CC BY
65
Вестник Томского государственного университета. Биология
2010 № 2 (10) ЦИТОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА
УДК 575.2:575.8:576.875.771
Г.Н. Артемов, В.Н. Стегний
Биологический институт Томского государственного университета (г. Томск)
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РАЙОНОВ ПРИКРЕПЛЕНИЯ ХРОМОСОМ К ОБОЛОЧКЕ ЯДРА ТРОФОЦИТОВ ЯИЧНИКОВ МАЛЯРИЙНЫХ КОМАРОВ ANOPHELES КОМПЛЕКСА MACULIPENNIS
Работа проведена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» 2009-2013 гг. (ГК № ГК 1702).
С помощью микродиссекции политенных хромосом была выделена ДНК района прикрепления XL хромосомы к оболочке ядра трофоцитов яичников Anopheles messeae Fall. (района 2b-c), получена библиотека клонов в плазмидном векторе и проведен анализ первичной последовательности ДНК этого района. Анализ нуклеотидной последовательности ДНК показал, что район 2b-c содержит мобильные элементы, тандемные повторы и гены. Проведен поиск общих последовательностей ДНК, характерных для районов прикрепления хромосом XL и 3R An. messeae, а также XL An. atroparvus van Thiel. Большая часть этих последовательностей, способна связывать белки ядерного матрикса. Полученные результаты необходимы для оценки роли последовательности ДНК в реорганизации архитектуры хромосом в ядрах трофоцитов малярийных комаров в процессе видообразования.
Ключевые слова: Anopheles; пространственная организация ядра; политенные хромосомы; мобильные элементы; повторенные последовательности ДНК.
Проблема организации генома в пространстве ядра в настоящее время является чрезвычайно актуальной. Выделяют три иерархических уровня контроля генетической экспрессии - последовательность ДНК, структуру хроматина и внутриядерную организацию генетического материала [1, 2].
Контроль экспрессии генов на первом уровне довольно хорошо изучен - он связан с работой цис-регуляторных элементов, таких как промоторы, энхансеры, сайленсеры, и транс-регуляторных факторов, включающих ДНК-связывающие транскрипционные факторы и аппарат транскрипции. Второй уровень регуляции генетической экспрессии связан с представлениями о нуклеосомном коде, когда, главным образом, посттрансляционные модификации гистонов определяют транскрипционный статус последовательности ДНК. Наиболее сложная система контроля работы генома осуществляется на третьем уровне.
Оказывается, что все процессы в ядре происходят в определенной области ядра. Так, было отмечено, что гетерохроматин, который представляет собой в
основном повторенные последовательности, небольшое количество генов либо участки генома, в которых транскрипция репрессирована, локализован, прежде всего, на периферии ядра, в то время как активно экспрессирующиеся участки расположены в центре ядра [3]. Позиционирование хромосом в пространстве ядра происходит за счет взаимодействия хроматина с белками ядерного матрикса и, прежде всего, с белками ядерной ламины, которая расположена между внутренней ядерной мембраной и периферическим хроматином. В состав ядерной ламины входят фибриллярные белки - ламины и белки внутри ядерной мембраны, которые с ними ассоциированы [4]. С этими белками взаимодействуют как белки хроматина, так и ДНК. За контакт с белками ядерного матрикса отвечают последовательности SAR/MAR (scaffold associated region/matrix attached region) [5].
Изучение районов хромосом, осуществляющих контакт с ядерной оболочкой, имеет большое значение, т. к. неизвестны механизмы формирования их организации в пространстве в разных тканях и у разных видов. Интересным объектом для исследования районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке являются малярийные комары Anopheles комплекса maculipennis. В клетках слюнных желез, мальпигиевых сосудов, трофоцитов яичников этих насекомых формируются политенные хромосомы.
Ранее было отмечено [6], что близкородственные виды малярийных комаров комплекса maculipennis отличаются по пространственной организации хромосом в ядрах трофоцитов, а именно - по наличию либо отсутствию контактов с оболочкой ядра, районам локализации этих контактов на хромосомах и морфологическим особенностям районов прикрепления. Так, например, у An. messeae Fall. Х-хромосома взаимодействует с ядерной оболочкой районом 2b-c, который находится в середине плеча, хромосома 2 не образует контакта с ядерной оболочкой, а хромосома 3 крепится к оболочке ядра при-центромерным районом. Пространственная организация хромосом
An. atroparvus van Thiel. отличается от An. messeae только по Х-хромосоме, которая образует контакт с оболочкой ядра прицентромерным районом. Следует отметить, что несмотря на сходство взаимоотношения хромосом 2 и 3 с ядерной оболочкой, у этих видов морфологические особенности районов прикрепления являются специфичными.
Целью настоящего исследования было определить первичную последовательность ДНК района прикрепления XL-хромосомы An. messeae (района 2b-c), а также провести сравнительный анализ этой последовательности с последовательностями ДНК районов прикрепления хромосом 3R An. messeae (района 32d) и XL An. atroparvus (района 5а). Результаты данной работы позволят определить последовательности ДНК, которые характеризуют районы прикрепления, а также выявить межвидовые особенности и различия последовательностей этих районов разных хромосом одного вида.
Материалы и методы исследования
Микродиссекция хромосом. В качестве материала для исследования использовали малярийных комаров Anopheles комплекса maculipennis. Самки
Ап. тв88вае были собраны в природных популяциях, а самки Ап. atroparvus были взяты из лабораторной культуры. Препараты готовили по стандартной методике [7]. Проводили микродиссекцию трех районов политенных хромосом - района 2Ь-с ХЬ-хромосомы Ап. messeae (рис. 1, А), 5 а ХЬ Ап. atroparvus (рис. 1, Б) и 32d Ап. messeae (рис. 1, В) - как описано в [8].
Рис. 1. Хромосомы XL An. messeae (А), XL An. atroparvus (Б), 3R An. messeae (В): контуром выделены микродиссектированные районы 2b-c An. messeae, 5а An. atroparvus и 32d An. messeae; масштабная линейка 20 мкм
Получение библиотеки клонов ДНК района 2b-c An. messeae в плазмиде pJET 1.2/blunt. Библиотеку клонов ДНК района 2b-c An. messeae получали в плазмиде pJET 1.2/blunt с использованием наборов реактивов CloneJet PCR Cloning Kit (Fermentas), TransformAid Bacterial Transformation Kit (Fermentas), GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Fermentas) согласно предложенным протоколам. Было получено 485 колоний E. coli несущих плазмиды со встройками, и выделено 323 образца плазмидной ДНК.
Определение первичной последовательности ДНК района 2b-c An. messeae. Определение первичной последовательности в настоящей работе осуществляли с помощью четырехкапиллярного автоматического анализатора 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems). Была получена первичная последовательность для 300 фрагментов ДНК изучаемого района.
Анализ последовательности ДНК района 2b-c An. messeae in silico. Полученные после секвенирования последовательности ДНК клонов анализировали in silico. Последовательность клонов проверяли на гомологию с геномами An. gambiae в TBLASTX VectorBase (vectorbase.org/Tools/BLAST/), с геномами видов Drosophila в BLASTN Ensembl Metazoa (metazoan.ensembl.org/ Anopheles_gambiae/blastview/) и FlyBase (flybase.org/blast). Кроме того, был проведен поиск мобильных генетических элементов (МГЭ) с помощью программ RepeatMasker (repeatmasker.org/cgibin/WEBRepeatMasker) и Censor (girinst.org/censor). Полученные последовательности анализировали на наличие тандемных повторов в TandemRepeatsFinder (tandem.bu.edu/trf/trf.html). Была проведена оценка фрагментов на потенциальное сродство с белками ядра с использованием программы ChrClass [9].
Дот-блот-гибридизация ДНК проб районов 32d An. messeae и 5a An. atroparvus с библиотекой клонов района 2b-c An. messeae. Для приготовле-
ния зонда использовали реакцию ник-трансляции в присутствии биотин-11-дУТФ. Около 50 нг ДНК клонов библиотеки района 2b-c An. messeae после амплификации плазмидной ДНК наносили на положительно заряженную нитро-целлюлозную мембрану (Fermentas). Гибридизацию, отмывку и детекцию проводили с помощью Biotin detection kit (Fermentas) по предложенному протоколу.
Результаты исследования и обсуждение
Общая протяженность области, первичная последовательность которой около 72 тыс. п. н. 58% AT-пар нуклеотидов, позволяет утверждать, что район 2b-c представляют АТ-богатые последовательности. Последовательность ДНК этого района анализировали на предмет МГЭ, тандемных повторов и генов. В изучаемом районе были выявлены все классы нуклеотидных последовательностей. Тандемных повторов обнаружено мало (табл. 1). Среди них выявлены микросателлиты (Mes2b-c_273, Mes2b-c_426, Mes2b-c_430) и минисателлиты (Mes2b-c_2, Mes2b-c_157, Mes2b-c_229, Mes2b-c_273, Mes2b-c_353) с небольшим числом копий.
Т а б л и ц а 1
Тандемные повторы района 2b-c An. messeae
Клон 2b-c An. messeae Последовательность консенсуса Длина консенсуса Число повторов
Mes2b-c 2 AGGAAGAAAACAG 13 2
Mes2b-c 157 TTATGATGAAAAAG 14 1,9
Mes2b-c 229 GAAGTATGAAAGA 13 3,8
Mes2b-c 273 AAAG 4 8,8
Mes2b-c 353 TTTT GTTTT GTTT GG 15 1,9
Mes2b-c 426 TAC 3 40,7
Mes2b-c 430 TC 2 13,5
Сателлитов обнаружить не удалось, видимо, по той причине, что анализу подвергались фрагменты, по длине не превышающие в среднем 250 п. н. Следует обратить внимание, что тандемные повторы, которые входят в состав клонов Mes2b-c_2, Mes2b-c_157, Mes2b-c_175, Mes2b-c_229 и Mes2b-c_273, имеют мотивы AAG/AAAG/ AAAAG/AAAAAG. Эти мотивы гомологичны консенсусу AAAAG, описанному для ДНК ядерной ламины гепатоци-тов мыши [10].
Анализ показал большое разнообразие МГЭ в районе 2b-c An. messeae (табл. 2). Были обнаружены LTR-ретротранспозоны и LINE-элементы, а также транспозоны, однако SINE, MITE и гелитроны в районе 2b-c не найдены. Были выявлены МГЭ, характерные для An. gambiae, а также МГЭ, описанные у представителей одноклеточных, позвоночных, растений и других таксонов. Эти МГЭ имеют довольно низкий процент дивергенции с обнаруженными у An. messeae даже по сравнению с МГЭ семейства Gypsy An. gambiae.
Поиск уникальных последовательностей в районе 2b-c An. messeae позволил выявить пять генов (табл. 3). Найденные уникальные последовательности
оказались гомологичны генам Ап. gambiae, функция которых неизвестна. Однако для большинства генов были определены ортологи у Б. melanogaster.
Т а б л и ц а 2
Мобильные элементы района 2b-c XL хромосомы An. messeae
Семейство МГЭ MTO/opraHH3M Гомология, %
LINE L1 L1 SS, L1MC4 5end, L1 Mur2 orf2, L1MA6, L1MB3 EC, L1MB 75-91
CR1 L2A/Eutheria; CR1-4 AG/Anopheles gambiae 66-71
RTE RTE-9 SP/Strongylocentrotus purpuratus 88; 91
Penelope Penelope-13 HMJHydra magnipapillata 91
R4 EhRLE2/Entamoeba histolytica 72
Outcast Outcast/Anopheles gambiae 74
LTR LTR/Gypsy Gypsy43-I AG-int/Anopheles gambiae 70
LTR/BEL BEL13-I AG/Anopheles gambiae 65; 71
LTR TONT1 LE I/Solanum lycopersicum; AGM1/Anopheles gambiae 79; 67
ERV/ERV1 HARLEQUIN, ZFERV-2-I DR/Chordata 72; 80
§ О СП О С о § EnSpm EnSpm-3 HV/Triticeae, EnSpm-6 VV/Vitis vinifera 67-83
DNA/P P1 AG/Anopheles gambiae 89-94
Sola Sola1-7 AP, Sola1-9 AP/Acyrthosiphon pisum 91; 72
Polinton Polinton-2 NV/Nematostella vectensis 72
MuDR MUDSOLT 1 /Solanum tuberosum 76
hAT CHARLIE3/Eutheria 86
Chapaev Chapaev3-2 AC/Oryzias latipes 69
piggyBac/Looper LOOPERN DR/Danio rerio 72
Примечание. Жирным шрифтом выделены МГЭ, описанные у An. gambiae.
Т а б л и ц а 3
Генетический состав района 2b-c An. messeae
Клон 2b-c An. messeae Гомолог у An. gambiae Ортолог у D. melanogaster
Ген E-value Хромосома/район
Mes2b-c 144 AAGAP000357 5,5e-07 XL/3B -
Mes2b-c 198 AAGAP006662 2e-10 2L/25D CG3165
Mes2b-c 255 AAGAP001531 3e-23 2R/8B CG6125
Mes2b-c 263 AAGAP005897 3e-04 2L/23C CG5087
Mes2b-c 425 AAGAP000621 2e-47 X/1C, X/5D CG3108
Примечание. E-value - вероятность случайной гомологии.
С целью поиска последовательностей гомологичных для районов прикрепления хромосом Ап. messeae был проведен скрининг библиотеки клонов района 2Ь-с Ап. messeae с использованием ДНК района прикрепления хромосомы 3Я Ап. messeae (район 32ф. В результате эксперимента было показано, что общими для районов 2Ь-с и 32d Ап. messeae являются последовательности МГЭ типа БОС6_БМ, ретротранспозоны семейств Ь1 и Бгу (табл. 4). Последовательность клона Ме82Ь-с_403, которая представлена в прицентромер-ных районах хромосом X, 2Ь, 2Я и некартированных сайтах Ап. gambiae,
имеет свойство образовывать контакт с ядерной ламиной. Однако с большей достоверностью ДНК ядерной ламины выявлялась в клонах, содержащих МГЭ L1MC4_5end и HARLEQUIN. Все клоны, кроме Mes2b-c_417, обладают свойствами потенциального взаимодействия с ядерными структурами.
Т а б л и ц а 4
Характеристика гомологичных последовательностей районов прикрепления хромосом XL и 3R An. messeae
Клон 2b-c An. messeae МГЭ Взаимодействие с белками или SAR/MAR
Название Гомология, %
Mes2b-c 18 DOC6 DM 44 СК, SAR/MAR
Mes2b-c 346 L1MC4 5 end 85 Ядерная ламина
Mes2b-c_383 HARLEQUIN 72 Ядерный матрикс, ядерная ламина
Mes2b-c 390 L1HS 91 Ядерный матрикс
Mes2b-c 417 L1MEf 5 end 75 -
Тандемные повторы
Консенсус Период
Mes2b-c 431 AAAACACATT 2,2 Ядерный матрикс
Другие последовательности
Mes2b-c 204, Mes2b-c_277, Mes2b-c_395, Mes2b-c 432, Mes2b-c 403, Mes2b-c 455 Ядерный матрикс, SAR/MAR,CK ядерная ламина
Примечание. СК - синаптонемальный комплекс.
Для поиска эволюционно-консервативных элементов, которые характеризуют районы прикрепления ХЬ-хромосом видов Ап. messeae и Ап. atroparvus, был проведен скрининг библиотеки клонов 2Ь-с Ап. те55еае с помощью ДНК-пробы района 5а Ап. а^ора^ш (табл. 5). В результате скрининга было выявлено 11 последовательностей, среди которых отсутствовали кодирующие белки. Около половины выявленных клонов представляли собой рет-ротранспозоны, и лишь в одном клоне (Ме82Ь-с_199) был найден тандемный повтор. Большинство фрагментов после анализа в программе СЬгС1а88 было отнесено к классу взаимодействующих с белками розеткоподобных структур и внутриядерным матриксом фибриллярно-гранулярной сети. В ходе анализа были найдены клоны, характерные для 2Ь-с Ап. теззеае, 32d Ап. messeae и 5а Ап. atroparvus, - ЬШЕ-элементы (Ме82Ь-с_390 и Ме82Ь-с_417), и последовательность клона Ме82Ь-с_395, которая способна потенциально взаимодействовать с белками ядерного матрикса.
Таким образом, было установлено, что в состав района 2Ь-с ХЬ-хро-мосомы Ап. messeae входят в основном повторенные последовательности -тандемные повторы и мобильные элементы, тогда как генов в данном районе обнаружено мало. Эти данные свидельствуют о сходстве первичной последовательности района 2Ь-с с гетерохроматиновыми районами хромосом.
В результате сравнения последовательностей ДНК районов прикрепления хромосом разных видов были выявлены гомологичные последовательности,
большая часть которых способна взаимодействовать с белками внутриядерных структур.
Т а б л и ц а 5
Характеристика последовательностей, общих для районов прикрепления хромосомы XL An messeae и An atroparvus
Клон 2b-c An. messeae МГЭ Взаимодействие с белками или SAR/MAR
Название Гомология, %
Mes2b-c_3 Gypsy43-I AG-int 70,79 Ядерная ламина
Mes2b-c 243 ERV3 90,62 -
Mes2b-c 390 L1HS 91,20 Ядерный матрикс
Mes2b-c 417 LlMEf 5 end 75,00 -
Тандемные повторы
Консенсус Период
Mes2b-c 199 ттттттс 2,9 -
Другие последовательности
Mes2b-c 153 Ядерная ламина
Mes2b-c 158, Mes2b-c 195, Mes2b-c_337, Mes2b-c_395, Mes2b-c_4l8 Ядерный матрикс
Эти данные свидетельствуют о функциональном сходстве этих районов, которое является отражением их свойства взаимодействовать со структурными элементами ядра. Однако районы прикрепления разных хромосом должны иметь различия в организации, которые определяют специфику их взаимоотношения с ядерной оболочкой. Результаты сравнения последовательностей ДНК хромосом позволили выявить эти различия.
Предположено, что районы прикрепления хромосом составляют следующие элементы: 1) эволюционно консервативные (обнаруженные в результате сравнения 2b-c An. messeae и 5 а An. atroparvus); 2) специфичные для каждого района прикрепления (последовательности района 2b-c, не выявленные при скрининге библиотеки клонов); 3) консервативные для всех районов прикрепления хромосом (гомологичные последовательности трех сравниваемых районов прикрепления). Гипотеза подтверждается данными анализа последовательности ДНК прицентромерного района хромосомы 2 An. atroparvus [11], в котором авторы выявили хромосомоспецифичные и универсальные последовательности.
Полученные результаты указывают на сложную организацию районов прикрепления хромосом. Необходимо определить причины разнообразия МГЭ в этих районах. Возможно, что перемещения МГЭ и ассоциированных с ними SAR/MAR способны изменять локализацию районов прикрепления на хромосомах либо приводить к возникновению новых сочетаний ассоциированных с ядерной оболочкой последовательностей и тем самым изменять пространственную организацию ядра.
Литература
1. Van Driel R., Fransz P.F., Verschure P.J. The eukaryotic genome: a system regulated at dif-
ferent hierarchical levels // Journal Cell Science. 2003. Vol. 116. P. 4067-4075.
2. Misteli T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function // Cell. 2007.
Vol. 128. P. 787-800.
3. CremerM., Kupper K., Wagler B. et al. Inheritance of gene density-related higher order chroma-
tin arrangements in normal and tumor cell nuclei // Journal Cell Biology. 2003. Vol. 162. P. 809-820.
4. Gruenbaum Y., Margalit A., Shumaker D.K., Wilson K.L. The nuclear lamina comes of age //
Molecular Cell Biology. 2005. № 6. P. 21-31.
5. Wang T.Y., Chai Y.R., Yuan B.M. Effects and the mechanism of nuclear matrix attachment re-
gions on transgene expression // Chinen Journal Cell Biology. 2004. Vol. 26, № 6. P. 587-590.
6. Стегний В.Н. Реорганизация структуры интерфазных ядер в онто- и филогенезе маля-
рийных комаров // Доклады АН СССР. 1979. Т. 249, № 5. С. 1231.
7. Kumar V., Cornel A.J., Mukabayire O. In situ hybridization to Anopheles polytene chromo-
somes // Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. London: Chapman and Hall, 1997. P. 337-345.
8. Рубцов Н.Б., Алексеенко А.А., Беляева Е.С. и др. Микроклонирование и характеристика
ДНК из районов прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом Drosophila melanogaster // Генетика. 1999. Т. 35, № 1. С. 55-61.
9. Rogozin I.B., Glazko G.V., Glazkov M.V. Computer prediction of sitesassociated with various
elements of the nuclear matrix // Briefings in bioinformatics. 1999. Vol. 1, № 1. P. 33-44.
10. Шабарина А.Н., Прилепа Е.И., Глазков М.В. Необычная нуклеотидная последовательность ДНК, выделенная из ядерных оболочек гепатоцитов мыши // Генетика. 2006. Т. 42, № 7. С. 879-886.
11. Grushko O.G., Sharakhova M.V., Stegnii V.N., Sharakhov I.V. Molecular organization of heterochromatin in malaria mosquitoes of Anopheles maculipennis subgroup // Gene. 2009. Vol. 448. P. 192-197.
Поступила в редакцию 26.05.2010 г. Gleb N. Artemov, Vladimir N. Stegniy
Biological Institute of Tomsk State University, Tomsk, Russia
MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS OF REGIONS OF CHROMOSOME ATTACHMENT TO NURSE CELLS NUCLEAR ENVELOPE OF ANOPHELES MALARIA MOSQUITOES FROM «MACULIPENNIS» COMPLEX
Nuclear envelope attachment DNA region from nurse cells XL chromosome of Anopheles messeae Fall (2b-c region) was isolated by microdissection procedure. This DNA was cloned in plasmid vector and sequenced. The analysis in database TBLASTX VectorBase, BLASTN EnsemblMetazoa, FlyBase RepeatMasker, Censor and TandemRe-peatsFinder soft reveals that this region consists of transposable elements, tandem repeats and genes. LTR-retrotransposons, LINE, described in An. gambiae Giles were found among transposable elements. In 2b-c region transposable elements typical of other dipterans, protozoa, vertebrates, plants and other organisms were detected. However, MITE SINE and helitrons typical of dipterous were not found in this region. Tandem repeats are only represented by microsatellites and minisatellites with a small number of copies. Repeats with AAAAG motifs characteristic for DNA nuclear lamina of mice hepatocytes and conservative in evolution were found among tandem repeats. The predomination of repetitive DNA in nuclear envelope attachment region of An. messeae XL
chromosome signifies the similarity of this region sequences and constitutive heterochromatin.
Similar sequences that characterize nuclear envelope attachment regions of An. messeae XL and 3R chromosomes and An. atroparvus van Thiel. XL chromosome were searched. Nuclear envelope attachment regions of An. messeae 3R chromosome and An. atroparvus XL chromosome were microdissected. DNA from this regions was used for clone library screening by dot-blot hybridization. Homologous sequences were analyzed with ChrClass soft to find their potential capacity to bind intranuclear proteins. It was shown that the major part of these sequences is capable to bind nuclear matrix proteins including nuclear lamina proteins and synaptonemic complex proteins or contain SAR/MAR sequences. Twelve clones from An. messeae 2b-c region clones library are homologous with the sequences from An. messeae 3R chromosome nuclear envelope attachment region and eleven clones - with An. atroparvus XL chromosome one. Three clones were identical to all investigated regions. On the basis of the analysis multiplex nuclear envelope attachment regions organization was supposed possible. Probably, nuclear envelope attachment regions consist of the following elements: 1) chromosomspeci-fic and evolutionary conservative; 2) specific for every attachment region; 3) universal for all attachment regions. The obtained results are necessary for estimating DNA sequences significance in chromosome architecture reorganization in malaria mosquitoes nurse cells during speciation.
Key words: Anopheles; malaria mosquitoes; nucleus spatial organization; polytene chromosomes; transposable elements; repetitive DNA.
Received May 26, 2010
