CC BY
30
УДК 577.15, 663.15
СВОЙСТВА И N-ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ЭНДОГЛЮКАНАЗЫ II
Pénicillium verruculosum
А.С. Доценко , А.М. Рожкова, А.В. Гусаков
(кафедра химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова; e-mail: ansdotsenko@ gmail.com)*
Целлюлазы являются основными компонентами ферментных комплексов, используемых в процессах биотрансформации растительного сырья в коммерчески значимые продукты. Эндоглюканаза II (ЭГП) из гриба Pénicillium verruculosum была клонирована в Pénicillium canescens. Выделена рекомбинантная форма ЭГП в гомогенном состоянии и изучены ее свойства в сравнении с нативным ферментом. С помощью масс-спектрометрического анализа определены сайты N-гликозилирования и структуры N-связанных гликанов. Рекомбинантная ЭГП по своим биохимическим и каталитическим свойствам, а также типу N-гликозилирования практически не отличается от нативного фермента. На двух потенциальных сайтах N-гликозилирования (N42 и N194) в обеих формах фермента обнаружены N-связанные высокоманнозные гликаны (либо продукты их ферментативного «тримминга»), согласно общей формуле (Man)19(GlcNAc)2. На третьем потенциальном сайте (N19) гликозилирования не обнаружено.
Ключевые слова: целлюлаза, эндоглюканаза, Penicillium verruculosum, клонирование, N-гликозилирование.
Путем биотехнологической переработки растительного лигноцеллюлозного сырья можно получать такие коммерчески значимые продукты, как органические спирты и кислоты, углеводороды, простые и сложные эфиры и т.д. Основной компонент лигноцеллюлозного сырья - целлюлоза, поэтому ключевым этапом его переработки является ферментативная кон -версия целлюлозы в глюкозу [1]. Для эффективного гидролиза целлюлозы используют ком -плексные ферментные препараты целлюлаз, содержащие целлобиогидролазы, эндоглюканазы и Р-глюкозидазы. Целлобиогидролазы катализируют гидролиз кристаллической формы целлюлозы, последовательно отщепляя целлобиозу от концов полисахаридной цепи; эндоглюканазы катализируют гидролиз аморфных участков целлюлозы, расщепляя гликозидные связи внутри цепи полимера и создавая новые сайты для действия целлобиогидролаз; Р-глюкозидазы гидролизуют целлобиозу и другие олигосахари-ды до финального продукта - глюкозы [2]. При этом для создания эффективных комплексных ферментных препаратов часто требуется осуществить экспрессию целлюлаз, находящихся в составе секретируемого комплекса ферментов
другого микроорганизма. Таким образом, возникает вопрос соответствия биохимических и каталитических свойств нативной и рекомби-нантной форм целлюлаз.
Грибы из рода Penicillium зарекомендовали себя как эффективные продуценты высокоактивных целлюлаз [3]. Эндоглюканаза II (ЭГ11) является одним из ключевых ферментов целлю-лолитического комплекса, секретируемого мице-лиальным грибом Penicillium verruculosum [4, 5].
Недавно было обнаружено, что гликозилиро-вание (в частности N-гликозилирование) целлюлаз может оказывать существенное влияние на их активность по отношению к различным видам целлюлозы за счет того, что N-связанные гликаны способны взаимодействовать с полисахаридным субстратом, в том числе и те из них, которые находятся на периферии белковой глобулы [6, 7]. Поэтому в последнее время возник значительный интерес к данному вопросу.
Цель данной работы - выделение рекомбинант-ной формы ЭГ11 P verruculosum, экспрессированной в Penicillium canescens, изучение ее биохимических и каталитических свойств в сравнении с нативной ЭГП, а также выявление типа N-гликозилирования в указанных формах фермента.
* Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН.
Материалы и методы
Клонирование ЭГ11
Из геномной ДНК P. verruculosum методом ПЦР выделен фрагмент, соответствующий гену ЭГП; для проведения ПЦР и выделения ПЦР-продуктов использованы наборы реактивов фирм «Fermentas» (Литва) и «Qiagen» (США). Ген ЭГП клонирован в шаттл-вектор, и полученная экс-прессионная конструкция трансформирована в клетки Escherichia coli для наработки и анализа ДНК-материала. После подтверждения последовательности гена секвенированием экспрессионная конструкция трансформирована в P canescens, который является лабораторным микроорганизмом для гетерологичной экспрессии белков [7]. В результате ЭГП из P verruculosum была экспрессиро-вана в P. canescens в составе комплекса ферментов, секретируемого данным грибом.
Выделение и очистка ферментов
Рекомбинантная и нативная формы ЭГП выделены и очищены методами анионообменной и гидрофобной хроматографии. Фракционирование и очистку ферментов проводили с помощью хроматографической системы AKTA UPC («GE Healthcare», США). Для проведения анионооб-менной хроматографии использовали колонку с носителем Source 15Q («GE Healthcare», США), уравновешенную 0,01 M Bis-tris/НСl буфером (pH 6,5); фракционирование осуществляли в линейном градиенте концентрации NaCl от 0 до 0,4 М. Для проведения гидрофобной хроматографии использовали колонку с носителем Source 15 ISO («GE Healthcare», США) и 0,05 М Na-ацетатный буфер (рН 5,0); фракционирование осуществляли в линейно убывающем (от 1,7 до 0 М) градиенте (NH4)2SO4. Для обессоливания полученных фракций использовали колонку с носителем Bio-Gel Р2 («Bio-Rad Laboratories», США) и 0,05 М N-ацетатный буфер (pH 5,0).
Масс-спектрометрический анализ
Идентификацию очищенных ферментов и анализ N-связанных гликанов проводили методом времяпролетной МАЛДИ-масс-спектрометрии на масс-спектрометре «UltrafleXtreme» («Bruker Daltonik GmbH», Германия). Кусочки геля после электрофореза в присутствии ДДС-Na, вырезанные из соответствующих белковых полос, отмывали от красителя и обрабатывали химотрипси-ном или пепсином для секвенирования белков («Sigma», США), используя стандартный протокол [8]. Полученные пептиды экстрагировали с помощью 20%-го раствора ацетонитрила в воде,
содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты, и подвергали МАЛДИ-масс-спектрометрическому анализу. Сайты N-гликозилирования и структуры N-связанных гликанов определяли по данным масс-спектрометрического анализа с использованием сервиса GlycoMod (http://web.expasy.org/ glycomod/) [9, 10].
Исследование биохимических и каталитических свойств
Биохимические и каталитические свойства ре-комбинантной формы ЭГ11 изучены в сравнении с нативным ферментом. Активность ферментов по отношению к полисахаридным субстратам (Р-глюкан («Megazyme», Австралия), карбок-симетилцеллюлоза (КМЦ), микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ), ксилан («Sigma», США)) определяли по начальной скорости образования восстанавливающих сахаров (ВС) методом Шо-моди-Нельсона [11, 12]. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль ВС в 1 мин при концентрации субстрата 5 г/л. Активность по и-нитрофенильным производным сахаров («Sigma», США) определяли по начальной скорости образования и-нитрофенола [13]. Концентрацию белка определяли по методу Лоури [14] с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта.
Результаты и их обсуждение
Основные свойства рекомбинантной формы ЭГ11 оказались похожими на таковые для натив-ной формы. Как рекомбинантный, так и натив-ный ферменты характеризовались практически одинаковым температурным профилем активности по Р-глюкану с оптимумом действия при 70°С, схожей термостабильностью, а также рН-профилем активности с оптимумом действия при рН 4,5 (здесь эти данные подробно не приводятся, так как они практически совпадали с описанными ранее свойствами эндоглюканазы 39 кДа P. verruculosum [4]).
По субстратной специфичности и удельной активности по отношению к разным субстратам рекомбинантная форма ЭГ11 также практически не отличалась от нативного фермента (табл. 1). Обе формы проявляли наибольшую активность по отношению к КМЦ и Р-глюкану, слабо гидро-лизовали МКЦ и не были активными по отношению к ксилану и и-нитрофенильным производным сахаров (и-нитрофенил-Р-целлобиозиду, и-нитрофенил-Р-лактозиду и и-нитрофенил-Р-D-глюкопиранозиду).
Т а б л и ц а 1
Удельная активность (Ед/мг) рекомбинантной и нативной форм ЭГ11 P. verruculosum по отношению
к различным субстратам*
Субстрат Рекомбинантная ЭГ11 Нативная ЭГ11
ß-Глюкан 60±6 61±6
КМЦ 58±6 50±5
МКЦ ~0,008 ~0,008
Ксилан н.д. н.д.
w-Нитрофенил-ß-целлобиозид н.д. н.д.
п -Нитрофенил- ß - лактозид н.д. н.д.
п -Нитрофенил- ß -D-глюкопиранозид н.д. н.д.
* н.д. - активность не детектировалась.
В аминокислотной последовательности ЭГ11 были обнаружены три потенциальных сайта Н-гликозилирования, содержащих мотив К-Х-8/Т, необходимый для осуществления такого типа посттрансляционной модификации белка [15]: N19, N42 и N194 (нумерация аминокислотных остатков приведена для зрелого фермента). На рисунке приведена структура ЭГ11, где показаны потенциальные сайты К-гликозилирования (кристаллическая структура фермента получена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (г. Пущино) и любезно предоставлена канд. биол. наук В.А. Немашкало-вым). Остаток N19 расположен на дне «ущелья» активного центра фермента, тогда как остатки N42 и N194 - по бокам белковой глобулы на входе и выходе из «ущелья».
Структура ЭГ11 из P. verruculosum. Черным цветом отмечены потенциальные сайты N-гликозилирования
Для идентификации возможных N-связанных гликанов использовали метод масс-спектро-метрического картирования пептидов, полученных после обработки фермента специфичной протеазой, с последующим анализом данных с помощью онлайн-сервиса GlycoMod (http:// web.expasy.org/glycomod/) [9, 10]. Предварительный теоретический анализ аминокислотной последовательности ЭГ11 показал, что в случае обработки фермента трипсином (наиболее часто используемой протеазой при такого рода анализах) пептиды, содержащие потенциальные сайты N-гликозилирования, имели бы весьма высокую массу (более 5000 Да), что затруднило бы их идентификацию при масс-спектрометрическом анализе, учитывая дополнительную массу N-связанных гликанов. Поэтому протеолиз рекомбинантной и нативной форм ЭГ11 проводили, используя химотрипсин или пепсин, действие которых, как показал теоретический анализ, должно приводить к образованию более коротких пептидов.
В гидролизате рекомбинантной формы ЭГ11, полученном под действием химотрипсина, обнаружены гликопептиды, содержащие N-связанные гликаны на сайтах гликозилирования N42 и N194. Они представляют собой высокоманнозные оли-госахариды (либо продукты их так называемого «тримминга» под действием а-маннозидазы [16]) с числом маннозных остатков от 1 до 8, согласно общей формуле (Man)1-8(GlcNAc)2. Некоторые из пиков, отмеченные звездочкой, также присутствовали в масс-спектре химотрипсинового гидролиза-та нативной ЭГ11 (табл. 2). Подобные же высоко-маннозные олигосахариды с числом маннозных остатков от 6 до 9, также связанные с сайтами гли-козилирования N42 и N194, обнаружены и в смеси
Т а б л и ц а 2
Сайты N-гликозилирования в рекомбинантной и нативной ЭГ11 P. verruculosum и структуры N-связанных гликанов, определенные с использованием сервиса GlycoMod
Фермент/протеаза Сайт N-гликозилирования Пептид Величина m/z Структура гликана
экспериментальная теоретическая
Рекомбинантная ЭГ11/химотрипсин Asn42 Thr39-Phe61 (3MC) 3957,9* 3957,8 (Man)6(GlcNAc)2
Gly17-Leu49 (2MC) 5046,4* 5046,1 (Man)8(GlcNAc)2
Asn194 Asn189-Tyr204 (3MC) 2334,0* 2334,1 (Man)j (GlcNAc)2
2658,2 2658,2 (Man)3(GlcNAc)2
2982,3 2982,3 (Man)5(GlcNAc)2
Asn189-Tyr204 (3MC, MSO) 2998,2* 2998,3 (Man)5(GlcNAc)2
Нативная ЭГ11/ пепсин Asn42 Gly35-Gln47 (3MC) 2807,4 2807,1 (Man)6(GlcNAc)2
Pro41-Leu49 (2MC) 2835,2 2835,2 (Man)9(GlcNAc)2
Asn194 Met192-Leu201 (1MC) 2807,4 2807,1 (Man)8(GlcNAc)2
О б о з н а ч е н и я. MC - нерасщепленные связи (missed cleavages), MSO - окисленный метионин.
*Такие же пики обнаружены в смеси пептидов, полученной в результате обработки нативной ЭГ11 химотрипсином.
пептидов, полученной в результате обработки нативной ЭГ11 пепсином. В то же время, по данным масс-спектрометрии, на третьем потенциальном сайте Н-гликозилирования (N19) Н-связанных гли-канов не обнаружено.
Таким образом, и нативная ЭГ11 Р. verruculosum, и ее рекомбинантная форма, экспрессиро-ванная в Р. canescens, проявляли схожий тип Н-гликозилирования, при котором как минимум два потенциальных сайта Н-гликозилирования из трех были модифицированы высокоманнозными олигосахаридами. Следует отметить, что ранее подобные высокоманнозные Н-связанные гликаны
(а также продукты их ферментативного «тримминга») были обнаружены и в других нативных или рекомбинантных ферментах, секретируемых грибом Р canescens [7, 16].
Резюмируя данные, представленные выше, можно констатировать, что рекомбинантная ЭГ11 Р verruculosum, экспрессированная в Р canescens, по своим биохимическим и каталитическим свойствам, а также по типу Н-гликозилирования практически не отличается от нативного фермента. Требуются дополнительные исследования, чтобы выяснить, как гликозилирование фермента влияет на его активность и другие свойства.
Работа выполнена при финансовой поддержке МОН РФ по результатам исследований на базе ЦКП «Промышленные биотехнологии» ИНБИ РАН - Уникальный идентификатор работ:
КРМЕР162114X0002.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kumar R., Singh S., Singh O.V. // J. Ind. Microbiol. Bio-technol. 2008. Vol. 35. N 5. P. 377.
2. Teeri T.T. // Trends Biotechnol. 1997. Vol. 15. N 5. P. 160.
3. Gusakov A.V., Sinitsyn A.P. // Biofuels. 2012. Vol. 3. N 4. P. 463.
4. Morozova V.V., Gusakov A.V, Andrianov R.M., Pravil-nikov A.G., Osipov D.O., Sinitsyn A.P. // Biotechnol. J. 2010. Vol. 5. N 8. P. 871.
5. Чекушина А.В., Доценко Г.С., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. // Биотехнология. 2013. № 3. С. 69.
6. Adney W.S., Jeoh T., Beckham G.T., Chou Y.C., Baker J.O., Michener W., Brunecky R., Himmel M.E. // Cellulose. 2009. Vol. 16. N 4. P. 699.
7. Dotsenko A.S., Gusakov A.V., Volkov P.V., Rozh-kova A.M., Sinitsyn A.P. // Biotechnol. Bioeng. 2015. Рublished online 04.09.2015, DOI: 10.1002/ bit.25812.
8. Smith B.E. // Protein sequencing protocols. Totowa, 1997.
9. Cooper C.A., Gasteiger E., Packer N. // Proteomics. 2001. Vol. 1. N 2. P. 340.
10. Gusakov A.V, Semenova M.V., Sinitsyn A.P. // J. Anal. Chem. 2010. Vol. 65. N 14. P. 1446.
11. Nelson N.A. // J. Biol. Chem. 1944. Vol. 153. P. 375.
12. Синицына О.А., Бухтояров Ф.Е., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Беккаревич А. О., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. // Биохимия. 2003. Т. 68. № 11. С. 1494.
13. Gusakov A.V, Sinitsyn A.P., Salanovich T.N., Bukhtoja-rov F.E., Markov A.V, Ustinov B.B., Zeijl C. van, Punt P., Burlingame R. // Enzyme Microb. Technol. 2005. Vol. 36. N 1. P. 57.
14. Peterson G.L. // Anal. Biochem. 1979. Vol. 100. N 2. P. 201.
15. Dwek R.A., Edge C.J., Harvey D.J., Wormald M.R., ParekhR.B. // Annu. Rev. Biochem. 1993. Vol. 62. P. 65.
16. Gusakov A.V., Sinitsyna O.A., Rozhkova A.M., Sinitsyn A.P. // Carbohydr. Res. 2013. Vol. 382. P. 71.
Поступила в редакцию 01.08.15
PROPERTIES AND N-GLYCOSYLATION OF RECOMBINANT ENDOGLUCANASE II FROM Pénicillium verruculosum
A.S. Dotsenko, A.M. Rozhkova, A.V. Gusakov
(Department of Chemical Enzymology, Faculty of Chemistry, M.V. Lomonosov Moscow State University)
Cellulose is the major component of plant cell walls and the main substrate in processes of biotransformation of lignocellulosic materials into sugars and then into commercially valid organic compounds. Thus cellulases are the major components of enzyme complexes used to hydrolyze cellulose into sugars. Endoglucanase II (EGII) from Pénicillium verruculosum was cloned into Pénicillium canescens. The recombinant EGII was isolated in homogeneous form, and its properties were studied in comparison with a native enzyme. Mass-spectrometry analysis was used to identify the N-glycosylation sites and the structures of N-linked glycans. Both the native and recombinant forms of EGII demonstrated similar biochemical and catalytic properties as well as N-glycosylation patterns. N-linked high-mannose glycans and the products of their enzymatic trimming, according to the formula (Man)1-9(GlcNAc)2, were found at two N-glycosylation sites (N42 and N194) of both EGII forms. Glycosylation at the third potential site (N19) was not detected.
Key words: cellulase, endoglucanase, Penicillium verruculosum, cloning, N-glycosylation.
Сведения об авторах: Доценко Анна Сергеевна - аспирант кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ (ansdotsenko@gmail.com); Рожкова Александра Михайловна - ст. науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и кафедры химической энзимологии МГУ, канд. хим. наук (amrojkova@yahoo.com); Гусаков Александр Васильевич - вед. науч. сотр. кафедры химической энзимологии МГУ и лаборатории биотехнологии ферментов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, докт. хим. наук, профессор (avgusakov@enzyme.chem.msu.ru).
