CC BY-ND
20
40
ЗНиСО июль IW (304)
© Гаркуша Ю.Ю., Тюменцева И.С., Курчева С.А., Старцева О.Л., Жарникова И.В., Кошкидько А.Г., Геогджаян А. С., 2018
УДК 57.088.2:006.015.5: 57.083.12
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ ОСНОВНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КАЧЕСТВА СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА МАГНОСОРБЕНТА
Ю.Ю. Гаркуша, И.С. Тюменцева, С.А. Курчева, О.Л. Старцева, И.В. Жарникова, А.Г. Кошкидько, А.С. Геогджаян
ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт» Роспотребнадзора, ул. Советская, 13—15, г. Ставрополь, 355035, Росси
Представлены материалы по изучению стабильности основных показателей качества пяти экспериментальных серий стандартного образца магносорбента ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт» Роспотребнадзора (рег. № 007-9388-2015).
Установлено сохранение стабильности характеристик СО МС без изменения внешнего вида и потери адсорбционной активности в течение всего срока наблюдения. Применение стандартного образца магносорбента в качестве магнитной матрицы позволит оптимизировать технологический процесс производства, получая точные и сопоставимые результаты, значительно повысив биологические характеристики разрабатываемых новых или выпускаемых магноиммуно-сорбентных диагностических препаратов.
Результаты проведенных исследований по стабильности аттестуемых характеристик в процессе хранения позволяют рекомендовать гарантийный срок хранения СО Мс - 3 года. Ключевые слова: стандартный образец, магнитные сорбенты, стабильность.
Yu.Yu. Garkusha, I.S. Tyumentseva, S.A. Kurcheva, O.L. Startseva, I.V. Zharnikova, A.G. Koshkid'ko, A.S. Geogdzhayan □ DETERMINATION OF STABILITY OF THE MAJOR QUALITY PARAMETERS OF MAGNOSORBENT STANDARD SAMPLE □ Stavropol Antiplague Institute of Rospotrebnadzor, 13-15, Sovetskaya str., Stavropol, 355035, Russia.
The article presents the materials on the study of stability of the major quality parameters of five experimental series of standard sample of magnosorbent from Stavropol Antiplague Institute of Rospotrebnadzor (registration No. 007-9388-2015). Persistence of stability of the magnosorbent standard sample parameters has been confirmed, without changes in appearance and without loss of absorption intensity through the whole period of observations. Applying a standard sample of magnosorbent as a magnetic matrix will allow to optimize the production process obtaining precise and comparable results, considerably improving the biological parameters of newly-developed or already produced magnoimmunosorbent products for diagnostics.
The results of the performed study of stability of the assessed parameters in the process of storage allow to recommend a 3-year warranty shelf life of the magnosorbent standard sample. Key words: standard sample, magnetic sorbents, stability.
Магнитная сепарация клеток становится С целью оптимизации производства магно-
стандартным и широко используемым методом, иммуносорбентных диагностических препара-
дающим надежные и воспроизводимые резуль- тов была проведена работа по изготовлению
таты, применяемым как для научных и сани- стандартного образца магносорбента (СО МС), тарно-эпидемиологических исследований, так и предназначенного для конструирования МИС.
в лабораторной практике для диагностики ин- Приготовление СО МС проводили по ранее раз-
фекционных болезней там, где требуется высо- работанной методике, заключающейся в фор-
кочувствительная детекция микроорганизмов в мировании структуры носителя в присутствии сложных контаминированных и загрязненных органического полимера [1, 8]. Использование
ингибиторами образцах с низкой концентраци- СО МС в качестве магнитной матрицы МИС
ей патогена [2, 5, 7]. при разработке новых или выпуске коммерчес-
Исследования в этой области способствова- ких МИБП значительно повысит их биологиче-
ли внедрению в практику магноиммуносор- ские характеристики и, как следствие, досто-
бентных (МИС) препаратов, основанных на ис- верность результатов проводимых лаборатор-
пользовании магнитных сорбентов с антитела- ных исследований.
ми, маркерными белками, либо иными лиган- Оценка эффективности и стабильности ос-
дами, иммобилизованными на их поверхности. новных показателей качества необходима для
Сорбенты чаще всего изготавливают из раз- внедрения разработанного препарата в практику,
личных полимерных материалов, таких как ок- так как является одним из требований, предъ-
сид кремния, агароза, полистирол, хитин, вер- являемых к стандартным образцам МИБП [5, 6]. микулит и др. Особую нишу среди материалов, Цель исследования - определение стабиль-
используемых для изготовления сорбентов, за- ности основных показателей качества стандарт-нимают кремнеземы, которые представляют ного образца магносорбента ФКУЗ «Ставрополь-
собой морфологически совершенные жесткие ский противочумный институт» Роспотребнадзора. мезопористые каркасные структуры. Введение Материалы и методы. Стандартный обра-
в состав кремнеземных сорбентов оксидов ме- зец магносорбента ФКУЗ «Ставропольский про-таллов придает дополнительные свойства их тивочумный институт» Роспотребнадзора (рег.
поверхностным структурам, а их частицы при- № 007-9388-2015) представляет собой смесь алю-
обретают магнитный потенциал [1, 3, 8]. миния метасиликата и оксида железа (II), моди-
июль IW (304) ЗНиСО
49
фицированную 6 % коллоидным раствором декс-трана с молекулярной массой 60 ООО ± 10 ООО в 0,9 % растворе натрия хлорида и активированную натрием периодатом. Поверхность частиц СО МС содержит активные функциональные группы, способные к иммобилизации IgG в количестве 1О мг на 1,О г сорбента. Один флакон СО МС рассчитан на изготовление 4,О мл 1О % взвеси МИС.
Для определения специфической активности препаратов, сконструированных с применением иммобилизованного СО МС, был использован набор реагентов тест-система имму-ноферментная магноиммуносорбентная для выявления возбудителя туляремии («ИФА-МИС-Тул-СтавНИПЧИ») № РЗН 2О13/429.
Основным показателем, характеризующим эффективность сорбентов, является их адсорбционная емкость; эффективность процесса адсорбции оценивали по степени извлечения IgG из водной суспензии МС.
Для определения стабильности препаратов использовали два вида испытаний: ускоренные и долгосрочные (в реальном времени) [4].
Сущность классического метода (долговременной стабильности) заключается в том, что испытуемые образцы выдерживают при постоянной температуре рекомендованного хранения в течение периода, перекрывающего предполагаемый срок годности. Через определенные промежутки времени оценивают стабильность установленных параметров хранящегося образца. На основании окончательных результатов анализа делают заключение об оптимальном сроке хранения.
Наиболее распространен метод «ускоренного старения», позволяющий за несколько коротких интервалов исследования прогнозировать сроки годности готового препарата.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Micrisoft Excel 2ОО7 для уровня вероятности не менее 95 %.
Результаты исследования. При исследовании стабильности основных показателей качества СО МС методом «ускоренного старения» образцы выдерживали в термостате при температуре (58 ± 1) °С в течение 14 и 21 сут.,
что соответствует 36 и 60 мес. хранения при рекомендованной температуре. Контроль показателей качества СО МС проводили по истечении указанного временного интервала.
Параллельно проводили исследование долговременной стабильности, выдерживая образцы при температурах (5 ± 3) °С и (22 ± 4) °С в течение 48 мес. Контроль по показателям качества СО МС проводили через каждые три месяца в течение первого года хранения, каждые шесть месяцев в течение второго года хранения и ежегодно на протяжении последующего периода испытаний.
Качество экспериментальных серий СО МС в различные сроки их хранения оценивали по аттестуемым показателям, соответствующих требованиям нормативной документации (табл. 1).
Контроль внешнего вида: определение проводили визуально при естественном освещении. По внешнему виду СО МС представлял собой гомогенную суспензию черного цвета без признаков конгломерации. При отстаивании образовывался черный осадок на дне флакона и бесцветная прозрачная надосадочная жидкость.
Контроль рН: определение проводили по-тенциометрически на рН-метре. Для контроля использовали содержимое трех флаконов от каждой серии. Измерения показали, что рН находится в пределах 6,8-7,2 ед.
Контроль размера частиц: из трех флаконов пяти серий с помощью дозатора отбирали по 10 мкл суспензии магносорбента, ресуспендиро-вали его в 10 мкл дистиллированной воды. Взвесь наносили на предметное стекло, высушивали и просматривали на биологическом микроскопе «МегдТесЬпо МТ6000» при увеличении ><40, определяли размер отдельно расположенных частиц. Изображение частиц просматривали на экране. За результат контроля принимали среднее арифметическое значение результатов десяти измерений. По данным микроскопии, СО МС -высокодисперсные микрогранулы неправильной формы с выраженными магнитными свойствами, обладающие хорошей смачиваемостью и эффективным оседанием в растворе. Размер частиц варьирует от 3,3 до 4,3 мкм.
Таблица 1. Аттестованные показатели пяти серий стандартного образца магносорбента
на момент изготовления
Table 1. Certified indicators of the five series of a standard sample of magnosorbent at time of manufacture
Наименование Требования НД Полученные результаты
показателя Серия 1 Серия 2 Серия 3 Серия 4 Серия 5
Внешний вид При перемешивании образуется гомогенная взвесь черного цвета, при отстаивании - бесцветная прозрачная надосадочная жидкость с черным осадком на дне флакона При перемешивании во всех образцах трех серий образовывалась гомогенная взвесь черного цвета, при отстаивании - бесцветная прозрачная надоса-дочная жидкость с черным осадком на дне флакона
рН 7,0 ± 0,2 6,9 6,9 7,О 6,9 7,О 7,О 7,О 7,О 6,9 7,1 7,1 7,1 7.0 7.1 7,О
Размер частиц, мкм* 3,8 ± 0,5 3.7 ± О,3 3.8 ± О,3 3,8 ± О,3 3,7 ± О,3 3.7 ± О,3 3.8 ± О,3 3.8 ± О,3 3.9 ± О,3 3,9 ± О,3 3,8 ± О,2 3.8 ± О,3 3.9 ± О,4 3,8 ± О,3 3.8 ± О,3 3.9 ± О,3
Адсорбционная активность, мг/мл 1,0 ± 0,2 1,О 1,О 1,О2 1,1 1,О 1,О О,98 О,98 О,99 О,9 О,9 О,91 1,О5 1,О2 1,О2
* Размер частиц контролируется только на момент изготовления.
* The particle size is controlled only at the time of manufacture.
50
ЗНиСО июль IW (304)
Контроль адсорбционной активности МС изучали путем иммобилизации на его поверхности 1§С, выделенных из гипериммунных кроличьих сывороток. Контроль проводили на примере туляремийных иммуноглобулинов. Для контроля использовали по три флакона от каждой серии. Для этого из флаконов удаляли надоса-дочную жидкость, в каждый флакон добавляли 2,0 мл раствора 1§С, инкубировали при температуре (22 ± 4) °С в течение (120 ± 10) мин, периодически перемешивая. МС отстаивали в течение (15 ± 1) мин при температуре (22 ± 4) °С. Надосадочную жидкость фильтровали через бумажный фильтр и использовали для контроля адсорбционной активности. Эффективность процесса оценивали по степени извлечения 1§С из водной суспензии магносорбента. При соблюдении указанных условий иммобилизации МС показал способность связывать более 10 мг туляремийных 1§С на 1,0 г сорбента.
Результаты исследований стабильности основных показателей качества СО МС представлены в табл. 2, 3.
Установлено, что образцы СО МС при тем-
ли стабильны без изменения внешнего вида, рН и адсорбционной активности в течение 48 месяцев (срок наблюдения).
По результатам, полученным в процессе «ускоренного старения», было установлено, что более высокая температура хранения образцов (58 ± 1) °С в течение 14 и 21 сут. не влияла на показатели рН и адсорбционной активности. Однако наблюдалось изменение цветности над-осадочной жидкости в образцах после 21 сут. хранения при указанной температуре, не оказывающее существенного влияния на основные аттестуемые характеристики испытуемых серий СО МС.
Предложенные иммобилизованные МС были использованы в модифицированном методе иммуноферментного анализа, чувствительность и специфичность определяли с использованием коммерческого набора реагентов тест-системы иммуноферментой магноиммуносорбентной для выявления возбудителя туляремии «ИФА-МИС-Тул-СтавНИПЧИ» и гетерологичных штаммов Salmonella typhimurium 9640, Brucella abortus 19 ВА, Yersinia enterocolitica 383, Escherichia coli 113-3.
пературах хранения (5 ± 3) °С и (22 ± 4) °С бы-
Таблица 2. Критерии стабильности аттестуемых показателей пяти экспериментальных серий стандартного образца магносорбента (СО МС) при хранении в температурном режиме (5 ± 3) °С и (22 ± 4) °С (для контроля использовано по три флакона из каждой серии) Table 2. Criteria of stability of the appraise indicators of the five experimental series of a standard sample of magnosorbent (MS) storage temperature conditions (5 ± 3) °C and (22 ± 4) °C (three bottles from each
series are used for control)
Периодичность контроля (месяцы) Контролируемые показатели Серии контролируемого препарата
Серия 1 Серия 2 Серия 3 Серия 4 Серия 5
3 Внешний вид Водная суспензия при перемешивании образует гомогенную взвесь черного цвета, при отстаивании - прозрачную надосадочную жидкость с черным осадком на дне флакона, легко разбивающимся при встряхивании
6
9
12
18 рН 7,0 ± 0,2 7,0 ± 0,2 7,0 ± 0,2 7,0 ± 0,2 7,0 ± 0,2
24 Адсорбционная активность, мг/мл 1,0 ± 0,2 1,0 ± 0,2 1,0 ± 0,2 1,0 ± 0,2 1,0 ± 0,2
36
48
Таблица 3. Критерии стабильности аттестуемых показателей пяти экспериментальных серий стандартного образца магносорбента (СО МС) при хранении в температурном режиме (58 ± 1) °С
(для контроля использовано по три флакона из каждой серии) Table 3. Criteria of stability of the appraise indicators of the five experimental series of a standard sample of magnosorbent (MS) when stored in a temperature range (58 ± 1) °C (three bottles from each series are
used for control)
Срок хранения Контролируемые показатели Серии контролируемого препарата
1 2 3 4 5
Через 14 сут. хранения Внешний вид Водная суспензия при перемешивании образует гомогенную взвесь черного цвета, при отстаивании - прозрачную надосадочную жидкость с черным осадком на дне флакона, легко разбивающимся при встряхивании
рН 7,0 ± 0,2 7,0 ± 0,2 7,0 ± 0,2 7,0 ± 0,2 7,0 ± 0,2
Адсорбционная активность, мг/мл 1,0 ± 0,2 1,0 ± 0,2 1,0 ± 0,2 1,0 ± 0,2 1,0 ± 0,2
Через 21 сут. хранения Внешний вид Водная суспензия при перемешивании образует гомогенную взвесь черного цвета, при отстаивании - светло-желтую прозрачную надосадочную жидкость с черным осадком на дне флакона, легко разбивающимся при встряхивании
рН 7,0 ± 0,2 7,0 ± 0,2 7,0 ± 0,2 7,0 ± 0,2 7,0 ± 0,2
Адсорбционная активность, мг/мл 1,0 ± 0,2 1,0 ± 0,2 1,0 ± 0,2 1,0 ± 0,2 1,0 ± 0,2
июль IW (304) ЗНиСО
51
,—. При контроле чувствительности в иммуно-ферментном анализе (ИФА) с применением им-'^З' мобилизованных МС был обнаружен возбуди-
■_р тель туляремии в концентрации 1,0*10 м.к./мл,
что соответствует техническим условиям и пас-^^ портным данным используемой тест-системы. |— При определении специфичности в ИФА не ^^ отмечалось перекрестных реакций с гетероло-гичными микроорганизмами.
Результаты влияния высокой температуры хранения (58 ± 1) °С на свойства СО МС в течении 14 сут. и 21 сут. свидетельствуют о стабильности его специфической активности в ИФА.
Выводы. Исследования критериев стабильности свидетельствуют о верификации срока годности и стабильности показателей качества СО МС нормативной документации, как при воздействии на него высоких температур, так и при хранении в течение 48 месяцев (срок наблюдения).
По совокупности полученных результатов установлено, что СО МС соответствует гарантийному сроку хранения - 3 года.
Проведенные испытания показали, что все экспериментальные серии СО МС соответствуют требованиям (аттестованным значениям) на стандартный образец предприятия, что позволило зарегистрировать его в реестре стандартных образцов ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт» Роспотребнадзора (регистрационный номер 007-9388-2015).
Разработанный и аттестованный стандартный образец магносорбента ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт» Роспот-ребнадзора позволяет получать точные и сопоставимые результаты при производстве маг-ноиммуносорбентов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гаркуша Ю.Ю., Старцева О.Л., Жарникова И.В. и др.
Стандартные условия биотехнологии производства магно-иммуносорбентов, используемые в лабораторной диагностике // Диагностика и профилактика инфекционных болезней на современном этапе: материалы научно-практической конференции. Новосибирск, 26-27 сентября 2016 г. С. 145-146.
2. Жарникова И.В. Магноиммуносорбенты и изучение их стабильности в зависимости от сроков хранения // Проблемы особо опасных инфекций. 2003. Вып. 85. С. 171-175.
3. Капустин Д.В., Зубов В.П. Синтез многоцелевых фтор-полимер- и полианилинсодержащих нанокомпозитов и их применение в биосепарации, биоанализе и диагностике // Вестник МИХТХ. 2011. Т. 6. № 5. С. 21-46.
4. Сроки годности лекарственных средств: 0ФС.1.1.0009.15 (общая фармакопейная статья) // Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Т. I. С. 192206: [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://193.232. 7.120Яет1/с1шюа1_ге^агтасорое1а_1_Йт1/НТМШ192 (дата обращения: 17.07.2018).
5. Старцева О. Л., Курчева С. А., Гаркуша Ю.Ю. и др. К вопросу разработки стандартного образца композиционного органокремнеземного микрогранулированного маг-носорбента // Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения: материалы Всероссийской научно-практической конференции, 28 мая 2014 г. / Под ред. д.м.н., проф. Е.И. Ефимова. Н. Новгород: Алтай, 2014. С. 239-241.
6. Старцева О.Л., Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н. и др.
Оптимизация параметров стадии механического измельчения при конструировании стандартного образца магно-сорбента // VII Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов Роспотребнад-
зора «Современные проблемы эпидемиологии и гигиены», Санкт-Петербург, О8-1О декабря 2О15 г. С. 192-193.
7. Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Старцева О.Л. и др. Разработка стандартных условий биотехнологии производства иммуномагнитного сорбента для экспресс-диагностики опасных инфекционных заболеваний // Технологии живых систем. 2О17. № 2. С. 52-57.
8. Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Савельева И.В. и др. Разработка тест-систем магноиммуносорбентных для выявления холерного вибриона в объектах окружающей среды // Здоровье населения и среда обитания. 2О14. № 4 (253). С. 17-19.
REFERENCES
1. Garkusha Yu.Yu., Startseva O.L., Zharnikova I.V. et al. Stan-dartnye uslovija biotekhnologii proizvodstva magnoimmu-nosorbentov, ispol'zuemye v laboratornoj diagnostike [Standard conditions of biotechnology of production of magnoim-munosorbents used in laboratory diagnostics]. Diagnostika i profilaktika infektsionnykh boleznej na sovremennom etape: materialy nauchno-prakticheskoj konferentsii. Novosibirsk, 26-27 September 2О16, pp. 145-146. (In Russ.)
2. Zharnikova I.V. Magnoimmunosorbenty i izuchenie ikh sta-bil'nosti v zavisimosti ot srokov khranenija [Magnoimmu-nosorbents and the study of their stability depending on the shelf life]. Problemy osobo opasnykh infektsij, 2ОО3, issue 85, pp. 171-175. (In Russ.)
3. Kapustin D.V., Zubov V.P. Sintez mnogotselevykh ftorpoli-mer- i polianilinsoderzhashchikh nanokompozitov i ikh prime-nenie v bioseparacii, bioanalize i diagnostike [Synthesis of multi-purpose fluoropolymer- and polyaniline-containing na-nocomposites and their application in bioseparation, bioanaly-sis and diagnostics]. Vestnik MIHTH, 2О11, vol. 6, no. 5, pp. 21-46. (In Russ.)
4. Sroki godnosti lekarstvennykh sredstv: OFS.1.1.0009.15 (obshchaja farmakopejnaja stat'ja) [Shelf life of medicines: OFS.1.1.0009.15 (General Pharmacopoeia)]. Gosudarstven-naja farmakopeja Rossijskoj Federatsii, XIII edition, vol. I, pp. 192-2О6: Available at: http://193.232.7.120/feml/clinical_ref/ pharmacopoeia_1_html/HTML/# 192 (accessed 17.О7.2О18). (In Russ.)
5. Startseva O.L., Kurcheva S.A., Garkusha Yu.Yu. et al. K vo-prosu razrabotki standartnogo obrazca kompozitsionnogo or-ganokremnezemnogo mikrogranulirovannogo magnosorbenta [The issue of development of a standard sample of composite organosilicon microgranulated magnosorbent]. Innovatsionnye tekhnologii v protivoepidemicheskoj zashchite naselenija: ma-terialy Vserossij skoj nauchno-prakticheskoj konferentsii, 28 May 2О14. Edited by Doctor of Medical Sciences, Professor E.I. Efi-mov. Nizhny Novgorod: Altaj Publ., 2О14, pp. 239-241. (In Russ.)
6. Startseva O.L., Tjumentseva I.S., Afanas'ev E.N. et al. Opti-mizatsija parametrov stadii mekhanicheskogo izmel'chenija pri konstruirovanii standartnogo obrazca magnosorbenta [Optimization of parameters of the mechanical grinding stage in the design of a standard sample of magnosorbent]. VII Vserossi-jskaja nauchno-prakticheskaja konferentsija molodykh uche-nykh i spetsialistov Rospotrebnadzora «Sovremennye prob-lemy epidemiologii i gigieny», Saint-Petersburg, О8-1О December 2О15, pp. 192-193. (In Russ.)
7. Tjumentseva I.S., Afanas'ev E.N., Startseva O.L. et al. Raz-rabotka standartnykh uslovij biotehnologii proizvodstva im-munomagnitnogo sorbenta dlja ekspress-diagnostiki opasnykh infektsionnykh zabolevanij [Development of standard conditions of biotechnology of production of immunomagnetic sor-bent for rapid diagnosis of dangerous infectious diseases]. Tekhnologii zhivykh system, 2О17, no. 2, pp. 52-57. (In Russ.)
8. Tjumentseva I.S., Afanas'ev E.N., Savel'eva I.V. et al. Raz-rabotka test-sistem magnoimmunosorbentnykh dlja vyjavlenija holernogo vibriona v objektakh okruzhajushchej sredy [Development of test systems magnoimmunosorbents for the detection of Vibrio cholerae in the environment]. Zdorov'e nase-lenija i sreda obitanija, 2О14, no. 4 (253), pp. 17-19. (In Russ.)
Контактная информация:
Курчева Светлана Александровна, кандидат биологических наук, заведующий научно-производственной лабораторией препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт» Роспотребнадзора e-mail: [email protected] Contact information:
Kurcheva Svetlana, Candidate of Biological Sciences, Head of the science-practical laboratory of preparations for diagnostic of dangerous and other infections, Stavropol Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor e-mail: [email protected]
