 473-497.
9. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989.
10. Theis T., Stahl U. Antifungal proteins: targets, mechanisms and prospective applications // Cell. Mol. Life Sci., 2004. V. б1. P. 437-455.
11. Van Loon L.C. Pathogenesis-related proteins // Plant Molec. Biol., 1995. V. 4. P. 111-11б.
12. Van Loon L.C., Rep M., Pieterse C.M.J. Significance of Inducible Defense-
related Proteins in Infected Plants // Annu. Rev. Phytopathol., 200б. V. 44.
P. 135-1б2.
Рецензент — д. б. н. Л.И. Хрусталева
SUMMARY
Agrobacterial transformation of commercial tomato line YALE has been conducted to improve resistance to biotic stress. Binary vectors carrying genes of plant chitin-binding proteins (ac and Rs-intron-Shir) and antimicrobial peptides (amp 1 and amp 2) were used. Transformation efficiency of obtained transgenic tomato plants is estimated on each of above-mentiones genes. Integration of foreign genes into tomato genome is confirmed by PCR analyses. Transgenic regenerants have been adapted in vivo and grown in greenhouse to obtain T1 progeny and subsequent isolation of homozygous lines, as well as for carrying out tests on plant pathogen resistance.
Key words: tomato, regeneration, agrobacterial transformation.
Халилуев Марат Рушанович — Эл. почта: marat131084@rambler.ru Харченко Петр Николаевич — д. б. н. Тел. (499) 976-65-44.
Долгов Сергей Владимирович — к. с.-х. н. Тел. (499) 976-90-05.
