CC BY
16
НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2011. № 2 (5). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК
ПОДБОР РЕАГЕНТОВ
ДЛЯ ЭЛЮЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ С МАГНОИММУНОСОРБЕНТНОЙ МАТРИЦЫ ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕЙ ПОСТАНОВКИ ИНДИКАЦИОННЫХ АНАЛИЗОВ
Ю.Ю. Гаркуша, И.В. Жарникова, И.С. Тюменцева, Е.Н. Афанасьев, Е.В. Жданова, С.А. Курчева ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, г. Ставрополь
Нами разработаны магноиммуносорбенты (МИС), обеспечивающие селективное концентрирование возбудителя туляремии, присутствующего в водных объектах окружающей среды в низких концентрациях, не позволяющих его обнаружить известными методами лабораторного исследования.
Иммуноферментный анализ (ИФА) можно проводить без элюции антигена (Аг) с иммобилизованной магнитной матрицы, а, например, реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакцию агглютинации латекса (РАЛ) - только с элюированным Аг.
Цель исследования - подбор эффективных реагентов, позволяющих максимально извлекать Аг с иммобилизованной матрицы с сохранением его активности.
В работе использованы штаммы туляремийного микроба из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» ФГУЗ «СтавНИПЧИ» Роспотребнадзора: F.tularensis Мшга, F.tularensis 890-Аз, F.tularensis Schu, F.tularensis 543/6, F.tularensis 15 НИИЭГ, F.tularensis 503/840. При разработке иммобилизованных препаратов применяли алюмосиликат, окись железа (II). Модификаторами сорбентов являлись декстран (поли-глюкин) и натрия перхлорат. В работе использовали тест-системы иммуноферментные и наборы реагентов для постановки РНГА, РАЛ производства ФГУЗ «СтавНИПЧИ» Роспотребнадзора.
Первоначально проанализированы физико-химические закономерности взаимодействия антиген-антитело (Аг-Ат). Антигенные детерминанты взаимодействуют с активным центром антител, имеющих определенную аминокислотную последовательность, образуя прочные нековалентные связи. В связи с этим не-
обходимо подобрать элюирующие растворы, разрушающие связь Аг с Ат и сохраняющие активность Аг. Для элюирования используют буферные растворы с низким рН, а также растворы, содержащие гуанидин-НС1 или мочевину. Концентрированные солевые растворы, например 3 М №С1, не относят к специфическим элю-ентам, но они могут быть использованы для ослабления электростатических взаимодействий между Ат и иммобилизованным на носителе Аг.
При приготовлении МИС, сорбции и элюирова-нии необходимо иметь в виду высокую лабильность Ат в присутствии денатурирующих агентов. Для элюции Аг с магноиммуносорбентной матрицы нами апробирован органический растворитель - ацетонитрил (С2Н^) с молекулярной массой 41,05 г/моль, разрушающий иммунокомплекс Аг-Ат. Предварительно проверив его при постановке РНГА, РАЛ на предмет возможности давать ложноположительный результат и получив хорошие показатели, провели элюцию Аг следующим образом: после инкубации МИС со взвесью туляремийного микроба в концентрации 1х106 м.к./мл и отмывки от несвязавшегося Аг вносили 0,5 мл аце-тонитрила на 20 мин, сливали надосадок, представляющий собой элюированный Аг, доводили рН до 6-7. Далее проводили постановку РНГА, РАЛ. Установлено, что Аг туляремийного микроба выявлялся в реакциях в концентрации 1,25х105 м.к./мл.
Таким образом, для постановки РНГА и РАЛ после селективного концентрирования возбудителя туляремии из объектов окружающей среды целесообразно проводить элюирование патогена с магнитной иммунной матрицы, используя ацетонитрил.
СРЕДА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АЛКИЛСУЛЬФАТАЗЫ У LISTERIA MONOCYTOGENES
Г.Г. Шубин, О.В. Дуванова, Г.Л. Карбышев, А.Н. Терентьев, С.О. Водопьянов ФГУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт»
В настоящее время листериоз представляет собой актуальную медико-социальную проблему по причине широкой распространенности возбудителя и ряда трудностей в диагностике заболеваний. В дополнение
к бактериологическим методам диагностики листери-оза в практику введены ПЦР, ИФА, сконструированы листериозные антигенный и антительный полимерные диагностикумы. Дальнейшее изучение биохими-
ЭПИДЕМИОЛОГИЯ, ЭКОЛОГИЯ, СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА, ПРОФИЛАКТИКА
ческих особенностей возбудителя представляет интерес. В частности, в литературе в настоящее время отсутствуют сведения об алкилсульфатазной активности у листерий. Учитывая способность возбудителя длительное время выживать во внешней среде (вода, почва), изучение гидролиза додецилсульфата натрия (лау-рилсульфата натрия, SDS) позволит оценить возможное поведение микроорганизма в условиях техногенного загрязнения.
Проблема биологической деструкции широко применяемых в быту и промышленности поверхностно-активных веществ (ПАВ), в число которых входит и анионное поверхностно-активное вещество SDS, издавна привлекает внимание исследователей. Способность разрушать SDS благодаря наличию фермента ал-килсульфогидролазы (алкилсульфатазы) выявлена у многих микроорганизмов. Недавно предложен способ дифференциации штаммов Vibrio cholerae О139 серо-группы по алкилсульфатазной активностии с использованием новой синтетической среды.
Цель работы состояла в изучении способности штаммов Listeria monocytogenes различного происхождения и разных серотипов гидролизовать SDS c использованием сконструированной плотной среды.
Материалы и методы. В работе использованы штаммы L.monocytogenes серотипов 1/2а, 1/2б, 3а, 4а, 4б, 5, 7 из коллекции Ставропольского научно-исследовательского противочумного института, а также вакцинный штамм АУФ (ФГУП «Ставропольская биофабрика», Ставрополь).
Способность гидролизовать SDS изучали на плотной среде для выделения и культивирования листерий (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), которая включала: 2 % хлористого натрия, 0,002 % бромтимо-лового синего и 0,1 % SDS «BioChemica» (Германия)
(рН 7.2). Посевы «пятачками» на поверхность среды осуществляли петлей из агаровых культур. Чашки инкубировали при 20оС в течение 24-72 часов, периодически просматривая в проходящем свете. При наличии у испытуемых штаммов способности гидролизовать SDS вокруг посевов появлялись четкие мутновато-белые зоны диаметром 2-7 мм.
Результаты исследования. Отсутствие метода обнаружения алкилсульфатазной активности инициировало конструирование и апробацию нами среды, которая бы позволяла быстро, легко и наглядно выявлять фермент у штаммов Listeria monocytogenes различного происхождения. В результате проведенного исследования у всех взятых в исследование штаммов Listeria monocytogenes обнаружена способность гидролизовать SDS, что выражалось в появлении вокруг макроколоний вибрионов непрозрачных мутновато-белых зон от 2 до 7 мм за счет деструкции додецилсульфата натрия с образованием нерастворимого в воде додеканола-1.
Таким образом, сконструированная среда может быть использована для выявления алкилсульфатазной активности у штаммов Listeria monocytogenes. С ее использованием различий по способности штаммов гидролизовать SDS в зависимости от их происхождения и серовара не установлено. Представляется интересным в дальнейшем исследовать алкилсульфа-тазную активность у большего числа штаммов различного происхождения с другими фено- и генотипи-ческими характеристиками. Можно предположить, что наличие алкилсульфатазы у листерий обеспечивает им конкурентоспособность и возможность адаптации в различных экологических условиях, особенно в случаях антропогенного загрязнения окружающей среды.
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ТУЛЯРЕМИИ В НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ
Л.В. Самойлова, Ю.А. Юрченко*, А.П. Федянин, Т.В. Каримова*, Е.С. Пудова Управление Роспотребнадзора по Новосибирской области, *ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Новосибирской области»
В 2010 г. в России после нескольких лет благополучия отмечается рост заболеваемости туляремией в 2,2 раза. Зарегистрировано 115 случаев туляремии (в 2009 г. - 57) на территории 23 субъектов Российской Федерации.
В 2010 г. в области была зарегистрирована резкая активизация крупнейшего за последние 20 лет природного очага туляремии. Отмечается взрывообразный подъем численности околоводных видов грызунов -водяной полевки и полевки-экономки, которые являются естественными резервуарами туляремии в природе. Это, в свою очередь, незамедлительно привело к заболеваемости населения - в августе - декабре 2010 г. зарегистрировано 22 случая туляремии.
Цель исследования - изучение особенностей эпидемического процесса туляремии на территории Новосибирской области на современном этапе.
Материалы и методы. В рамках ведомственной целевой программы «Стоп инфекция» организован и проводится эпидемиологический надзор за природно-очаговыми инфекциями, в том числе туляремией: мониторинг за объектами внешней среды, оперативный и ретроспективный эпидемиологический анализ эпидемиологической ситуации, контрольно-надзорные мероприятия за лечебно-профилактическими учреждениями.
Результаты. Новосибирская область является эн-зоотичной территорией по туляремии. Регистрация заболеваемости туляремией в области ведется с 1929 г.
