CC BY
23
УДК 577.15
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНОЙ ЭНДО-1,4-р-ГЛЮКАНАЗЫ II И ЕЕ ХИМЕРНОЙ ФОРМЫ С ЦЕЛЛЮЛОЗОСВЯЗЫВАЮЩИМ МОДУЛЕМ
О.Г. Короткова1, М.В. Семенова1, Е.А. Рубцова1, О.А.Синицына2, Е.Г. Кондратьева1, Н.М. Бибиков3, А.М. Рожкова1*, А.П. Синицын1,2
(1 Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук; 2 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет;*e-mail: amrojkova@mail.ru)
Методами генетической инженерии получена химерная форма эндо-1,4-р-глюканазы II (ЭГ11) Pénicillium verruculosum, к С-концу которой присоединен целлюлозосвязы-вающий модуль (ЦСМ) целлобиогидролазы I P. verruculosum (ген egII не имеет участка, кодирующего ЦСМ). Были изучены свойства полученного химерного фермента, выделенного в гомогенной форме. Присоединение ЦСМ привело к существенному увеличению активности химерного фермента по отношению к микрокристаллической целлюлозе (МКЦ), а также к «появлению» его адсорбционной способности по отношению к целлюлозе, однако присоединение ЦСМ вызвало уменьшение активности по отношению к растворимым полисахаридным субстратам (карбоксиме-тилцеллюлозе и р-глюкану). Наличие ЦСМ позволило химерной форме фермента в составе целлюлазного комплекса более эффективно гидролизовать целлюлозосо-держащие субстраты и увеличить выход продуктов. Прирост восстанавливающих сахаров (ВС) в случае гидролиза МКЦ в течение 24 ч целлюлазным комплексом, содержащим целлобиогидролазу I, Р-глюкозидазу и ЭГП-ЦСМ, по сравнению с комплексом, в состав которого входила ЭГП без ЦСМ, составил 22%, для измельченной осиновой древесины увеличение выхода ВС составило 42%.
Ключевые слова: эндо-1,4-р-глюканаза, целлюлазный комплекс, целлюлозосвязываю-
щий модуль, гидролиз, Penicillium verruculosum.
Одно из важных направлений биотехнологии - биоконверсия возобновляемого целлю-лозосодержащего сырья в простые сахара, ко -торые далее превращают в коммерчески значимые продукты, такие как спирты, органические кислоты, углеводороды, простые и сложные эфиры и т.д. [1]. Конверсия целлюлозы происходит под действием комплекса целлюлоли-тических ферментов, в состав которого входят экзо-1,4-Р-глюканазы (целлобиогидролазы, ЦБГ, КФ 3.2.1.91), эндо-1,4-Р-глюканазы (эн-доглюканазы, ЭГ, КФ 3.2.1.4) и р-глюкозидазы (БГЛ, КФ 3.2.1.74). Целлобиогидролазы катализируют деструкцию кристаллических участков целлюлозы, последовательно (по процес-сивному механизму) отщепляя целлобиозу от концов полисахаридной цепи. Эндоглюканазы катализируют гидролиз аморфных участков целлюлозы, расщепляя по неупорядоченному механизму внутренние 1,4-Р-глюкозидные связи, снижая тем самым степень полимеризации субстрата и создавая новые сайты для действия
целлобиогидролаз. Р-Глюкозидазы гидролизу-ют целлобиозу и целлолигосахариды до конечного продукта - глюкозы [2, 3]. Эффективность гидролиза целлюлозы зависит от состава ферментного комплекса и свойств, входящих в него компонентов. В частности, важную роль в гидролизе целлюлозы играет ЦБГ1, имеющая цел-люлозо связывающий модуль (ЦСМ), который определяет высокое сродство ЦБГ1 к МКЦ и обеспечивает высокую эффективность деструкции субстрата этим ферментом [4-6].
Ранее [7] мы показали, что ЭГ11, продуцируемая грибом PemciПшm verruculosum, обладает высокой активностью по отношению к растворимым полисахаридным субстратам, таким как кар-боксиметилцеллюлоза (КМЦ) и Р-глюкан, однако ее активность по отношению к нерастворимой целлюлозе мала, что может быть обусловлено отсутствием ЦСМ в составе ЭГ11 (ген egII не имеет участка, кодирующего ЦСМ). Поэтому увеличение активности ЭГ11 к нерастворимой целлюлозе за счет присоединения к каталитическому кору
этого фермента ЦСМ является актуальной задачей, представляющей интерес с точки зрения практической реализации процессов биоконверсии целлюлозы и целлюлозосодержащего сырья.
Цель работы - модификация ЭГ11 P. verruculosum посредством присоединения к ней ЦСМ ЦБГ1 P. verruculosum, изучение биохимических и каталитических свойств полученной химерной формы фермента, а также анализ ее гидролитической способности.
Материалы и методы
Получение химерной формы фермента.
Первый шаг в получении химерной формы фермента заключался в получении генетической конструкции для трансформации реципиентного штамма P. canescens RN3-11-7. Для этого ампли-фицировали ген eglII и кодирующий ЦСМ участок гена cbhIcbd путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием геномной ДНК P. verruculosum, выделенной с помощью набора Dneasy Plant Mini Kit (QIAGEN, США) в качестве матрицы и набора синтетических олиго-нуклеотидов (табл. 1). В обоих экспериментах использовали Long PCR mix (LPM-полимераза, «ThermoScientific», США). Осуществлены 15 циклов ПЦР с соблюдением определенных условий: первичную денатурацию проводили при 95 °С (3 мин), денатурацию в цикле - при 95 °С (1 мин), отжиг праймеров - при 50 °С (1 мин), синтез полинуклеотидной цепи - при 68 °С (1 мин). Полученные ПЦР-продукты выделяли из агарозного геля с помощью набора QiAquick Gel Extraction Kit («QIAGEN», США). Выделенные из геля фрагменты длиной 1316 и 189 п.о., взятые соответственно в количестве 5 и 25 нг, смешивали и проводили ПЦР, используя олигонуклеотиды EGII-UpL, СБШ-LowL и LPM-полимеразу («ThermoScientific», США). Условия проведения ПЦР в этом случае были следующи-
ми: первичная денатурация - 95 °C (30 с), денатурация в цикле - 95 °C (15 с), отжиг праймеров - 50 °C (1 мин), синтез полинуклеотидной цепи - 68 °C (1,5 мин). Проводено 20 циклов.
Полученный амплификат размером 1505 п.о., соответствующий химерной конструцкии eglII-cbhIcbd, клонировали в вектор PC1 [8] по методике независимого лигирования, описанной в [9]. Полученные плазмиды серии pPC1-CHIM выделяли с помощью набора QIAprep SPIN Miniprep Kit («QIAGEN», CША) и секвенировали по методу Сэнгера в обоих направлениях [10].
Далее плазмиду pPC1-CHIM1 котрансфор-мировали в ауксотрофный штамм-реципиент P. canescens RN3-11-7 вместе с плазмидой pSTA10 (10:1, мкг) по модифицированной методике [11]. Полученные трансформанты культивировали в объеме 100 мл в качалочных колбах Эрленмей-ера. Для культивирования использовали стандартную ферментационную среду следующего состава (г/л): кукурузный экстракт - 50, соевая шелуха - 45, KH2PO4 - 25. Критерием отбора трансформантов служило наличие полосы на электрофореграмме в области 50 кДа. При проведении электрофореза в качестве отрицательного контроля присутствовали культуральные жидкости (КЖ) нетрансформированного штамма P. canescens RN3-11-7 и КЖ рекомбинантного штамма - продуцента ЭГП. Электрофорез белков проводили в 12%-м полиакриламидном геле (ПААГ) на приборе «Mini Protean II» («Bio-Rad Laboratories», США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Белковые полосы в гелях окрашивали красителем Кумасси бриллиантовым голубым R-250 («Ferak», Германия). В качестве маркеров использовали смеси белков #26610 (14-116 кДа) производства фирмы «Thermo Scientific» (США).
Выделение и очистка рекомбинантных эн-доглюканаз. Выделение гомогенных рекомби-
Т а б л и ц а 1
Последовательности синтетических олигонуклеотидов, использованных в работе
Название Последовательность (5' ^ 3')
EGП-CBD-fwd TGGAGACTTATTTTGGCTCTAGCACCGGTGGCAG
EGП-CBD-rev ACCGGTGCTAGAGCCAAAATAAGTCTCCAAAATCG
EGII-UpL CAAACAGAAGCAACCGACACAATGAAGGCCAGTATCATTCCTG
СВШ-LowL AGAGCAAGCCGAGCAGGTTACAAGCATTGCGAGTAGTAAG
нантной ЭГ11 с ЦСМ и рекомбинантной формы ЭГ11 без ЦСМ осуществляли в три стадии: обессоливание ферментного препарата (ФП), анионообменная хроматография (АОХ), гидрофобная хроматография (ГФХ). Аналитическое фракционирование проводили с помощью системы высокоэффективной жидкостной хроматографии AKTA Purifier 100 FPLC System («GE Healthcare», Швеция), а также колонки и носители фирм «Pharmacia» и «GE Healthcare» (Швеция). Навеску ФП растворяли в стартовом буфере (20 мМ Bis-Tris/HCl; рН 6,8). Для обессоливания использовали систему низкого давления Econo-System («BioRad», США). ФП обессоливали на колонке с акрилексом П2 фирмы «Reanal» (Венгрия) в стартовом буфере. Далее проводили АОХ на колонке с носителем Source 15Q. Образец наносили в соответствующем стартовом буфере; связавшиеся белки элюировали при градиенте концентрации NaCl от 0 до 0,4 М. В полученных при элюировании фракциях определяли авицелазную, КМЦ-азную, ß-глюканазную и ксиланазную активность, а также содержание белка. Полученные фракции, обладающие активностью по ß-глюкану подвергали ГФХ на колонке с носителем Source 15 ISO («GE Healthcare», США), уравновешенной 0,05 М Na-ацетатным буфером, рН 5,0 в присутствии 1,7 М (NH4)2SO4. Связавшийся с носителем белок элюировали 0,05 М Na-ацетатным буфером (рН 5,0) в линейно убывающем градиенте (NH4)2SO4 от 1,7 до 0 М; скорость элюирования составляла 7 мл/мин. Фракции, полученные после ГФХ, обессоливали на колонке с носителем BioGel Р2, уравновешенной 0,05 М ^-ацетатном буфером (pH 5,0).
Идентификация эндоглюканаз методом масс-спектрометрии. Идентификацию ЭГ11 в присутствии и в отсутствие ЦСМ проводили методом пептидного картирования после расщепления белка, содержащегося в соответствующей полосе геля после электрофореза, с помощью трипсина («Promega», США) [12]. МАЛДИ-масс-спектрометрию трипсинового гидролизата белка проводили на времяпролетном масс-спектрометре «UltrafleXtreme» («Bruker Daltonik GmbH», Гер -мания). Полученные данные анализировали путем сравнения массы полученных пептидов и массы теоретических пептидов, рассчитанных с помощью онлайн-сервиса PeptideMass (http:// web.expasy.org/peptide_mass/).
Определение активности эндоглюканаз. Значения ферментативной активности определяли по следующим субстратам: ß-глюкан
(«Megazyme», Ирландия), натриевая соль КМЦ («Sigma-Aldrich», США), МКЦ (ООО «МК-Центр», Россия). Активность к растворимым по-лисахаридным субстратам определяли при 50 °С и рН 5,0 по начальной скорости образования восстанавливающих сахаров (ВС). Концентрация полисахаридного субстрата в реакционной смеси составляла 5 г/л. Активность по отношению к МКЦ определяли при 40 °С и рН 5,0 также по начальной скорости образования ВС. Концентрацию ВС определяли методом Шомо-ди-Нельсона [13].
Активность ферментов выражали в международных единицах (1 единица соответствует образованию 1 мкмоль продукта за 1 мин при действии ферментов на соответствующий субстрат).
Изучение адсорбционной способности эндоглюканаз. Для изучения адсорбционной способности ЭГ11 на МКЦ в присутствии и в отсутствие ЦСМ готовили суспензию МКЦ (50 г/л) в растворе гомогенного фермента (0,2 г/л). Эксперимент проводили при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 30 мин и 8 °С. Далее смесь центрифугировали в течение 3 мин при 14 000 об/мин, затем в супернатанте определяли остаточную концентрацию белка по поглощению при длине волны 280 нм. Результаты выражали в процентном содержании адсорбированного белка по отношению к исходному значению.
Определение кинетических параметров действия эндоглюканаз. Кинетические параметры (Km, kcat) гидролиза ß-глюкана и КМЦ под действием эндоглюканаз определяли по зависимости величины начальной скорости реакции гидролиза (50 °С; рН 5,0) от концентрации субстрата (1-20 г/л) в координатах Лайнуивера-Берка.
Анализ продуктов гидролиза МКЦ. Состав продуктов гидролиза МКЦ определяли методом ВЭЖХ с помощью хроматографа «Agilent 1100 Series» («Agilent Technologies», США) на колонке CarboPac PA-100 («Dionex», США). В качестве детектора использовали электрохимический детектор «Coulochem III ESA» («Dionex», США) с золотым электродом в режиме пульсирующей амперометрии. В качестве стандартов применяли глюкозу, целлобиозу, целлотриозу, целлотетраозу и целлопентаозу («Merck», Германия).
Гидролитическая способность ферментов по отношению к целлюлозосодержащим субстратам. В качестве субстратов для определения гидролитической способности целлюлаз использовали МКЦ и осиновую древесину, измельченную на шаровой мельнице «АГО-2» (Новосибирск, Россия). Реакционная ячейка представляла
собой пластиковую пробирку с закручивающейся крышкой объемом 2 мл (объем реакционной смеси составлял 1,5 мл); для обеспечения перемешивания реакционной смеси в ячейку помещали металлический мешальник. Эксперимент проводили при температуре 50 °С и pH 5,0 (0,1 М Na-ацетатный буфер) при постоянном перемешивании 1000 об./мин, используя термошейкер «BIOSAN TS-100» («BIOSAN», Латвия). Концентрация субстрата составляла 100 г/л (в пересчете на сухое вещество). При проведении гидролиза использовали тройные смеси индивидуальных ферментов (дозировка смеси ферментов составляла 2 мг белка на 1 г субстрата). В состав смеси входили ЭГ11-ЦСМ (или ЭГ11), ЦБГ1 и БГЛ. Ранее [7] было установлено оптимальное для конверсии целлюлозы соотношение ЦБГ1 и ЭГ11, равное 80:20 (по концентрации белка), 10% этой смеси заменяли БГЛ. Гидролиз проводили в течение двух суток. Через 6, 24 и 48 ч из реакционной смеси отбирали пробы, центрифугировали и использовали супернатант для дальнейшего анализа. В пробах методом Шомоди-Нельсона определяли концентрацию ВС [13].
Результаты и их обсуждение
При использовании геномной ДНК P. verruculosum в качестве матрицы методом ПЦР были амплифицированы и выделены фрагменты, соответствующие целевому гену eglII и участку
гена cbhl , ЦБГ1, кодирующего ЦСМ. Полину-клеотидные последовательности объединили методом ПЦР, а затем клонировали, используя клетки E. coli MACHI, в вектор PC1 для наработки генетического материала с последующим анализом последовательности секвенированием. Плазмиду pPC1-CHIM1 трансформировали в ауксотрофный штамм-реципиент P. canescens RN3-11-7, в результате чего был получен набор трансформантов, обладающих признаком прототрофности (т.е. признаком трансформантов, выросших на агари-зованных средах с 10 мМ NaNO3).
Полученные трансформанты культивировали в качалочных колбах, скрининг трансформантов осуществляли по наличию полосы, соответствующей ~50 кДа на Ds-Na-ПААГ-электрофорезе КЖ (рис. 1, А). В качестве контроля использовали штамм-реципиент, не содержащий реком-бинантный фермент. В КЖ, характеризующихся наличием искомой полосы, определяли активность по отношению к КМЦ и ß-глюкану относительно КЖ штамма-реципиента. В результате был отобран рекомбинантный штамм В-1, обладающий максимальным значением КМЦ-азной и ß-глюканазной активности, который далее культивировали в ферментере объемом 1 л, используя ферментационную среду того же состава, что и при культивировании трансформантов в качалоч-ных колбах. Полученную КЖ сушили на лабораторной распылительной сушилке («BUCHI-290»,
Рис. 1. А - электрофореграмма КЖ рекомбинантных штаммов-продуцентов химерной формы ЭГ11-ЦСМ; представлены трансформанты с высокой секрецией целевого белка (отмечен стрелкой) А-2, 14, 22 и В-1; трансформант В-1 отобран для дальнейших исследований; Б - электрофореграмма гомогенных ферментов: 1 - рекомбинантная ЭГ11 P verruculosum, 2 - химерная форма ЭГ11 с ЦСМ (выделенная из трансформанта В-1), 3 - стандартные белковые маркеры для Б5-№-ПААГ
Швейцария), в результате был получен сухой ферментный препарат В-1-2895.
Выделение химерной формы ЭГ11 из этого ФП осуществляли по методике, описанной в разделе «Материалы и методы». Была получена гомогенная форма ЭГ11-ЦСМ с массой 51 кДа. Контролем служила рекомбинантная ЭГ11 Р. verruculosum с массой 40 кДа без ЦСМ, выделенная в гомогенном виде по методике, аналогичной использованной для выделения ЭГ11-ЦСМ (рис. 1, Б).
Идентификацию ЭГ11-ЦСМ проводили методом пептидного картирования путем расщепления трипсином белка, содержащегося в соответствующей полосе геля после 08-Ыа-ПААГ-электрофореза, с последующей МАЬОЬ ТОБ-масс-спектрометрией полученных смесей пептидов. Установлено, что полоса, соответствующая массе 51 кДа, действительно принадлежит химерной форме ЭГ11-ЦСМ. Следует отметить, что химерный белок был преобладающим компонентом ФП В-1-2895, его содержание в препарате составило 40% (по белку).
Согласно литературным данным [14], для эн-доглюканаз характерна высокая активность по отношению к 1,4-Р-глюкозидным связям КМЦ и (1,4-;1,3-)Р-глюкана. Наряду с этим эндоглюкана-зы способны гидролизовать Р-1,3-глюкозидные связи в (1,4-;1,3-)Р-глюкане и 1,3-Р-глюкане [15]. Значения удельной активности полученной химерной ЭГ11-ЦСМ по отношению к разным субстратам приведены в табл. 2 (активность определена по начальной скорости гидролиза соответствующих субстратов). Сравнение проводили с рекомбинантной ЭГ11 Р. verruculosum, не содержащей ЦСМ [16-17]. Химерная ЭГ11-ЦСМ обладала меньшей активностью по КМЦ и Р-глюкану, чем рекомбинантная ЭГ11, однако активность ЭГ11-ЦСМ по отношению к МКЦ выросла более чем 20 раз. Таким образом, присоединение ЦСМ
увеличивает активность ЭГ11 по отношению к нерастворимой целлюлозе, однако снижает этот показатель по отношению к растворимым поли-сахаридным субстратам.
В табл. 2 представлены данные по адсорбционной способности химерного (ЭГ11-ЦСМ) и рекомбинантного (ЭГ11) ферментов, определенной на основании остаточной концентрации белка после инкубации раствора ферментов с МКЦ (см. «Материалы и методы»). Установлено, что в условиях эксперимента адсорбция ЭГ11-ЦСМ на МКЦ составила 64%, тогда как ЭГ11 на МКЦ не адсорбировалась вовсе. Вероятно, увеличение удельной активности химерного фермента по отношению к МКЦ объясняется увеличением его сродства к нерастворимому субстрату за счет увеличения адсорбционной способности.
Кинетические параметры (Кт, кса1) были определены по отношению к двум специфическим субстратам - КМЦ и Р-глюкану (табл. 3). ЭГ11-ЦСМ обладала большим сродством к обоим субстратам, чем ЭГ11 (значение Кт химерного фермента уменьшилось в 2 раза). При этом каталитическая константа для ЭГ11-ЦСМ по отношению к КМЦ уменьшилась по сравнению с ЭГ11 в 6 раз, а для Р-глюкана - в 24 раза. Возможно, это связано со стерическими затруднениями для доступа активного центра химерной формы ЭГ11 к полисахаридным субстратам из-за наличия ЦСМ. Таким образом, пришивка ЦСМ к каталитическому кору ЭГ11 обеспечивает некоторое увеличение сродства химерного фермента к растворимым полисахаридным субстратам, однако вызывает затруднения в осуществлении каталитического акта, приводящие к общему уменьшению каталитической эффективности (параметр ксЛ/Кт, табл. 3). Этим можно объяснить отмеченное выше уменьшение удельной активности химерной формы фермента по отношению
Т а б л и ц а 2
Удельные активности (ед./мг белка) гомогенных эндоглюканаз по отношению к различным субстратам (50 °С, рН 5,0); адсорбционная способность на МКЦ
(в % от исходного значения)
Удельная активность по следующим субстратам, ед./мг: Фермент
ЭГ11 ЭГ11-ЦСМ
КМЦ 40±1 13±0,4
Р-Глюкан 28±1 16±0,5
МКЦ 0,003±0,0003 0,06±0,002
Адсорбционная способность, % 0 64±2
Т а б л и ц а 3
Кинетические параметры гидролиза КМЦ и р-глюкана гомогенными эндоглюканазами
(50 °С, рН 5,0)
Субстрат Кинетический параметр Фермент
ЭГ11 ЭГ11-ЦСМ
КМЦ К„ г/л 10,1±0,3 5,8±0,2
Ка*, 1/с 49±2 8,2±0,3
Кш /Кт, л/(с г) 4,85±0,15 1,41±0,04
Р-Глюкан Кт, г/л 9,7±0,3 5,8±0,2
К*, 1/с 231±7 9,6±0,3
Кш /Кт, л/(с г) 23,8±0,7 1,66±0,05
Т а б л и ц а 4
Выход низкомолекулярных Сахаров после 48 ч гидролиза МКЦ гомогенными ферментами
Степень полимеризации (в1сп) Содержание продуктов, %
ЭГ11 ЭГ11-ЦСМ
вЦ 1 1
в1с2 3,4 43
в1с3 1,5 1
01с4 6 52
в1с5 0,7 1
>01с6 >87 <2
к растворимым полисахаридным субстратам по сравнению с ЭГ11.
К интересным выводам приводит сравнение продуктов гидролиза МКЦ, полученных с применением ЭГ11-ЦСМ и ЭГ11. Гидролиз МКЦ проводили в течение 48 ч (40 °С, рН 5) при постоянном перемешивании, концентрация субстрата составила 100 г/л, ферменты дозировали по концентрации белка из расчета 2 мг/г субстрата. Результаты представлены в табл. 4. Основные продукты действия ЭГ11-ЦСМ - целлотетраоза (52%) и целлобиоза (43%), при этом содержание олиго-сахаридов со степенью полимеризации больше 6 не превышало 2%, что отличается от состава продуктов, образующихся под действием ЭГ11, основная доля которых (87%) приходилась именно на олигосахариды со степенью полимеризации больше 6. Это свидетельствует об увеличении степени процессивности в действии ЭГ11 на нерастворимую целлюлозу после пришивки ЦСМ к
каталитическому домену, тогда как ЭГ11 без ЦСМ осуществляет деструкцию целлюлозы по неупорядоченному механизму.
В завершение была изучена гидролитическая способность ЭГ11-ЦСМ по отношению к целлюлозе и целлюлозосодержащим субстратам, в качестве которых были выбраны соответственно МКЦ и измельченная на шаровой планетарной мельнице осиновая древесина (условия эксперимента приведены в разделе «Материалы и методы»). За критерий гидролитической способности принимали выход ВС за 24 ч гидролиза. Гидролиз проводили смесями гомогенных ЭГ11-ЦСМ (или ЭГ11), ЦБГ1 P. verruculosum и БГЛ A. niger при их соотношении 18:72:10 (ранее нами было показано, что такое соотношение является оптимальным [7]). Результаты гидролиза МКЦ и измельченной осиновой древесины представлены на рис. 2.
Наличие ЦСМ позволяет химерной форме фермента более эффективно гидролизовать
ЦБГ1 + ЭГП + БГ ЦБГ1 + ЭГП(ЦСМ) + БГ ЦБП + ЭГП + БГ ЦБГ1 + ЭГН(ЦСМ) + БГ
Рис. 2. Выход ВС при гидролизе МКЦ (А) и измельченной осиновой древесины (Б). Условия: 40 °С; рН 5,0: [субстрат] = 100г/л (сухая масса), [Е] = 2 мг белка/г субстрата, перемешивание 250 колебаний/мин
целлюлозосодержащие субстраты и увеличить выход продуктов. Наличие ЦСМ у ЭГ11 приводит к увеличению выхода продуктов гидролиза как при действии на МКЦ (рис. 2, А), так и на измельченную осиновую древесину (рис. 2, Б). Прирост ВС в случае гидролиза МКЦ комплексом ферментов, в состав которого входила ЭГ11-ЦСМ по сравнению с комплексом, содержавшим ЭГ11, составил 22%, в случае гидролиза измельченной осиновой древесины - 42%.
Таким образом, применение методов генетической инженерии позволило получить химерную
форму ЭГ11, к важнейшим приобретенным признаком которой можно отнести увеличение активности к нерастворимой целлюлозе, а также появление способности адсорбироваться на ней. Наличие ЦСМ позволило химерной форме фермента в составе целлюлазного комплекса более эффективно гидролизовать целлюлозосодержащие субстраты и увеличить выход продуктов (сахаров).
Работа выполнена при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 18-54-80027). Конфликта интересов нет.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kumar R., Singh S., Singh O.V. // J. Industr. Microbiol. Biotechnol. 2008. Vol. 35. N 5. P. 377.
2. Merino S.T., Cherry J. // Advan. Biochem. Engin./ Biotechnol. 2007. Vol. 108. P. 95.
3. Sims R.E.H., Mabee W., Saddler J.N., Taylor M. // Biores. Technol. 2010. Vol. 101. P. 1570.
4. Tseng C.W., Ko T.P., Guo R.T., Huang J.W., Wang H.C., Huang C.H., Xheng Y.S., Wang A., Liu J.R. // Acta Cryst. F. 2011. Vol. 67. N 10. P. 1189.
5. Morozova V.V., GusakovA.V., AndrianovR.M., Pravil-nikovA.G., Osipov D.O., Sinitsyn A.P. // Biotechnol. J. 2010. Vol. 5. P. 871.
6. Lee T.M., Farrow M.F., Arnold F.H., Mayo S.L. // Protein Sci. 2011. Vol. 20. N 11. P. 1935.
7. Волков П.В., Рожкова А.М., Правильников А.Г., Андрианов Р.М., Доценко Г.С., Беккаревич А.О:, Кошелев А.В., Окунев О.Н., Зоров И.Н., Синицын А.П // Прикл. биохим. микробиол. 2012. Т. 48. N 1. С. 66.
8. Sinitsyn, A. P. and Rozhkova, A. M. // Microbiology Monographs, Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg. 2015. P. 1.
9. Aslanidis C. and de Jong J.P. // Nucl. Acids Res. 1990. Vol. 18. P. 6069.
10. Sanger F., Nicklen S., Chase A.R. // Proc. Nat Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74. Р. 5463.
11. Aleksenko A.Y., Makarova N.A., Nikolaev I.V., Clutter-buchA.J. // Current Genetic. 1995. N 28. P. 474.
12. James P. Proteome research: mass spectrometry - principles and practice. Heidelberg, 2001.
13. Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. // ВИНИТИ. М., 1990. Т. 25. С. 30.
14. Vlasenko E., Schulein M., Cherry J., Xu F. // Biores. Technol. 2010. Vol. 101. P. 2405.
15. Bacic A., Fincher G., Stone B. Chemistry, biochemistry and biology of (1-3)-p-glucans and related polysaccharides. N.Y., 2019.
16. Dotsenko A.S., Gusakov A.V., Volkov P.V., Rozhkova A.M., Sinitsyn A.P. // Biotechnol. Bioeng. 2016. Vol. 113. P. 283.
17. Мерзлов Д.А., Зоров И.Н., Доценко Г.С., Денисенко Ю.А., Рожкова А.М, Сатрутдинов А.Д., Рубцова Е.А., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. // Биохимия. 2015. Т. 80. Вып. 4. С. 556.
Поступила в редакцию 25.03.2019 Получена после доработки 29.03.2019 Принята к публикации 01.04.2019
COMPARATIVE ANALYSIS OF THE PROPERTIES OF RECOMBINANT ENDO-1,4-P-GLUCANASE II AND ITS CHIMERIC FORM WITH A CELLULAR BINDING MODULE
O.G. Korotkova1*, M.V. Semenova1, E.A. Rubtsova1, О.А. Sinitsyna2, E.G. Kondrat eva1, N.M. Bibikov3, А.М. Rozhkova1*, A.P. Sinitsyn1,2
(1 Federal Research Centre "Fundamentals of Biotechnology", Russian Academy of Sciences; 2 Department of Chemical Enzymology, Faculty of Chemistry, M.V. Lomono-sov Moscow State University;3Faculty of biological, M.V. Lomonosov Moscow State University;*e-mail: amrojkova@mail.ru)
A chimeric form of Penicillium verruculosum endo-1,4-p-glucanase II (EGII), to the C-terminus of which contains a cellulose-binding module (CBM) of P. verruculosum cellobiohydrolase I, has produced by genetic engineering method. In native form the egll gene does not have a region encoding CBM. The resulting chimeric enzyme was isolated in a homogeneous form and its properties has been studied. The addition of CBM to EGII led to significant increase in the activity of the chimeric enzyme to microcrystalline cellulose (MCC), as well as its adsorption capacity for cellulose has been observed. However, the addition of CBM to EGII led to a decrease in activity towards soluble polysaccharide substrates (carboxymethylcellulose and p-glucan). The chimeric form of the enzyme in the composition of the cellulase complex allowed to hydrolyze cellulose-containing substrates more effectively. The increase in reducing sugars (RS) in the case of MCC hydrolysis was 22% after 24 hours with a cellulose complex containing cellobiohydrolase I, p-glucosidase and EGII-CBM in comparison to the complex containing EGII without CBM.
Key words: endo-1,4-b-endoglucanase, complex of cellulases, cellulose-binding module, hydrolysis, Penicillium verruculosum.
Сведения об авторах: Короткова Ольга Генриховна - науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. хим. наук (littletempo@yandex.ru); Семенова Маргарита Викторовна - науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. хим. наук (margs@mail.ru); Рубцова Екатерина Александровна - науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. хим. наук (katefedo@yandex.ru ); Синицына Ольга Аркадьевна - ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук (oasinitsyna@gmail. com); Кондратьева Елена Геннадьевна - ст. науч. сотр. лаборатории химической энзимологии Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. физ-матем. наук (elgenkon@inbox.ru); Бибиков Никита Михайлович - студент магистратуры биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (bibik0808@mail.ru); Рожкова Александра Михайловна - ст. науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. хим. наук (amrojkova@yahoo.com); Синицын Аркадий Пантелеймонович - зав. лаб. на кафедре химической энзимологии МГУ имени М.В. Ломоносова и зав. лаб. биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, докт. хим. наук, профессор (apsinitsyn@gmail.com).
