CC BY
78
УДК 663.052
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ВЫДЕЛЕНИЯ АСТАКСАНТИНА ИЗ ПАНЦИРНЫХ ОТХОДОВ КРЕВЕТКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ ТРИПСИНА, ХИМОТРИПСИНА
И ПРОТОСУБТИЛИНА
М. В. Самсонов, М. Л. Винокур, М. П. Андреев
COMPARATIVE ANALYSIS OF THE EXTRACTION OF ASTAXANTHIN FROM SHRIMP WASTES USING PROTEOLYTIC ENZYME TRYPSIN, CHYMOTRYPSIN, PROTOSUBTILIN
M. V. Samsonov, M. L. Vinokur, M. P. Andreev
Одно из перспективных направлений переработки панцирных отходов ракообразных - это получение различных типов белковой продукции, содержащей каротиноиды (каротинопротеины), которые характеризуются достаточно сбалансированным составом аминокислот, а также высоким содержанием астаксантина. Наиболее перспективным способом выделения каротинопротеина из панцирь-содержащих отходов (ПСО) является их обработка достаточно недорогими ферментативными препаратами микробиологического происхождения с последующей коагуляцией белка. В статье приведено сравнение эффективности извлечения каротинопротеинов из ПСО с использованием ферментов микробиологического и животного происхождения. Процесс выделения включал следующие операции: ферментирование, фильтрацию, центрифугирование с разделением на фазы: жировую, жидкую (водную) и твердую (каротинопротеин). Получаемый каротинопротеин был высушен под вакуумом. В качестве фермента микробиологического происхождения использовался протосубтилин Г3Х, животного происхождения - трипсин и химотрипсин. Гидролиз проводился при изменяющихся значениях водородного показателя, близких к оптимальным для каждого из используемых ферментов. Продолжительность гидролиза составила четыре часа. Значительной разницы в содержании каротиноидов как в верхней, так и в средней фракции для всех трех ферментов не обнаружено. Пооле центрифугирования гидролизата удается выделить на 30 % меньше каротиноп-ротеина в составе нижней фракции по сравнению с ферментами животного происхождения. Содержание астаксантина в каротинопротеине, экстрагированном протосубтилином, было на 15 % ниже по сравнению с химотрипсином.
ферментативный препарат, панцирные отходы, астаксантин, ферментативный гидролиз, гидролизат, каротинопротеиновый комплекс
One of the perspective directions of processing crustacean waste is obtaining different types of protein products containing carotenoids (carotenoprotein). In the works of Simpson and Hard it was noted that the yield of carotenoids depends on the use of various kinds of enzyme products, both animal and microbiological origin. Carotenoprotein are characterized by a fairly balanced amino acid profile and high content of astaxanthin, the most promising way to detect carotenoprotein of shrimp waste is their
treatment by sufficiently inexpensive enzymatic preparations of microbial origin with subsequent coagulation of the protein. The article compares efficiency of extraction of carotenoprotein from shrimp waste with the use of enzymes of microbial and animal origin. The process of extracting carotenoproteins included the following procedures: fermentation; filtration, centrifugation with the separation of the following phases: fat, liquid (water) and solid (carotenoprotein). Carotenoprotein was dried under vacuum. As an enzyme of microbial origin we used protosubtilin G3X of animal origin such as trypsin and chymotrypsin. The hydrolysis was conducted under varying values of pH, however, close to optimal for each of the used enzymes. The period of hydrolysis was 4 hours. Significant difference in the content of carotenoids in Vergina and the average fraction for all three enzymes was not detected. After centrifugation of the hydrolysate it is possible to allocate 30% less, carotenoproteins in the composition of the bottom fraction in comparison with enzymes of animal origin. The content of astaxanthin in carotenoprotein and the water-solubility of the carotenoid, extracted with protosubtilin was 15% lower compared with chymotrypsin.
enzyme, crustacean waste, astaxanthin, hydrolysate, enzymatic hydrolysis, carotenoprotein complex
ВВЕДЕНИЕ
При переработке креветок образуется значительное количество отходов в виде панциря и головогруди. Выход панцирных отходов колеблется от 46 до 65 % в зависимости от способа и типа разделки, а также от вида креветки [1, 2].
Отходы от переработки креветок характеризуются достаточно высоким содержанием белка, хитина, каротиноидов, незаменимых жирных кислот, кальция и пр. Вышеуказанные компоненты и продукты их модификации могут представлять интерес с пищевой и лечебно-профилактической точки зрения, а также использоваться для кормовых и технических целей. В то же время наличие в составе панцирь-содержащих отходов (ПСО) хитина создает определенные экологические трудности при их утилизации [3].
Одним из видов продукции, получаемой из ПСО, являются белковые продукты, содержащие каротиноиды. Каротинопротеин используется как общеродовое понятие для групп белковой продукции кормового, пищевого и лечебно-профилактического назначения, содержащих каротиноиды (включая жидкие, пюреобразные, порошкообразные), имеющих различный химический состав и степень гидролиза белка [4, 5].
Как правило, технологический процесс получения каротинопротеина является частью комплексной переработки ракообразных. Основной особенностью ПСО как сырья, используемого для получения белковой продукции, является то, что значительная часть белка связана с хитиново-минеральным мат-риксом и не может быть отделена механически. В связи с этим достижение приемлемой степени депротеинизации ПСО возможно лишь с применением химических или биохимических методов обработки. Для этого используются стартовые культуры микроорганизмов, вырабатывающие протеолитические ферменты, препараты ферментов различной степени очистки или кислотно-щелочная обработка [5-7]. Последующая механическая обработка получаемой гидролизованной массы производится, как правило, фильтрацией или центрифугированием. При этом из фильтрата или центрифужной надосадочной жидкости белок может быть сконцентрирован посредством высушивания, механически (центрифугирование или фильтрация) или коагуляцией [8].
Использование ферментных препаратов позволяет более точно регулировать процесс и значительно уменьшить его продолжительность по сравнению со способом, основанным на внесении культур микроорганизмов. В последнее время большое внимание уделяется использованию достаточно недорогих микробиологических ферментных препаратов. В работе С. В. Немцева предложен процесс комплексной переработки ракообразных с применением для депротеини-зации ПСО ферментного препарата протосубтилина Г3Х, выделяемого культурами Bac. subtilis [4]. Продукт, отделяемый изоэлектрической коагуляцией из гидролизованных, предварительно частично обезжиренных ПСО криля, представлял собой белковую пасту с содержанием липидов 8-20 %. Однако при этом целью являлось получение обезжиренной белковой пасты, способной храниться как можно дольше при естественной влажности. В работе Симпсона и Харда показан достаточно экономически затратный способ выделения каротиноп-ротеина из предварительно ферментированных ПСО, основанный на его преципитации методом диализа [8].
На сегодняшний день перспективным является использование ферментных препаратов микробиологического происхождения. Однако из-за более широкой субстратной специфичности указанных ферментов в значительной степени уменьшается вязкость получаемых бульонов и повышается уровень перехода каротиноидов в жировую и водную фракции при использовании концентрирования методом центрифугирования [8].
В настоящей работе будет рассмотрен процесс получения каротинопротеина из ПСО вареной креветки, включающий следующие операции: ферментирование, фильтрацию, осаждение целевого продукта методом центрифугирования.
Цель работы состоит в сравнительном анализе состава и качества фракций, получаемых в процессе центрифугирования фильтрата из частично гидролизо-ванных ПСО, при условии применения в качестве протеолитических ферментов химотрипсина, трипсина и протосубтилина Г3Х.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследования использовалась целая варено-мороженая северная креветка с предварительно удаленным гепатопанкреасом. Дефростиро-ванная на воздухе креветка подвергалась ручной разделке, при этом удалялись панцирь и головогрудь.
Химический состав полученных ПСО: влага - 66,4 %, белок - 15,3 %, липиды - 8,1 %, хитин - 6,3 %, каротиноиды (астаксантин) - 0,013 %, минеральные вещества - 6,7 % [4].
В качестве ферментативного препарата использовался протосубтилин Г3Х, химотрипсин и трипсин (все произведены фирмой «Сиббиофарм»).
ПСО (330 г) сразу же после разделки смешивались с дистиллированной водой (660 г). Температура дистиллята составила 26 оС, ПСО - 7 оС. Полученная смесь была разделена на три равные части (по 110 г), и к каждой из них были добавлены различные препараты ферментов (протосубтилина, трипсина и химотрипсина). Трипсин и химотрипсин были взяты в количестве 5 г на 1 кг белка (исходя из рекомендаций, предложенных в исследованиях Симпсона и Харда) [8], что приблизительно соответствовало 10 мг на 330 г смеси ПСО с водой. Протосубтилин Г3Х был взят в количестве, соответствующем его одинаковой активности с 10 мг химотрипсина по казеину.
После добавления ферментативных препаратов процесс гидролиза продолжался при температуре 37 оС в течение четырех часов в термостате при отсут-
ствии освещения. Для всех образцов были созданы одинаковые условия протекания ферментативного гидролиза. В начале процесса рН смеси был смещен в кислую сторону (рН = 6) посредством добавления щавелевой кислоты.
После проведения ферментативного гидролиза образцы пропускали через марлевый фильтр для отделения крупной панцирной фракции, содержащей в основном хитин и минералы. Полученный фильтрат центрифугировали при скорости 5000 об/мин в течение 10 мин. После центрифугирования в каждой из полученных трех фаз (верхней жировой, средней водно-белковой и нижней плотной) определяли содержание сухих веществ и астаксантина.
Каротиноиды из ПСО выделялись посредством их перевода в органический растворитель (ацетон). Для этого ПСО и получаемые образцы несколько раз настаивали с ацетоном и центрифугировали для разделения на плотную и жидкую части. Для полного выделения каротиноидов цикл повторялся три раза. Из раствора ацетона каротиноиды реэкстрагировались петролейным эфиром, который полностью удалялся посредством высушивания при температуре 30 С без прямого воздействия света.
Получаемые после удаления петролейного эфира каротиноиды растворяли в 250 мл хлороформа, и определялось их содержание методом спектрофотометрии на фотоэлектроколориметре (ФЕК) модели 2МК. Метод основан на том, что каротиноиды имеют максимумы поглощения в ультрафиолетовом спектре. Длина волны, соответствующая максимуму поглощения, определяется природой каротиноида и свойствами растворителя. Раствор астаксантина в хлороформе имеет максимум поглощения при длине волны 490 нм.
Содержание астаксантина (мкг/г) определяли по формуле (1):
(1)
250 т
где D - оптическая плотность раствора в хлороформе при длине волны 490 нм; V - объем бинарной смеси, мл; m - масса навески.
Для проведения органолептической оценки нижняя фракция всех образцов была подвергнута процессу вакуумной сушки. Процесс обезвоживания проходил в аппарате вакуумной сушки при температуре 35 оС, без прямого воздействия освещения. После максимального удаления жидкости из образцов полученное вещество было измельчено в ступке.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Водородный показатель у всех трех образцов изменялся в щелочную сторону, его значение ни в одном из случаев не превысило 7 ед., т. е. процесс ферментативного гидролиза проходил при условиях, близких к оптимальным. Результаты изменений занесены в табл. 1.
Таблица 1. Динамика рН при гидролизе ПСО
Ферменты Начальный рН Через 3 ч
Протосубтилин 6 6.70
Трипсин 6 6.60
Химотрипсин 6 6.56
Меньшее смещение водородного показателя в щелочную среду после ферментативного гидролиза выявлено у образца с добавлением химотрипсина. Это
связано с высокой протеолитической активностью, что позволяет высвободить большее количество каротинопротеинового комплекса.
По завершению центрифугирования в емкостях образовались три фракции с четко видимой поверхностью раздела. Верхняя фракция представляла собой липидно-каротиноидный комплекс, средняя - мутный серовато-оранжевый бульон, состоящий из растворимых белковых веществ (в том числе аминокислот), каротиноидов, минеральных веществ. Нижняя фракция представляет пастообразный осадок, имеющий в своем составе преимущественно нерастворимый денатурированный белок, каротиноиды, возможно, частично связанные с белком, и минеральные вещества.
Таблица 2. Результаты органолептической оценки полученных образцов Table 2. Organoleptic evaluation of the obtained samples
Органолептические показатели Образец 1 (протосубтилин) Образец 2 (трипсин) Образец 3 (химотрипсин)
Внешний вид Порошок темно-оранжевого цвета, без посторонних оттенков Порошок серо-желтоватого цвета, без посторонних оттенков Порошок серо-оранжевого цвета, без посторонних оттенков
Запах Выраженный запах сушеной креветки, без посторонних запахов Ярко выраженный запах сушеной креветки, без посторонних запахов Ярко выраженный запах сушеной креветки, без посторонних запахов
Вкус Концентрированный вкус креветки, без посторонних привкусов Концентрированный вкус креветки, без посторонних привкусов Концентрированный вкус креветки, без посторонних привкусов
Цвет Темно-оранжевый Темно-оранжевый Темно-оранжевый
Консистенция Сухая, рассыпчатая, однородная Сухая, рассыпчатая, однородная Сухая, рассыпчатая, однородная
Проведенное органолептическое сравнение полученных образцов показало, что образец 1, где использовался протосубтилин, уступает образцам 2 и 3 по таким характеристикам, как цвет и запах. Образцы 2 и 3 (с трипсином и химотрипсином) получили равную органолептическую оценку.
Таблица 3. Распределение астаксантина по слоям Table 3. Distribution of astaxanthin between layers
Название Используемый Выход Концентра-ция Выход Распре-
слоя фермент сухих в-в, астаксанти-на, астаксантина, деление
г на 100 г мкг на г сухих мг на 100 г астаксантина
сырых ПСО в-в сырых ПСО по слоям, %
Верхний Протосубтилин 5,13 56,5 0,29 54
Трипсин 5,14 57,1 0,29 47
Химотрипсин 5,18 57,4 0,3 46
Средний Протосубтилин 2,81 39 0,11 20,4
Трипсин 2,91 34 0,11 18
Химотрипсин 2,91 36 0,12 18,5
Нижний Протосубтилин 4,10 34 0,14 25,6
Трипсин 5,72 38 0,22 35,0
Химотрипсин 5,64 40 0,23 31,5
Для каждого из образцов выход липидно-каротиноидных комплексов (ЛКК) фракции был приблизительно одинаковым и составлял около 5 % по отношению к весу сырых ПСО. Выход и, соответственно, концентрация астаксантина были приблизительно одинаковыми.
Выход сухих веществ средней фракции по отношению к весу сырья также был приблизительно одинаковым для всех трех ферментов и составил 3 %. Отсутствие существенных отличий в выходе ЛКК, астаксантина и сухих веществ в нижней фракции для каждого из ферментов позволяет выдвинуть предположение о достаточно тесной взаимосвязи степени высвобождения указанных компонентов и глубины протеолиза ПСО.
Выход сухих веществ в составе нижнего слоя для протосубтилина был почти на 30 % ниже по сравнению с трипсином и химотрипсином. Из полученных данных следует, что протосубтилин, используемый в количестве, эквивалентном активности трипсина и химотрипсина по казеину, приводит к меньшей степени депротеинизации ПСО.
При использовании протосубтилина наблюдается большее значение соотношения астаксантина в средней фракции по отношению к нижней в сравнении с другими ферментами. В работе Симпосна и Харда также было отмечено, что при использовании ферментного препарата микробиологического происхождения при одинаковой степени депротеинизации ПСО в получаемом гидролизате остается меньшее количество каротиноидов, связанных с белком. Это обусловлено наличием у этого препарата более широкой субстратной специфичности, в число которых, предположительно, может входить и связь каротиноидов с белком.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При использовании протосубтилина в количестве, эквивалентном активности по казеину, с традиционно используемыми ферментами животного происхождения (трипсин и химотрипсин) удалось выделить целевой продукт (каротинопротеин), почти идентичный по содержанию астаксантина. Выход каротинопротеина для протосубтилина по сравнению с ферментами животного происхождения был на 30 % ниже.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Бакулина, О. Н. Каротиноиды: извлекаем пользу / О. Н. Бакулина // Пищевые ингредиенты: сырье и добавки. - Москва, 2009. - № 1. - С. 44-46.
2. Бахолдина, Л. П. Исследования технологических характеристик и процессов обработки антарктического криля / Л. П. Бахолдина: сб. науч. ст. / АтлантНИРО. - Калининград, 2008. - С. 27-35.
3. Купина, Н. М. Использование отходов от разделки крабов / Н. М. Купина // Рыбное хозяйство. - Москва, 2007. - № 4. - С. 56-57.
4. Немцев, С. В. Комплексная технология хитина и хитозана из панциря ракообразных / С. В. Немцев. - Москва: ВНИРО, 2006. - 134 с.
5. Ferrer J., Paez, G., Marmol Z., Ramones E., Garcia H., Forster C.F. Acid hydrolysis of shrimp-shell wastes and the production of single cell protein from the hydrolysate. 2006, pp. 55-60.
6. Hiraano S., Tokura S. Chilin and Chitosan.Proceedings of the Second International Conference on Chitin and Chitosan.The Japanese Society of Chitin and Chitosan. Tokyo, Japan. 2008, pp. 105-110.
7. Meyers H.M., Meyers S.P. Ensilage treatment of crawfish waste for improvement of astaxanthin pigment extraction. J. Food Sci., 2007, pp. 1516- 1555.
8. Simpson B.K., Haard N.F. The use of proteolytic enzymes to extract Carotenoproteins from shrimp wastes. 2008, рр. 202 - 222.
REFERENCES
1. Bakulina O. N. Karotinoidy: izvlekaem pol'zu [Carotenoids: benefits]. Moscow, Pishchevye ingredienty: syr'e i dobavki, 2009, no. 1, pp. 44-46.
2. Bakholdina L. P. Issledovaniya tekhnologicheskikh kharakteristik i protsessov obrabotki antarkticheskogo krilya: sbornik nauchnykh statey [Study of technological characteristics and procedures of Antarctic krill processing: collection of scientific articles]. Kaliningrad, AtlantNIRO, 2008, pp. 27-35.
3. Kupina N. M. Ispol'zovanie otkhodov ot razdelki krabov [Utilization of waste from crab picking]. Moscow, Rybnoe khozyaystvo, 2007, no. 4, pp. 56-57.
4. Nemtsev S. V. Kompleksnaya tekhnologiya khitina i khitozana iz pantsirya rakoobraznykh [Complex technology of chitin and chitosan from crustaceans crust]. Moscow, VNIRO, 2006, 134 p.
5. Ferrer J., Paez, G., Marmol Z., Ramones E., Garcia H., Forster C. F. Acid hydrolysis of shrimp-shell wastes and the production of single cell protein from the hydrolysate. Bioresource Technology, 2006, pp. 55-60.
6. Hiraano S., Tokura S. Chilin and Chitosan.Proceedings of the Second International Conference on Chitin and Chitosan. The Japanese Society of Chitin and Chitosan. Tokyo, Japan, 2008, pp. 105-110.
7. Meyers H. M., Meyers S. P. Ensilage treatment of crawfish waste for improvement of astaxanthin pigment extraction. J. Food Sci., 2007, pp. 1516-1555.
8. Simpson B. K., Haard N. F. The use of proteolytic enzymes to extract Carotenoproteins from shrimp wastes, 2008, pp. 202 - 222.
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ
Самсонов Максим Вячеславович - Калининградский государственный технический университет; аспирант кафедры «Технология продуктов питания»;
E-mail: [email protected]
Samsonov Maxim Vyacheslavovich - Kaliningrad State Technical University; postgraduate student of the department of food technology;
E-mail: [email protected]
Винокур Михаил Леонидович - Калининградский государственный технический университет; кандидат технических наук, доцент кафедры «Технология продуктов
питания»; E-mail: [email protected]
Vinokur Michail Leonidovich - Kaliningrad State Technical University;
Ph.D., assistant professor of the department of food technology;
E-mail: [email protected]
Андреев Михаил Павлович - Калининградский государственный технический университет; доктор технических наук, профессор, старший научный сотрудник;
E-mail: [email protected]
Andreev Mikhail Pavlovich - Kaliningrad State Technical University; Doctor of Engineering, professor, senior researcher; E-mail: [email protected]
