CC BY
106
УДК 575.1:576.3
К.Е. Усов1, 2, И.Э. Вассерлауф2, А.А. Коханенко2, Д.И. Олюшина1, М.С. Саруханян1, В.Н. Стегний1, 2
1Биологический институт Томского государственного университета (г. Томск) 2Научно-исследовательский институт биологии и биофизики Томского государственного университета (г. Томск)
АНАЛИЗ ТРЕхМЕРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПОЛИТЕННЫх хромосом в ядрах ТРОФОЦИТОВ
Drosophila virilis (Diptera: Drosophilidae)
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 12-04-31202-мол_а), а также при частичной финансовой поддержке гранта ФЦП № 2012-1.1-12-000-1001-039 и стипендии Президента РФ СП-1037.2013.4.
Проведена 3D FISH (трехмерная флуоресцентная in situ гибридизация) библиотеки ДНК хромоцентра политенных хромосом D. virilis (DvirIII) с хроматином трофоцитов на разных стадиях политенизации. В результате была изучена трехмерная организация районов прицентромерного гетерохроматина хромосом в трофоцитах D. virilis на протяжении всех стадий политенизации. Обнаружено, что на протяжении всех стадий политенизации а-гетерохроматин остается компактным и не метится ДНК-зондом. В то же время в-гетерохроматин интенсивно метится и проявляет некоторую динамику в расположении в пространстве ядра по отношению к а-гетерохроматину. Установлено, что на протяжении всех стадий политенизации сохраняется хромоцентральная организация ядер трофоцитов.
Ключевые слова: Drosophila virilis; политенные хромосомы; трофоциты яичников; гетерохроматин; хромоцентр; микродиссекция.
Введение
Проблема пространственной организации генома возникла в то же время, что и современная генетика, но была незаслуженно забыта в связи с активным развитием представлений о том, что только первичная последовательность ДНК определяет работу генома. В настоящее время, когда прочитаны геномы многих организмов, стало ясно, что значительная часть генома не несет очевидной информации. Считается, что именно некодирующая ДНК, представленная по большей части гетерохроматиновыми районами, ответственна за укладку остальной части генома [1, 2]. Гетерохроматин представлен в основном умеренными и высокоповторенными последовательностями ДНК, которые связаны со специфическим набором гистоновых и негистоно-вых белков. Считается, что эпигенетические механизмы играют роль в обеспечении трехмерной организации хромосом в пространстве ядра. Расположение генетического материала в пространстве ядра во многом определяет
его транскрипционный статус. Следовательно, изучение пространственной организации хромосом и районов прицентромерного гетерохроматина в клеточном ядре является актуальной задачей.
Виды рода Drosophila являются удобным объектом для изучения вопросов, касающихся пространственной организации хромосом в интерфазном ядре, так как имеют крупные и хорошо структурированные политенные хромосомы. Было показано, что особое значение имеет исследование архитектуры ядер именно в генеративной клеточной системе [3-5]. Архитектура ядер трофоцитов яичников Drosophila видоспецифична и определяется взаимоотношением хромосом между собой и главным образом с ядерной оболочкой. Кроме того, прицентромерный гетерохроматин политенных хромосом трофоцитов реплицируется в значительно большей степени, чем прицентромерный гетерохроматин политенных хромосом слюнных желез [6].
Предполагают, что видовые различия в архитектуре хромосом трофоцитов яичников могут предопределяться видовыми различиями в количестве гетерохроматина [7]. Чем больше локализовано гетерохроматинового материала в прицентромерных участках политенных хромосом, тем больше вероятность образования общего хромоцентра. Для Drosophila virilis (Sturtevant, 1916) характерен общий хромоцентр, состоящий из а- и Р-гетерохроматина как в ядрах слюнных желез [8], так и в ядрах трофоцитов [9, 10], что связано с наличием большого количества прицентромерного гетерохроматина. Хромоцентральный принцип организации хромосом трофоцитов характеризует наиболее древние (стволовые) виды [4]. Согласно известным филогенетическим схемам группы D. virilis [11, 12], именно D. virilis и D. kanekoi (Watabe, Higuchi, 1979) занимают анцестральное положение. Ранее у 12 видов группы D. virilis нами было выявлено четыре морфологических типа архитектоники ядер трофоцитов: с хромоцентральной организацией, с диффузным хромоцентром, с хромосомами, рассредоточенными в пространстве ядра, и с хромосомами, имеющими контактирование прицентромерными участками хромосом с оболочкой ядра [10]. Эти результаты были получены на «полудавленых» препаратах, и поэтому можно было оценивать только наличие или отсутствие хромоцентральной организации и ассоциацию хромосом по отношению друг к другу.
Целью настоящих исследований являлось изучение трехмерной организации районов прицентромерного гетерохроматина хромосом в трофоцитах D. virilis на протяжении всех стадий политенизации: от первичных политен-ных ядер с ретикулярной структурой к оформленным политенным хромосомам и вторичным политенным ядрам с ретикулярной структурой.
Материалы и методики исследования
Материалом исследований служили яичники 3-4-суточных самок лабораторной линии D. virilis, а также слюнные железы личинок 4-го возраста данной линии.
Цитологические препараты
Для приготовления препаратов политенных хромосом для микродиссек-ции использовали слюнные железы личинок лабораторной линии D. virilis.
Слюнные железы выделяли в 0,7%-ном растворе NaCl, давили под покровным стеклом в 45%-ном растворе уксусной кислоты. Препараты замораживали в жидком азоте 10-15 мин, затем покровное стекло удаляли, а препарат проводили через этиловый спирт с повышением концентрации: 50, 70, 9б% по 10-15 мин. Препараты политенных хромосом клеток слюнных желез для микродиссекции готовили на покровных стеклах (б0*24 мм).
Для приготовления воздушно-сухих препаратов политенных хромосом для гибридизации in situ использовались яичники самок Drosophila в возрасте 3-4 сут. Яичники выделяли в 0,7%-ном растворе NaCl и фиксировали в растворе Карнуа (9б%-ный этанол и ледяная уксусная кислота - 3:1). Затем яичники инкубировали в 45%-ной уксусной кислоте в течение 5 мин, накрывали покровным стеклом и раздавливали. Все дальнейшие процедуры выполняли по стандартному протоколу [13].
Микродиссекция хромоцентра D. virilis и амплификация ДНК хромоцентра
Для получения набора фрагментов ДНК из хромоцентра политенных хромосом ядер трофоцитов яичников D. virilis был использован метод микродиссекции. Микродиссекцию проводили на инвертированном микроскопе Axiovert 200 «Carl Zeiss» (Германия), оснащенном микроманипулятором MN-4 «Narishigae» (Япония), в стерильных условиях специально приготовленными для этого микродиссекционными иглами. Диссектированный материал переносили в коллекционную каплю (20-40 нл), помещенную в си-ликонизированную микропипетку. Коллекционная капля содержала 10 мМ Трис НС1 (рН 7,5), 10 мМ NaCl, 0,1% SDS, 30%-ный глицерин, 500 мкг/мл протеиназы К. Во время сбора микропипетка находилась во влажной камере при комнатной температуре. По завершении сбора необходимого числа копий хромосомных районов пипетку с диссектированным хромосомным материалом переносили в стальную коробку, помещенную в водяную баню (б0°С) на 2 ч. Амплификация диссектированного материала с частично вырожденным праймером DOP-ПЦР проводилась, как описано ранее [14].
Флуоресцентная in situ гибридизация
Введение метки в ДНК микродиссекционных ДНК-библиотек. ДНК метили прямым флуорохромом в 17 циклах полимеразной цепной реакции, чтобы получить ДНК-зонд. 1 мкл DOP-библиотеки добавляли к 19 мкл ПЦР-смеси: 10х ПЦР-буфер с MgCl2, 2,5 мМ MgCl2, 200 мкМ дАТФ, дЦТФ,
дГТФ и 100 мкМ дТТФ и 100 мкМ Tamra-5’-dUTP, 2 мкМ DOP-праймера и 0,5 ед. Ampli Taq ДНК-полимеразы. ПЦР проводили в режиме: денатурация 94°С - 1 мин; отжиг 56°С - 1,5 мин; элонгация цепей при 72°С - 2 мин; с завершающей элонгацией цепей при 72°С - 8 мин.
Флуоресцентная гибридизация in situ. Все этапы FISH проводили согласно стандартному протоколу [15]. Хромосомы окрашивали флуоресцентным красителем DAPI, растворенном в антиокислительном агенте Vectashield. Анализ и регистрацию результатов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss AxioImager (Zeiss, Германия), CCD-камеры AxioCam и программного обеспечения AxioVision LE Rel. 4.5.
3D флуоресцентная in situ гибридизация (3D FISH)
Фиксация ткани:
1. Выделяли материал (яичники D. virilis) в 1*PBS (Phosphate Buffered Saline, фосфатный буфер) и переносили затем в микроцентрифужную пробирку (1,5 мл) на льду. Таким образом, были выделены яичники из 14 самок лабораторной линии D. virilis.
2. Фиксировали в 4%-ном параформальдегиде в PBT (0,1%-ный Tween 20 в 1*PBS) 20 мин при комнатной температуре.
Пре-гибридизация. Ткань инкубировали в растворе РНКазы A (100-200 мкг/мл) в PBT в течение 2 ч при комнатной температуре. Далее ткань переносили в PBS-Tr (0,3% Triton X-100 в PBS) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем материал помещали в гибриди-зационную смесь (50%-ный формамид, 10%-ный декстрансульфат, 1%-ный Tween 20 в 2*SSC (ph 7,0)), предварительно проведя через 3 раствора гибри-дизационной смеси: PBS-Tr в соотношениях 1:5, 1:1, 5:1 последовательно по 20 мин в каждом.
Гибридизация. ДНК-зонд растворяли в гибридизационной смеси, денатурировали при температуре 85°С 15 мин и переносили на лед. Денатурацию ДНК в трофоцитах проводили в термомиксере в течение 20 мин при 80°С и постоянном покачивании с частотой 450 об./мин. После денатурации пробирки с тканью переносили на лед.
В микроцентрифужную пробирку с тканью добавляли денатурированные ДНК-зонды и проводили совместную денатурацию при 80°С и покачивании с частотой 450 об./мин в течение 15 мин. Гибридизацию проводили при 37°С и покачивании с частотой 450 об./мин в течение 14-17 ч.
Постгибридизационная отмывка. Материал отмывали в отмывочных буферах по 20 мин в каждом при постоянном покачивании с частотой 800 об./мин. Отмывку проводили последовательно в растворе 1 (50%-ный формамид; 2*SSC; 0,3%-ный CHAPS) дважды, растворе 2 (40%-ный формамид; 2*SSC;
0,3%-ный CHAPS), растворе 3 (30%-ный формамид в PBT), растворе 4 (20%-ный формамид в PBT) при 37°C; отмывки в растворе 5 (10%-ный формамид
в PBT), растворе 6 (PBT) и растворе 7 (PBS-Tr) выполняли при комнатной температуре.
Далее добавляли в микроцентрифужную пробирку с материалом каплю DAPI-Vectashield и трясли ночь на ротационном перемешивателе при комнатной температуре.
Приготовление препаратов. Помещали материал на предметное стекло и заключали в камеру, образованную покровным стеклом, приклеенным к предметному стеклу двусторонним скотчем и заполненную DAPI-Vectashield. Приготовленный подобным образом препарат предотвращает деформацию клеток и позволяет проводить микроскопию объемных ядер. Анализ и регистрацию результатов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа AxioImager Z1, конфокальной насадки ApoTome, ССD-камеры AxioCam и программного обеспечения AxioVision LE Rel. 4.5. «Carl Zeiss» (Германия). В результате был проведен анализ трехмерной организации районов прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом в 47 ядрах трофоцитов D. virilis.
Результаты исследования и обсуждение
Получение район-специфичной библиотеки ДНК хромоцентра политенных хромосом D. virilis. Для того чтобы изучить трехмерную организацию районов прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом в тро-фоцитах D. virilis, необходимо маркировать эти районы. Для решения этой задачи был использован метод микродиссекции. При помощи данного метода был диссектирован хромоцентр политенных хромосом D. virilis (рис. 1).
Рис. 1. Микродиссекция хромоцентра политенных хромосом клеток слюнных желез D. virilis^. А - до проведения микродиссекции; В - после проведения микродиссекции. Стрелкой указан район диссектирования
Затем диссектированный материал хромоцентра амплифицировали с помощью ПЦР с частично вырожденным праймером фОР-ПЦР) и получили район-специфичную библиотеку ДНК, размер фрагментов которой варьирует приблизительно от 250 до 750 п.н. (рис. 2). Этой библиотеке было присвоено имя «DvirШ».
Трехмерная организация ядер трофоцитов D. virilis на разных стадиях политенизации. Для того чтобы идентифицировать хромосомы и их прицен-тромерные районы в моделях трехмерной организации ядер трофоцитов D. viri-lis, которые получили с использованием 3D FISH метода, первоначально была проведена in situ гибридизация район-специфичной библиотеки ДНК хромоцентра D. virilis с хромосомами слюнных желез и трофоцитов D. virilis на давленых препаратах и детально изучена ее локализация. В результате in situ гибридизации ДНК-библиотеки DvirIII с политенными хромосомами клеток слюнных желез D. virilis сигнал был локализован не только в районе хромоцентра, а также в прителомерном районе хромосомы 5 (наиболее протяженный участок, включивший метку), в прицентромерном районе хромосомы 3 и пометилась вся хромосома б (рис. 3). Следует также отметить, что были выявлены сигналы в некоторых интеркалярных районах хромосом.
In situ гибридизация DvirIII с политенными хромосомами трофоцитов D. virilis показала наличие сигнала в тяжах Р-гетерохроматина хромоцентра, в прицентромерных районах всех хромосом (рис. 4). Кроме того, пометился теломерный район хромосомы 5, что совпадает с результатами FISH DvirIII с политенными хромосомами клеток слюнных желез. Яркие плотные блоки а-гетерохроматина хромоцентра и интеркалярные районы хромосом трофо-цитов не пометились.
250 п.н.
750 п.н.
Рис. 2. Электрофореграмма амплифицированного материала хромоцентра политенных хромосом D. уігШг. 1 - маркер молекулярного веса; 2 - ПЦР-продукт. 1,5%-агарозный гель
У двукрылых насекомых в яичниках ооцит и трофоцит по происхождению являются сестринскими клетками. Так, в результате оогенеза у дрозофилы образуются 1 ооцит и 15 трофоцитов. В эндоциклах с S2 по S7 выявляются эндополиплоидные ядра трофоцитов яичников с различной степенью политенизации и морфологией хроматина: первичные ретикулярные ядра, политенные хромосомы, имеющие гетерохроматиновые блоки, компактные помпонообразные хромосомы, вторичные ретикулярные ядра [1б—18].
3
d
/
/ Ch
5
1 \ 53Ь 50 b /6
Рис. 3. FISH DvirIII с политенными хромосомами клеток слюнных желез D. virilis: Ch - хромоцентр. 3, 5, 6 - хромосомы. Стрелками указаны районы хромосом с локализованной ДНК-библиотекой DvirIII
5 V
/ А
/ Ch
\
’Ч 1
Рис. 4. FISH DvirIII с политенными хромосомами трофоцитов D. virilis:
Ch - хромоцентр. 5 - хромосома 5. Белыми стрелками указаны прицентромерные районы хромосом с локализованной ДНК-библиотекой DvirIII. Зеленой стрелкой указан сигнал в прителомерном районе хромосомы 5
Была проведена 3D FISH библиотеки ДНК хромоцентра политенных хромосом D. virilis (DvirIII) с хроматином трофоцитов на разных стадиях политенизации. Анализ полученных результатов сопоставляли с результатами по локализации DvirIII на давленых препаратах политенных хромосом (см. рис. 3, 4).
На стадии первичных ретикулярных ядер и на стадии формирования политенных хромосом (рис. 5, A, B) выявляются ярко окрашенный DAPI блок a-гетерохроматина и Р-гетерохроматин хромоцентра, тотально помеченный DvirIII. В пространстве ядра Р-гетерохроматин локально располагается и тесно контактирует с блоком a-гетерохроматина.
Рис. 5. 3D FISH DvirIII с хроматином трофоцитов D. virilis: A - стадия первичного ретикулярного ядра; B - стадия формирования политенных хромосом;
C - оформленные политенные хромосомы; D - стадия вторичного ретикулярного ядра.
Хроматин окрашен DAPI (зеленый), DvirIII (красный). Ch - хромоцентр.
5 - хромосома 5. C - центромерный район хромосомы 5. Масштабная линейка 10 мкм
На сформированных политенных хромосомах DvirIII выявляется в при-центромерных районах каждой хромосомы и в прителомерном районе хромосомы 5 (рис. 5, C).
На стадии вторичных ретикулярных ядер (рис. 5, D) Р-гетерохроматин располагается несколько отдаленно от блока a-гетерохроматина и в большей степени рассредоточивается в пространстве ядра.
Следует заключить, что на протяжении всех стадий политенизации a-гетерохроматин остается компактным и не метится ДНК-зондом. В то же
время Р-гетерохроматин интенсивно метится и проявляет некоторую динамику в расположении в пространстве ядра по отношению к a-гетерохроматину.
Таким образом, 3D FISH DvirIII с хроматином трофоцитов D. virilis позволила установить, что на протяжении всех стадий политенизации сохраняется хромоцентральная организация ядер трофоцитов.
Авторы выражают глубокую благодарность канд. биол. наук, научному сотруднику лаборатории эволюционной цитогенетики НИИ Биологии и биофизики ТГУ Г.Н. Артемову за помощь в проведении микродиссекции политенных хромосом.
Литература
1. Manuelidis L., Borden J. Reproducible compartmentalization of individual chromosome do-
mains in human CNS cells revealed by in situ hybridization and three-dimensional reconstruction // Chromosoma. 1988. Vol. 9б, № б. P. 397-410.
2. Haaf T., SchmidtM. Centromeric association and non-random distribution of centromemres
in human tumour cells // Hum. Genet. 1989. Vol. 81. P. 137-143.
3. Стегний В.Н. Реорганизация структуры интерфазных ядер в онто- и филогенезе маля-
рийных комаров // Доклады Академии наук СССР. 1979. Т. 249, № 5. С. 1231-1234.
4. Стегний В.Н. Архитектоника генома, системные мутации и эволюция. Новосибирск :
Изд-во НГУ, 1993. 11Q с.
5. Стегний В.Н. Эволюционное значение архитектоники хромосом как формы эпигенетического контроля онто- и филогенеза эукариот // Генетика. 200б. Т. 42, № 9. С. 1215-1224.
6. Mal’ceva N.I., Zhimulev I.F. Extent of polyteny in the pericentric heterochromatin of poly-
tene chromosomes of pseudonurse cells of otu ovarian tumor mutants of Drosophila mela-nogaster // Mol. Gen. Genet. 1993. Vol. 24Q. P. 273-27б.
7. Стегний В.Н. Проблема системных мутаций // Генетика. 199б. Т. 32, № 1. С. 1Q-18.
8. Прокофьева-Бельговская А.А. Гетерохроматические районы хромосом. М. : Наука,
198б. 43Q с.
9. ВассерлауфИ.Э., Стегний В.Н., Ананьина Т.В. Взаимное расположение первичных по-
литенных хромосом яичников у 12 видов группы «virilis» рода Drosophila (Sophopho-ra) // Генетика. 199б. Т. 32, № б. С. 75Q-754.
1Q. Вассерлауф И.Э. Динамика ориентации хромосом в ядрах трофоцитов яичников у близкородственных видов подгруппы D. melanogaster и группы D. virilis // Вестник Томского государственного университета. 2QQ8. № 313. С. 2Q5-214.
11. Throckmorton L.H. The virilis species group // The genetics and biology of Drosophila. 1982. Vol. 3B. P. 227-297.
12. Spicer G.S., Bell C.D. Molecular phylogeny of the Drosophila virilis species group (Dip-tera: drosophilidae) inferred from mitochondrial 12S and 16s ribosomal RNA genes // Ann. ent. Soc. Am. 2QQ2. Vol. 95, № 2. P. 156-161.
13. Макгрегор Г., Варли Дж. Методы работы с хромосомами животных. М. : Мир, 1986. 1Q4 с.
14. Рубцов Н.Б., Алексеенко А.А., Беляева Е.С. и др. Микроклонирование и характеристика ДНК из районов прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом Drosophila melanogaster // Генетика. 1999. Т. 35, № 1. С. 55-61.
15. Lichter P., Ledbetter S.A., Ledbetter D.H., Ward D.C. Fluorescence in situ hybridization with Alu and L1 polymerase chain reaction probes for rapid characterization of human
chromosomes in hybrid cell lines // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87. P. 66346638.
16. Painter T.S., Reindorp E.C. Endomitosis in the nurse cells of the ovary of Drosophila me-lanogaster // Chromosoma. 1939. Vol. 1. P. 276-283.
17. KingR.C., Riley S.P., Cassidy J.D. Giant polytene chromosomes from the ovaries of a Drosophila mutant // Science. 1981. Vol. 212, № 4493. P. 441.
18.ЖимулевИ.Ф. Политенные хромосомы: морфология и структура. Новосибирск : Наука, 1992. 480 с.
Поступила в редакцию 5 декабря 2012 г.
Tomsk State University Journal of Biology. 2013. № 1 (21). P 173-183
Konstantin E. Usov1, 2, Irina E. Wasserlauf2, Alina A. Kokhanenko2,
Daria I. Olushina1, Marina S. Sarukhanyan1, Vladimir N. Stegniy1, 2
1Biological Institute of Tomsk State University, Tomsk, Russia
2Research Institute of Biology and Biophysics of Tomsk State University, Tomsk, Russia
ANALYSIS OF THREE-DIMENSIONAL ORGANIZATION OF POLYTENE CHROMOSOMES IN THE NUCLEUS NURSE CELLS Drosophila virilis (Diptera: Drosophilidae)
The problem of the spatial organization of the genome is a key to modern genetics. Currently, a significant role in determining the heterochromatin of the spatial organization of chromosomes in the interphase nucleus is demonstrated. The location of the genetic material in the nucleus space largely determines its transcriptional status. Consequently, the study of the spatial organization of chromosomes andpericentromeric heterochromatin regions in the cell nucleus is an important task.
Drosophila species are convenient objects for the study of issues related to the spatial organization of chromosomes in the interphase nucleus because they have large and well-structured polytene chromosomes. It was shown that the study of architecture nucleus in generative cell system is of particular importance. Polytene chromosomes of ovarian nurse cells of D. virilis have a common chromocenter, consisting of a-and fi-heterochromatin, as well as in the nuclei of the salivary glands. We identified four morphological types of architectonic nuclei nurse cells in 12 species of virilis group: a local chromocenter, diffuse chromocenter, chromosomes dispersed in the nucleus space and the chromosomes contacting the pericentromeric regions of the chromosomes to the nuclear envelope. These results were obtained on squashed preparations, and therefore they can be measured only by the presence or absence of chromocenter and associations of chromosomes in relation to each other. Therefore, the aim of the present research was to investigate the three-dimensional organization of pericentromeric heterochromatin regions of chromosomes in the nurse cells of D. virilis throughout all stages of polytenization: from primary polytene nuclei with reticular structure to the design of the polytene chromosomes to secondary polytene nuclei with reticular structure. In this connection, there was held microdissection chromocenter of salivary gland polytene chromosomes and established region-specific DNA library (DvirIII). Then, 3D FISH DvirIII with chromatin nurse cells of D. virilis was performed at different stages of polytenization. At the stage of primary reticular nuclei there was revealed brightly colored DAPI block a-heterochromatin, while the fi-heterochromatin
chromocenter totally marked DvirIII. In the space of the nucleus fi-heterochromatin there is a local area and in close contacts with the block a-heterochromatin. At the stage formed polytene chromosomes DvirIII detected in pericentromeric regions of each chromosome and the telomeric region of chromosome 5. At the stage of secondary reticular nuclei, fi-heterochromatin is located remotely with respect to the block a-heterochromatin and more disperse in nucleus space. Thus, throughout all stages of polytenization a-heterochromatin remains compact and does not detect DNA probe. fi-heterochromatin is labeled extensively and shows some of the dynamics in the position in space of the nucleus relative to the a-heterochromatin. 3D FISH DvirIII with chromatin nurse cells of D. virilis allowed to establish that throughout all stages of polytenization chromocenter maintained in the nucleus of nurse cells.
Key words: Drosophila virilis; polytene chromosomes; ovarian nurse cells; heterochromatin; chromocenter; microdissection.
Received December 5, 2012
