CC BY-ND
20
АПРЕЛЬ №4 (253)
17
УДК: 602.68:57.083
РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ МАГНОИММУНОСОРБЕНТНЫХ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
И.С. Тюменцева, Е.Н. Афанасьев, И.В. Савельева, И.В. Жарникова, Е.В. Жданова, С.А. Курчева, О.Л. Старцева, А.Н. Куличенко ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, г. Ставрополь
Разработана тест-система иммуноферментная магноиммуносорбентная для выявления холерного вибриона в объектах окружающей среды, получено регистрационное удостоверение и сертификат Росздравнадзора, налажен коммерческий выпуск препарата. Для выявления энтеротоксина холерного вибриона с целью определения эпидемической значимости штаммов создана тест-система иммуноферментная магноиммуносорбентная для обнаружения холерогена в фильтратах исследуемых агаровых культур. Ключевые слова: холера, окружающая среда, энтеротоксин, иммуномагнитная сепарация.
I.S. Tyumentseva, E.N. Afanasiev, I.V. Savelieva, I.V. Zharnikova, E.V. Zhdanova, S.A. Kurcheva, O.L. Startseva, A.N. Kulichenko □ DEVELOPMENT OF TEST SYSTEMS ofMAGNOIMMUNOSORBENTS FOR THE DETECTION OF CHOLERA VIBRIOCARRIE IN THE ENVIRONMENT □ The Federal Government Health Institution «Stavropol Plague Control Research Institute» of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare □ A test system for the detection immunoassay magnoimmunosorbent cholera vibriocarrie in the environment was developed, and registration certificate from Roszdravnadzor was received, a commercial release of the drug was established. To detect cholera toxin with the aim of determining the epidemiological significance of the strains Reagent test kits for the detection of enzyme immunoassay magnoimmunosorbentcholeragen in the filters of investigated agar cultures were created. Key words: cholera, environment, enterotoxin, immunomagnetic separation.
Проблема холеры актуальна для России в связи с постоянной угрозой заносов этой инфекции вследствие продолжающейся вот уже более 50 лет седьмой пандемии, охватившей многие страны Азии, Африки, Восточного Средиземноморья, Южной Европы, Южной и Центральной Америки.
В мае 2011 г. Всемирная Ассамблея Здравоохранения признала эпидемиологическую обстановку по холере на современном этапе седьмой пандемии как серьезную проблему для мирового здравоохранения и приняла резолюцию WHA 64.15, призывающую к применению интегрированного глобального подхода к борьбе с этой инфекцией [6].
В силу этих обстоятельств особую остроту приобретает своевременная экспресс-диагностика холеры и проведение на ее основе противоэпидемических мероприятий для оценки риска факторов среды обитания человека, их влияния на здоровье и обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения [1]. В настоящее время большинство лабораторных методов диагностики холеры требуют для своей постановки предварительного концентрирования исследуемых проб с одновременным отделением выявляемых микроорганизмов от контаминирующей микрофлоры и других примесей окружающей среды, существенно влияющих на достоверность результатов анализа. Введение в систему индикации или диагностики этапов концентрирования микроорганизмов существенно осложняет и увеличивает время анализов. При этом предусмотрен одномоментный отбор проб ограниченного объема, не превышающего, как правило, одного литра. В этом случае элемент случайности будет скорее правилом, чем исключением, так как в момент забора возбудитель не обязательно присутствует в данном месте и в данное время. В совокупности эти факторы могут привести к получению недостоверных данных, искажающих сложившуюся ситуацию и снижающуюся эффективность мероприятий эпидемиологического надзора.
Эпидемический потенциал холерного вибриона определяется его токсигенностью, то есть
способностью продуцировать экзотоксин (холе-роген, энтеротоксин), являющийся основным фактором патогенности холерного микроба. Для его выявления и количественного определения рядом авторов проводились исследования по конструированию иммуноферментных тест-систем с использованием моноклональных и поликло-нальных антител к энетеротоксину.
В течение последних десятилетий для избирательного концентрирования и обнаружения антигенного материала, в том числе бактериальных клеток, вирусов, ферментов, нашли применение различные иммуносорбционные методы. Они широко используются в медико-биологических исследованиях для идентификации специфических антигенов (Аг), разделения твердой и жидкой фаз, очистки, концентрации суспензий и биологических материалов метод иммуномагнитной сепарации, основными преимуществами которой является значительное повышение чувствительности традиционных лабораторных методов, особенно при исследовании загрязненных различными ингибиторами и контаминированных посторонней микрофлорой проб значительного объема. Иммуномагнитная сепарация позволяет одновременно сконцентрировать искомый патоген и очистить его от примесей, подготавливая образец к дальнейшим микробиологическим, серологическим, молекулярно-генетическим и другим исследованиям [3].Очевидно, что данная методология может быть эффективна при поиске холерного вибриона в объектах окружающей среды.
Цель исследования — разработка тест-систем для выявления холерного вибриона в объектах окружающей среды, определения его токсиген-ности в модифицированном методе иммунофер-ментного анализа с применением иммуномагнит-ной сепарации.
Материалы и методы. В работе использовано 60 штаммов рода Vibrio, гетерологичные микроорганизмы родов Escherichia, Salmonella, Shigella, а так-же20 кроликов обоего пола породы «Шиншилла» массой 3,0—3,5 кг.
18
ЗНиСО АПРЕЛЬ №4 (253)
В качестве основной матрицы при получении магносорбентов (МС) использовали алюмосиликат, представляющий собой тонкодисперсный продукт, содержащий в своем составе двуокись кремния алюминия. Модификатором сорбента являлся декстран (полиглюкин) — полисахарид, магнитным материалом служил оксид железа (БеО).
Для контроля специфической активности иммунных сывороток применяли реакцию иммуно-диффузии (РИД) в агаровом геле. Для выделения иммуноглобулинов класса G(IgG) использовали метод фракционирования полиэтиленгликолем [5]. Иммунопероксидазныеконъюгаты получали методом перийодатного окисления [4]. Для подтверждения воспроизводимости и достоверности результатов, полученных при исследовании, применяли статистические методы [2].
Результаты и обсуждение. Серологическая специфичность холерного вибриона связана с термостабильным антигенным О-комплексом, а его термолабильный антигенный Н-комплекс имеет связь с антигенным комплексом, встречающимся в разных нехолерных вибрионах, и антисыворотки, содержащие антитела к этому антигену, не специфичны для вибрионов группы О-1. Полагаясь на это, для приготовления Аг микробные биомассы типичных штаммов V. ско1егаеско1егае 1паЬа, № 569В и V. скокгаееЮ Ogawa, № 14D, выращенные на щелочном агаре в течение 18 ч, немедленно после смыва автоклави-ровали при температуре 112 °С в течение 2 ч, что приводило к полному разрушению термолабильного Н-антигена. Для иммунизации применяли два вида Аг: корпускулярный из автоклавирован-ных биомасс, смешанных апа, а также антигенный комплекс, изолированный из смешанной биомассы водно-солевой экстракцией и ультразвуковой дезинтеграцией.
Одну группу кроликов породы «Шиншилла» для получения агглютинирующих сывороток иммунизировали корпускулярным Аг в возрастающих дозах, начиная с 1х109 м.к., с 4-дневными интервалами, при этом одномоментно вводили иммуномодулятор тималин. Вторую группу животных подвергали гипериммунизации, используя водорастворимый комплексный холерный антиген, иммуномодуляторы тималин и циклофос-фан, получая иммунные кроличьи сыворотки с преимущественным содержанием преципитинов.
Энтеротоксические холерные сыворотки получали, используя кроликов-продуцентов, которым вводили внутривенно пятикратно каждые семь дней в увеличивающихся дозах энтероток-син, извлеченный из агаровой среды после выращивания на них токсигенного штамма № 569В V. ско!егае 1паЬа. В эти же сроки внутримышечно инъецировали по 10 мкг иммунокорректор тимо-ген. На 7—10-й день после последнего введения иммуногена животных кровопускали. Активность иммунных сывороток, полученных нами, в РИД составляла не менее 1 : 32 (+13,3 %; —11,7 %) у 100 % иммунизированных кроликов.
При конструировании магноиммуносорбен-тов (МИС) в качестве сорбционного материала
использовали кремнезем-алюмосиликат, химическое модифицирование поверхности которого с целью образования на ней функционально активных групп, способных ковалентно связываться с белковыми лигандами (IgG, выделенными ПЭГ-6000 из смешанных 1 : 1 агглютинирующей и преципитирующей сывороток, либо энтероток-сической иммунной сыворотки), осуществляли в присутствии полимера — декстрана и активатора ПАВ — вторичного алкилсульфата натрия. В результате корректировки и оптимизации параметров получены высококачественные сорбенты. Рекомендованы следующие условия синтеза МИС: соотношение компонентов — 3 : 2 : 1 : оксид железа, полиглюкин, алюмосиликат соответственно; время гелеобразования — 1—2 ч при температуре (24 ± 4) °С; количество активатора — 0,1 %; концентрация белка — 2 мг/мл; время иммобилизации — 4 ч; температура — 37 °С.
Для получения иммуноферментных конъю-гатов использовали IgG, выделенные ПЭГ-6000. В основу конъюгирования пероксидазы хрена фирмы «Serva» с антителами положен метод предварительного окисления фермента до альдегидной формы перийодатом натрия. Рабочий титр иммунопероксидазных конъюгатов в «сэндвич»-варианте составил 1 : 600—1 : 800.
При использовании МИС в ИФА для проведения реакции не требуются традиционные полистироловые планшеты, так как МИС выступают сами в качестве твердофазной матрицы. При этом время постановки ИФА составляет 50—60 мин, а общепринятым методом, учитывая 18-часовую сенсибилизацию микроплат, 20—21 ч; значительно увеличивается время хранения иммобилизованной матрицы — с 20 дней (планшет) до одного года (МИС), кроме того повышается специфичность и чувствительность метода.
При постановке «сэндвич»-варианта ИФА с применением МИС удавалось обнаруживать холерный вибрион в концентрации, эквивалентной ОСО 42-28-85П, не менее 1,0 х 102 м.к./мл. Изготовленные серии МИС не выявляли в ИФА ге-терологичные микроорганизмы (E. coli,Salmonella, Shigella), а также V. choleraenon 01/non. Изучение эффективности использования МИС для определения возбудителя холеры в пробах объектов окружающей среды, искусственно инфицированных гомологичными и гетерологичными микроорганизмами, показало, что холерные МИС выявляли в пробах воды холерные вибрионы О1, О139 серогрупп и не выявляли V. choleraenon 01/ попи гетерологичные микроорганизмы.
В ходе разработки экспериментальные серии холерного МИС были испытаны в полевых условиях. Так, в 1994 г. во время вспышки холеры в Республике Дагестан специальные магнитные ловушки, «заряженные» МИС, устанавливали в канализационные стоки, оросительные каналы, реки и другие объекты. Из канализационных стоков одного из поселков, кроме дважды подтвержденных положительных результатов в модифицированном методе ИФА, была выделена культура холерного вибриона при посеве МИС на питательные среды. Общепринятым бактериологиче-
г-Ь
АПРЕЛЬ №4 (253)
19
г-Ь
ским методом ни в одном случае выделить культуру холерного вибриона не удалось. В 1995 г. в Чеченской Республике во время боевых действий при работе СПЭБ института таким же способом при мониторинге окружающей среды на холеру в пос. Грозненский из воды пруда были выделены три культуры V. choleraeeltor бактериологическим методом. Эти же пробы, исследованные в ИФА + МИС, дали положительные результаты.
Проведенные исследования позволили составить диагностический набор реагентов тест-системы иммуноферментной магноиммуно-сорбентной для выявления холерного вибриона («ИФА-МИС-Холера-СтавНИПЧИ»), которая предназначена для селективного концентрирования холерного вибриона из водных объектов окружающей среды на МИС с последующей постановкой ИФА. Проведены медицинские и технические испытания тест-системы, получено регистрационное удостоверение № РЗК 2013/431 Росздравнадзора, сертификат соответствия № 1405363, и препарат допущен к обращению на территории Российской Федерации.
Для выявления энтеротоксина холерного вибриона нами сконструирован набор реагентов тест-системы иммуноферментной магноиммуносор-бентной («МИС-ИФА-Хол.токс-СтавНИПЧИ»), которая предназначена для селективного концентрирования холерогенаиз фильтратов исследуемых агаровых культур на МИС с последующей постановкой ИФА. Диагностическую ценность разработанной тест-системы определяли на 32 токси-генных штаммах V. cholerae О139 и V. choleraeeltor и 18 атоксигенных штаммах рода Vibrio. Результаты экспериментов показали 100 %-ю специфичность модифицированного метода ИФА при контроле на атоксигенных штаммах рода Vibrio, из 32 ток-сигенных штаммов лишь два холерных вибриона
с низкой способностью к продукции энтеротоксина не дали положительного результата.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что иммуномагнитная сепарация в сочетании с ИФА может служить эффективным инструментом для микробиологического мониторинга объектов окружающей среды на наличие возбудителя холеры, а определение токсигенности холерных штаммов в иммуноферментном анализе с применением иммуносорбции может служить дополнительным тестом при определении эпидемической значимости штаммов холерного вибриона.
ЛИТЕРАТУРА
1. Осина Н.А. и др. Результаты мониторинга холерных вибрионов в водных экосистемах на территории Республики Калмыкия / Н.А. Осина, Т.Б. Каляева, Т.В. Бугор-кова, И.А. Касьян, Н.Ф. Оброткина //Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 2 (239). С. 28—30.
2. Тамбовцев Е.П. и др. Методы статистической обработки результатов серологических реакций / Е.П. Тамбовцев, С.Г. Ахметкалиев, Н.П. Пятницкий // Журнал микробиологии. 1969. № 10. С.26-31.
3. Тюменцева И.С. и др. Иммуномагнитные сорбенты для экспресс-диагностики опасных инфекционных заболеваний: аспекты биотехнологии и опыт применения / И.С. Тюменцева, Е.Н. Афанасьев, Л.В. Ляпустина, О.И Ко-готкова, И.В.Жарникова, В.И. Ефременко, ДА. Будыка, Н.Ф. Василенко, Е.Е. Афанасьева, А.Н. Куличенко //Проблемы особо опасных инфекций. 2009. Вып. 101. С. 59—61.
4. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase — Labelled antibody — a new method of conjugation //Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 1974. Vol. 22. № 4. P. 506—508; 1084—1091.
5. Poison A., Potgieter G.M., Largier J.E. The fractionation of protein mixtures by linear polymers of high molecular weight //Biochimica et Biophysica Acta. 1964. Vol. 82. P. 463—475.
6. WHA 64.15. Холера: механизм борьбы и профилактики. Шестьдесят четвертая сессия Всемирной Ассамблеи Здравоохранения. 24 мая 2011rwww.who.int/entity/cholera/ technical/A64_R15-ru.pdf.
Контактная информация: Contakt Information:
Томенцева Ирина Степановна, Tyumentseva Irina,
тел: 8 (865) 226-40-39, phone:8 (8652) 26-40-39,
e-mail: labdiagn@yandex.ru e-mail: labdiagn@yandex.ru
УДК 616.24-002:612-018
ОБ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИХ АСПЕКТАХ ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ ПНЕВМОНИЕЙ ЛИЦ ПОЖИЛОГО ВОЗРАСТА
А.В. Мартынова14, Л.А. Балабанова2, А.А.Шепарев1, О.А. Чулакова1, Л.М.Семейкина3 'Тихоокеанский Государственный Медицинский Университет, г. Владивосток 2ФГБУН Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук, г. Владивосток 3ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Приморском крае», г. Владивосток 4Школа естественных наук, Дальневосточный Федеральный Университет, г. Владивосток Дана оценка эпидемиологических аспектов заболеваемости внебольничными пневмониями у лиц пожилого возраста с учетом этиологической структуры по данным г. Владивостока и Приморского края. Ключевые слова: внебольничная пневмония у пожилых, Streptococcus pneumoniae, пневмококковые инфекции.
A. V. Martynova, L.A. Balabanova, A.A. Sheparyov, O.A. Chulakova, L.M. Semeikina □ EPIDEMIOLOGICAL ASPECTS OF COMMUNITY-ACQUIRED PNEUMONIAE IN ADULTS □ Pacific State Medical University, Vladivostok; Pacific Inctitute of Bioorganical Chemistry of Far Eastern Department of the Russian Science Academy, Vladivostok; Epidemiology Department, «Center if Epidemiology and Hygiene in Primorsky Jrai», Vladivostok; Natural Science School, Far Eastern Federal University, Vladivostok, Russia □ The evaluation of the epidemiological aspects of diseases of CAP in the elderly based on the etiological structure according to Vladivostok and Primorye was given. Key words: community-acquired pneumonia in adults, Streptococcus pneumoniae, pneumococcal infections
По данным литературы известно, что распространенность внебольничных пневмоний (ВП) среди лиц пожилого и старческого возраста в Москве в конце 90-х годов составляла около 17,4 на 1 000 населения [1, 2]. В США ежегодная заболеваемость пневмонией у стариков, проживающих в домашних условиях, составляет 20—40
на 1 000 населения, а у находящихся в гериатрических учреждениях — 60—115 на 1 000 [3. 4]. В Европе этот показатель составляет 25—44 случая на 1 000 человек в год [5]. Смертность среди пожилых пациентов от пневмонии в 10 раз выше, чем в других возрастных группах [8], и составляет в среднем 5 %, в то же время у пациентов, нуж-
