CC BY
62
УДК 577.212.3::575.86
К.Е. Усов1, 2, А.А. Коханенко2, В.Н. Стегний1, 2
1 Томский государственный университет (г. Томск)
2Научно-исследовательский институт биологии и биофизики Томского государственного университета (г. Томск)
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СОСТАВА ДНК ПРИЦЕНТРОМЕРНОГО ГЕТЕРОХРОМАТИНА ХРОМОСОМ Drosophila orena И Drosophila virilis (Diptera: Drosophilidae)
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 12-04-31202-мол_а), частичной финансовой поддержке гранта ФЦП № 2012-1.1-12-000-1001-039 и стипендии Президента РФ СП-1037.2013.4.
Проведена дот-блот гибридизация район-специфичной ДНК-библиотеки из хромоцентра D. virilis (DvirIII) с охарактеризованными и аннотированными 42 ДНК-клонами хромоцентра D. orena. В результате установлено, что ДНК прицентромерного гетерохроматина хромосом у D. orena и D. virilis содержит значительное количество общих последовательностей ДНК, среди которых: диспергированные повторы (мобильные генетические элементы) - представители LTR-ретротранспозонов, LINE-элементы, ДНК-транспозоны; тандемные повторы (минисателлиты), а также последовательности, гомологичные белок-кодирующим генам.
Ключевые слова: гетерохроматин; ДНК; политенные хромосомы; хромоцентр; Drosophila virilis; Drosophila orena.
Введение
Известно, что последовательности ДНК, ассоциированные с гетерохроматином, трудно поддаются секвенированию и последующему анализу из-за обогащенности повторами. Поэтому даже оконченные и опубликованные проекты по секвенированию геномов разных организмов, по сути, содержат информацию только о последовательностях ДНК, ассоциированных с эухроматином. Сейчас, однако, ясно, что для понимания принципов функционирования генома эукариот необходима полная информация о составе его последовательностей. С 2000 г. ведется работа по секвенированию ДНК гетерохроматина у многих организмов. Определенный успех был достигнут в расшифровке нуклеотидной последовательности ДНК гетерохроматина Drosophila melanogaster (Meigen, 1830) [1], Arabidopsis thaliana (Heynh, 1842) [2] и человека [3]. В 2007 г. в журнале «Science» был опубликован пятый выпуск Release 5.1, целиком посвященный последовательностям ДНК гетерохроматина D. melanogaster [4]. В этой работе представлены достаточно полные данные о 24 м.п.н. ДНК гетерохроматина этого вида и приведено
процентное соотношение разных классов последовательностей, выявленных в результате анализа этих 24 м.п.н. ДНК гетерохроматина D. melano-gaster. В результате было обнаружено, что 2/3 (16 м.п.н., 66%) ДНК гетерохроматина состоит из ретротранспозонов (33% LTRs и 33% LINEs). На ДНК-транспозоны приходится 15% ДНК гетерохроматина. В то время как на тандемные повторы приходится в целом около 10% ДНК гетерохроматина, что значительно выше, чем в ДНК эухроматина (около 3%). Особенно много таких повторов в проксимальных центромерных районах хромосом 2 и 3, а также Y. Кроме того, было обнаружено: по крайней мере 230 белок-ко-дирующих генов, которые высококонсервативны у разных видов Drosophila; 32 псевдогена; 13 генов, не кодирующих РНК [4].
С точки зрения проблемы эволюции геномов дрозофилид является важным проведение сравнительного анализа состава ДНК гетерохроматина у таких филогенетически отдаленных видов, как Drosophila orena (Tsacas, David, 1978) и Drosophila virilis (Sturtevant, 1916). Эти виды являются ан-цестральными в своих группах и содержат большое количество гетерохроматина в геномах [5-10]. Также необходимо отметить, что к настоящему времени существует пока еще не полная информация о составе ДНК эухроматина D. virilis [11], в то время как данные о составе ДНК гетерохроматина этого вида практически отсутствуют в мировых научных источниках.
Материалы и методики исследования
Материалом исследований служили 42 плазмидных клона район-специ-фичной ДНК-библиотеки хромоцентра политенных хромосом лабораторной линии D. orena и район-специфичная ДНК-библиотека хромоцентра политенных хромосом лабораторной линии D. virilis.
Дот-блот гибридизация. В основе метода лежит гибридизация ДНК, иммобилизованной на мембране с ДНК-зондом. Образцы наносятся на мембрану с помощью пипетки, этим данный метод отличается от саузерн-блот гибридизации, когда исследуемая ДНК переносится на мембрану с агарозного геля после проведения электрофореза. Метод позволяет в один эксперимент оценить гомологию фрагментов ДНК на мембране с фрагментами ДНК в гибридизационном растворе. Детекция сигнала зависит от того, какой зонд использовали (радиоактивный, биотинилированный и пр.). В настоящей работе использовался биотинилированный зонд, и для детекции применяли систему, предложенную компанией «Fermentas» (Biotin Chromogenic Detection Kit, #K0661). В основе принципа её работы лежит действие конъюгата щелочной фосфатазы со стрептавидином. Биотин-11-дУТФ, встроенный в ДНК-зонд, который в свою очередь гибридизовался с ДНК на мембране, связывает комплекс стрептавидин-щелочная фосфатаза через стрептавидин, а фосфатаза в свою очередь превращает субстрат 5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфат (BCIP-T) при последующей обработке
в нерастворимый осадок синего цвета. Сигнал можно наблюдать в виде синих пятен на мембране (рис. 1).
і *
1 .5 € ы 1Ї ІҐ
% ЧС Н и УЗ чї не ь'У 5І
€0 §4 ЯГ І6 гС ё? Иь ІІ Щ и
Щ1'Я 1ЧІ То т- иь т т иі Ц
і ! І
Е
© О О) в #"
О
о • е • О & О)
Ф % э яь •
• © 9 -
Ф # • •
і- і і 1
Рис. 1. Результат дот-блот гибридизации район-специфичной ДНК-библиотеки из хромоцентра политенных хромосом D. viriUs с ДНК-клонами хромоцентра политенных хромосом D. огепа: I - порядок расположения ДНК-клонов на мембране. В качестве контроля использовали биотинилированный зонд тотальной ДНК хромоцентра D. viriUs в количестве 1 нг, 100, 10, 1 пг;
II - сигналы в виде пятен на мембране (результат дот-блот гибридизации)
Для приготовления биотинилированного зонда ДНК хромоцентра О. уігі-№ использовали ник-трансляцию. В реакционную смесь, состоящую из 1 х буфера ДНК полимеразы I, 1 мг/мл БСА, 50 мкМ дАТФ, дГТФ и дЦТФ, 10 мкМ дТТФ, 20мкМ биотин-11-дУТФ, 0,002 ед. ДНКазы I (Promega) и 0,2 ед. ДНК полимеразы I (Promega), добавляли 1000 нг ДНК хромоцентра О. уігіїіз. Реакцию проводили при 15°С в течение 2 ч, останавливали добавлением 1 мкл 0,5М ЭДТА. Реакцию проводили в семи повторностях для получения нужного количества зонда.
Около 50 нг ДНК-клонов район-специфичной ДНК-библиотеки хромоцентра О. огепа после амплификации плазмидной ДНК наносили на положительно заряженную нитроцеллюлозную мембрану (Fermentas). Мембрану высушивали при комнатной температуре и производили иммобилизацию ДНК на мембране 5 мин экспозицией под ультрафиолетом в трансиллюминаторе.
Мембрану помещали в 80 мл предгибридизационной смеси, состоящей из 50% формамида, 0,5% SDS, 5* раствора Денхарда, и 6*ЗЗС (объем пред-гибридизационной и гибридизационной смеси устанавливали из расчета 0,2 мл/см2 мембраны). Смесь предварительно нагревали до 37°С. Кроме того, перед внесением мембраны в смесь добавляли спермальную ДНК лосося из расчета 50 мкг на см2 мембраны. Спермальную ДНК лосося денатурировали при 99°С 5 мин и охлаждали на льду 5 мин перед внесением. Предгибриди-зацию осуществляли в водяной бане при 37°С с покачиванием 50 об./мин 3 ч. После этого предгибридизационную смесь заменяли на гибридизацион-
ную сxодного состава, за исключением того, что вместо спермальной ДНК лосося в неё добавляли денатурированный ДНК-зонд, приготовленный на основе район-специфичной библиотеки ДНК xромоцентра D. virilis (из расчета 200 нг/мл). Мембрану выдерживали і ч в гибридизационной смеси с зондом при температуре 37°С при постоянном покачивании. Денатурацию связанной с мембраной ДНК проводили в водяной бане при температуре 80°С 20 мин. Гибридизация осуществлялась при температуре 37°С 36 ч. Денатурация и гибридизация сопровождались постоянным покачиванием мембраны в растворе. Отмывка проводилась при комнатной температуре в 2*SSC с 0,і% SDС дважды по 5 мин и при температуре 60°С в 0,^SSC с
0,і% SDC дважды по 20 мин. Далее мембрану сушили на фильтровальной бумаге 5 с и проводили отмывку и детекцию сигнала с помощью набора Biotin detection kit (Fermentas) по предложенному протоколу.
Результаты исследования и обсуждение
Ранее нами методом микродиссекции была получена район-специфич-ная библиотека ДНК xромоцентра политенных xромосом D. orena (Dore!) [і2]. Далее на ее основе получили набор ДНК-клонов и провели ж сек-венирование. В результате анализа клонов при помощи различные: пакетов компьютерный программ среди нж удалось обнаружить большое количество разнообразный повторенных последовательностей (диспергированные повторы - представители LTR-ретротранспозонов, LINE-элементы, ДНК-транспозоны; тандемные повторы), а также были выявлены последовательности, гомологичные белок-кодирующим генам [і3]. Кроме того, при помощи метода микродиссекции нами была получена район-специфичная библиотека ДНК xромоцентра политенных xромосом D. virilis (DvirIII) [і4].
В рамкаx настоящей работы была проведена дот-блот гибридизация рай-он-специфичной ДНК-библиотеки из xромоцентра D. virilis с оxарактеризо-ванными и аннотированными 42 ДНК-клонами xромоцентра D. orena. Это позволило получить новые данные о молекулярном составе ДНК xромоцентра D. virilis и в целом оценить консервативность состава ДНК прицентромерно-го гетероxроматина у такж относительно отдаленнык: в филогенетическом отношении видов, как D. orena и D. virilis. Из анализа были исключены два клона - P36F (тандемный повтор) и P40F (LTR-ретротранспозон DM297 I) в связи с очень низкой исxодной концентрацией ДНК.
В результате дот-блот гибридизации район-специфичной ДНК-библиотеки из xромоцентра D. virilis с 42 оxарактеризованными клонами xромоцентра D. orena были выявлены следующие категории консервативных последовательностей ДНК: а) тандемные повторы, относящиеся к минисателлитам; б) диспергированные повторы — мобильные генетические элементы (таблица); в) последовательности, гомологичные белок-кодирую-щим генам.
Мобильные генетические элементы в составе ДНК хромоцентра D. virilis
Мобильные генетические элементы
LTR-ретротранспозоны LINE ДНК-транспозоны
Семейство Gypsy: Gypsy 3 I; Gypsy 9 I; Gypsy4 I; Gypsy 10 I; Gypsy I; IDEFIX I; STALKER 4_I; ZAM_I; TV1_I Семейство Jockey: G3_DM; HELENA_RT Семейство I: I_DM Гелитроны: DNAREPі DM; Нєііїгопі DYak Полинтоны: Polinton-і DY
Однако некоторые мобильные генетические элементы и повторы, которые xарактерны для xромоцентра D. orena, в прицентромерном гетероxро-матине D. virilis не удалось детектировать с помощью метода дот-блот гибридизации (LTR-ретротранспозоны: семейство Roo — ROO_I, семейство Copia — Copia_I, семейство Gypsy — Quasimodo_I, HMSBEAGLEI, QUASIMODO 2-IDM; LINE: семейство CR1 — DMCR1A; повторы: простой повтор (TATATG)n, Т-богатый повтор низкой сложности).
Следует отметить, что из 42 исследуемых клонов лишь 8 клонов не удалось обнаружить в составе ДНК xромоцентра политенных xромосом D. virilis.
Таким образом, большинство клонов xромоцентра D. orena, содержащие повторенные последовательности ДНК, были выявлены в xромоцентре D. virilis. Среди нж преобладали представители LTR-ретротранспозонов, в меньшей степени представлены не-ЕТО-ретротранспозоны (LINE) и ДНК-транспозоны. Среди LTR-ретротранспозонов были обнаружены: представители семейств gypsy, Idefix, ZAM, Stalker, tv1; также были обнаружены не-LTR-ретротранспозоны: G3, Helena, I (таблица). Таким образом, представители семейств gypsy преобладали над всеми остальными семействами МГЭ.
Кроме того, в xромоцентре D. virilis выявлены клоны, содержащие МГЭ, относящиеся к ДНК-транспозонам: гелитроны (DNAREP1DM; Helitron1_ DYak) и полинтон (Polinton-1_DY) (таблица).
Интересен тот факт, что клоны, содержащие последовательности, гомологичные белок-кодирующим генам, оказались общими у xромоцентров D. orena и D. virilis. Эти гены первоначально были локализованы в гетеро-xроматине xромосом разных видов подгруппы melanogaster. Вероятно, они относятся к так называемым ортологичным генам. Показано, что 8б—98% белок-кодирующж генов, расположенных в гетероxроматине D. melanogaster, имеют ортологи в геномаx четыреx филогенетически близкж видов -Drosophila simulans (Sturtevant, і9і9), Drosophila sechellia (Tsacas, Baechli, і98і), Drosophila erecta (Tsacas, Lachaise, і974), Drosophila yakuba (Burla, і954); 55—70% генов, расположенных в гетероxроматине D. melanogaster, имеют ортологи у более эволюционно удаленных видов Drosophila (Drosophila pseudoobscura (Frolova, і929), Drosophila persimilis (Dobzhansky and Epling, і944), D. virilis и др.); для 22—4б% белок-кодирующиx генов, расположенных в районаx гетероxроматина D. melanogaster, найдены ортологи
у другж насекомых (Anopheles gambiae (Giles, і902), Tribolium castaneum (Herbst, і797) и др.) и і3% всеx белок-кодирующиx генов, локализующиxся в районаx гетероxроматина D. melanogaster, имеют ортологи у представителей наиболее эволюционно удаленныx таксонов (Caenorhabditis degans (Maupas, і900), Gallus gallus (Linnaeus, і758) и т.д.) [4].
Заключение
Таким образом, несмотря на то что D. orena и D. virilis эволюционно отдалены друг от друга, ДНК прицентромерного гетероxроматина xромосом у этиx видов содержит значительное количество общж последовательностей ДНК, среди которыx: диспергированные повторы (МГЭ) - представители LTR-ретротранспозонов, LINE-элементы, ДНК-транспозоны; тандемные повторы, а также последовательности, гомологичные белок-кодирующим генам.
Литература
1. CarvalhoA.B. Origin and evolution of the Drosophila Y chromosome // Curr. Opin. Genet.
Dev. 2002. № і2. Р. бб4-бб8.
2. Haupt W. The centromere1 (CEN1) region of Arabidopsis thaliana: architecture and func-
tional impact of chromatin // Plant J. 200і. Vol. 27. P. 285-29б.
3. Horvath J.E., Schwartz S., Eichler E.E. The mosaic structure of human pericentromeric
DNA: a strategy for characterizing complex regions of the human genome // Genome Res. 2000. № і0. P. 839-852.
4. Smith C.D., Shu Sh., Mungall Ch.J., Karpen G.H. The Release 5.і Annotation of Drosophila
melanogaster Heterochromatin // Science. 2007. Vol. 3іб. Р. і58б-і59і.
5. Доувер Г., Браун С., Коэн Э. и др. Динамика эволюции генома и дифференцировка ви-
дов // Эволюция генома. М. : Мир, і98б. С. 329-35б.
6. Стегний В.Н., Вассерлауф И.Э. Видовая арxитектоника xромосом генеративной ткани
и проблема филогенетическиx отношений в подгруппе «melanogaster» рода Drosophila (Sophophora) // Генетика. і994. Т. 30, № 4. С. 478-483.
7. Саленко В.Б. Полиморфизм эндогенного ретровируса МДГ4 (gypsy) в линияx рода Dro-
sophila подгруппы melanogaster : автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2007. 24 с.
8. Throckmorton L.H. The virilis species group // The genetics and biology of Drosophila.
і982. Vol. 3B. P. 227-297.
9. Spicer G.S., Bell C.D. Molecular phylogeny of the Drosophila virilis species group (Diptera:
drosophilidae) inferred from mitochondrial ^S and ^S ribosomal RNA genes // Ann. ent. Soc. Am. 2002. Vol. 95, № 2. P. і5б-ібі.
10. Вассерлауф И.Э. Динамика ориентации xромосом в ядраx трофоцитов яичников у близкородственн^гк видов подгруппы D. melanogaster и группы D. virilis // Вестн. Том. гос. ун-та. 2008. № 3і3. С. 205-2і4.
11. Clark A.G., Eisen M.B., Smith D.R. et al. Evolution of genes and genomes on the Drosophila phylogeny // Nature. 2007. Vol. 450, № 8. P. 203-2і8.
12. Усов К.Е., Шелковникова Т.А., Вассерлауф И.Э. и др. Молекулярно-цитогенетический анализ прицентромерного гетероxроматина xромосом трофоцитов яичников у видов подгруппы Drosophila melanogaster // Цитология. 2008. Т. 50, № і2. С. і044-і049.
13. Усов К.Е., Шелковникова Т.А., Стегний В.Н. Анализ состава ДНК xромоцентра по-литен^и xромосом трофоцитов яичников Drosophila orena // Генетика. 20іі. Т. 47, № 4. С. 475-483.
і4. Усов К.Е., Вассерлауф И.Э., Коханенко А.А. и др. Анализ треxмерной организации политенныx xромосом в ядраx трофоцитов Drosophila virilis (Diptera: Drosophilidae) // Вестн. Том. гос. ун-та. Биология. 20і3. № і (2і). С. і73-і83.
Поступила в редакцию 12.10.2013 г. Tomsk State University Journal of Biology. 2013. № 4 (24). Р. 117-123
Konstantin E. Usov1, 2, Alina A. Kokhanenko2, Vladimir N. Stegniy1, 2
1 Tomsk State University, Tomsk, Russia
2 Research Institute of Biology and Biophysics of Tomsk State University, Tomsk, Russia
COMPARATIVE ANALYSIS OF THE COMPOSITION OF DNA PERICENTROMERIC HETEROCHROMATIN CHROMOSOMES OF Drosophila orena AND Drosophila virilis (Diptera: Drosophilidae)
It is known that DNA sequences associated with heterochromatin are difficult for sequencing and subsequent analysis because ofrepeats enrichment. So, evenfinished and published genome sequencing projects of different organisms only contain information about the DNA sequences associated with euchromatin. Now, however, it is clear that understanding the principles of the eukaryotic genome functioning requires detailed information on the composition of its sequences. It should be noted that a comparative analysis of DNA in heterochromatin both phylogenetically close and distant taxa is relevant from the point of view of the problem of the evolution of genomes.
Previously, we obtained region-specific DNA library chromocenter of polytene chromosomes of D. orena by microdissection. Next, on its basis we got a set of DNA clones and carried out their sequencing. The analysis of the clones using various software packages allowed tofind out a wide variety of repetitive sequences among them (mobile genetic elements; tandem repeats) and the identified sequences homologous to the protein-coding genes. In addition, using microdissection method we obtained a region-specific DNA library chromocenter of polytene chromosomes of D. virilis. As part of this work, we carried out dot blot hybridization region-specific DNA libraries from the chromocenter D. virilis with characterized and annotated 42 DNA clones chromocenter D. orena. That allowed us to obtain new data on the molecular composition of DNA chromocenter D. virilis and estimate, generally, conservative composition of pericentromeric heterochromatin DNA in these relatively distant in the phylogenetic relation to species like D. orena and D. virilis. It should be noted that of 42 examined clones, only 8 failed to detect clones in the polytene chromosome DNA chromocenter D. virilis. Thus, it is established that, despite the evolutionary distance D. orena and D. virilis, DNA pericentromeric heterochromatin of polytene chromosomes in these species contains a significant amount of common sequences such as dispersed repeats (mobile genetic elements) - LTR-retrotransposons, LINE-elements, DNA transposons, tandem repeats (minisatellites), and sequences homologous to the protein-encoding genes (the genes, apparently, belong to the so-called orthologs).
Key words: heterochromatin; DNA; polytene chromosomes; chromocenter; Drosophila virilis; Drosophila orena.
Received October 12, 2013
