CC BY
72
ЦИТОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА
УДК 575.1:576.3
Н.М. Немирович-Данченко, В.Н. Стегний
ЛОКАЛИЗАЦИЯ ДНК ХРОМОЦЕНТРА DROSOPHILA ORENA НА ХРОМОСОМАХ «ПСЕВДОПИТАЮЩИХ» КЛЕТОК И КЛЕТОК СЛЮННЫХ ЖЕЛЕЗ DROSOPHILA MELANOGASTER
Работа выполнена при финансовой поддержке: РФФИ (грант №07-04-01484), гранта Президента Российской Федерации по государственной поддержке ведущих научных школ Российской Федерации № НШ-2027.2008.4
Аннотация. Изучена локализация ДНК хромоцентра Drosophila orena на поли-тенных хромосомах Drosophila melanogaster. Обнаружено, что ДНК хромоцентра Drosophila orena диспергирована у Drosophila melanogaster по всей длине хромосом. При этом анализ распределения ДНК хромоцентра Drosophila orena на хромосомах из «псевдопитающих» клеток яичников и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster позволил выявить как общие, так и тканеспецифичные места её локализации.
Ключевые слова: Drosophila orena, Drosophila melanogaster, политенные хромосомы, мутация otu11, «псевдопитающие» клетки, клетки слюнных желез.
К настоящему времени сформировалось представление о гетерохроматине как наиболее изменчивой части генома. По содержанию и распределению гетерохроматина могут сильно различаться близкородственные виды и даже разные популяции одного вида [1, 2]. Кроме того, может значительно варьировать представленность гетерохроматических районов в разных тканях одного организма, что обусловлено разной реплицированностью соответствующих последовательностей [3, 4]. В нашем исследовании изучали распределение ДНК, взятой из хромоцентра Drosophila orena, на хромосомах Drosophila melanogaster, причём исследовались хромосомы двух типов клеток: «псевдопитающие» клетки яичников и клетки слюнных желез.
Материалы и методы
Материалом исследований служили мухи Drosophila melanogaster. Для работы использовали мух дикого типа (линия Canton's) и мух, гомозиготных по мутации otu11 (линия y w otu11 sn3).
Цитологические препараты. Для приготовления препаратов политенных
хромосом для гибридизации in situ использовались яичники самок, гомози-
11
готных по мутации otu , а также слюнные железы личинок из линии Canton's. Яичники и слюнные железы выделяли в 0,7% растворе NaCl и фиксировали в упрощенном растворе Карнуа (этанол и ледяная уксусная кислота 3:1), затем яичники инкубировали в 45% уксусной кислоте в течение 5 мин, накрывали покровным стеклом и раздавливали. Препараты замораживали в жидком азоте, удаляли покровные стёкла при помощи лезвия бритвы, затем
проводили по батарее спиртов (этанол) увеличивающейся концентрации (50% - при -20°С 5 мин, 70, 100% - при -4°С по 5 мин), инкубировали в растворе Карнуа при -4°С 5 мин, высушивали на воздухе в течение 5 мин, ополаскивали в 100% спирте и снова высушивали.
Введение метки в ДНК микродиссекционных ДНК-библиотек. В работе использовалась библиотека ДНК хромоцентра Drosophila orena Dorel, полученная ранее в нашей лаборатории [5]. ДНК метили в 20 циклах полимеразной цепной реакции (амплификатор фирмы Eppendorf (Mastercycler® personal), температура крышки — 105оС). 1 мкл DOP-библиотеки добавляли к 20 мкл ПЦР-смеси: 1*ПЦР — буфер, 0,2 мМ дАТФ, дЦТФ, дГТФ и 0,15 мМ дТТФ и 0,1 мМ Tamra-5'-dUTP, 1 мкМ DOP-праймера, 1 мМ MgCl2 и 2,5 ед. ДНК-полимеразы. ПЦР проводили в режиме: денатурация при 94оС — 1 мин; отжиг при 56оС — 1,5 мин; элонгация цепей при 72оС — 2 мин; с завершающей элонгацией цепей при 72оС — 8 мин.
Флуоресцентная in situ гибридизация. Полученный ДНК-зонд использовали для проведения флуоресцентной in situ гибридизации на хромосомы «псевдопитающих» клеток яичников и клеток слюнных желез.
1. Приготовление гибридизационной смеси. К 10 мкл ДНК-зонда добавляли 1 мкл 5М NaCl и 10 мкл спермальной ДНК лосося (10 мг/мл). Полученную смесь перемешивали на вортексе, затем к ней добавляли 300 мл 96% этанола и оставляли на ночь. На следующее утро смесь центрифугировали 30 мин при 13,2 тыс. об/мин. Потом 96% этанол заменяли на такой же объём 70% этанола и снова центрифугировали 30 мин при 13,2 тыс. об/мин. 70% этанол сливали, а осадок высушивали 20 мин при 50°C. К осаждённому ДНК-зонду добавляли гибридизационную смесь в расчёте 12 мкл на препарат (50% деионизованного формамида, 10% декстрансульфата, 1% Tween 20, в 2*SSC, pH = 7). ДНК-зонд растворяли в гибридизационной смеси 2 ч, перемешивая на вортексе.
2. Предгибридизационные обработки и гибридизация. Препараты хромосом промывали в 2*SSC при 37°C 3 раза по 5 мин, проводили по батарее спиртов (70, 80, 96% по 5 мин в каждом) при комнатной температуре. Затем их высушивали при 37°C 10 мин, обрабатывали пепсином (0,2 мг пепсина на 1 мл 10% 1 М HCl) при 37°C 10 мин, отмывали от пепсина в 1*PBS 2 раза по 5 мин при комнатной температуре и снова проводили по батарее спиртов при комнатной температуре. Потом препаратам давали высохнуть, после чего на них наносили гибридизационную смесь с ДНК-зондом по 10 мкл на препарат, накрывали покровными стёклами и выдерживали 5 мин при 75°C (денатурация ДНК-зонда и ДНК хромосом) и 18 ч при 37°C (гибридизация).
3. Постгибридизационные обработки и окрашивание хромосом. С препаратов удаляли покровные стёкла, после чего их промывали в 50% деионизованном формамиде (в 2*SSC) при 45°C 3 раза по 5 мин, в 2*SSC при 45°C 5 мин, в 2*SSC с добавлением 1 капли Tween 20 при 45°C 5 мин, в 0,2*SSC при 45°C 2 раза по 5 мин и в 0,1*SSC при 60°C 5 мин. Препараты проводили по батарее спиртов и высушивали. Для окрашивания хромосом на препараты наносили смесь DAPI - VECTASHIELD и накрывали покровными стёклами.
Анализ и регистрацию результатов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss AxioImager (Zeiss, Германия), ССD-камеры AxioCam и программного обеспечения AxioVision LE Rel. 4.5.
Результаты
Ранее была проведена гибридизация зонда Dore1 на первичные политен-ные хромосомы трофоцитов Drosophila melanogaster [5]. В этом исследовании ДНК, гомологичная последовательностям зонда, была обнаружена только в прицентромерных районах. Первичные политенные хромосомы трофо-цитов у Drosophila отличаются от обычных политенных хромосом укорочен-ностью и сильной уплотнённостью структуры. Поэтому мы предположили, что какие-то районы, содержащие исследуемую ДНК, могли быть не выявлены из-за их трудной доступности для зонда. Мутация otu11 была выбрана нами в связи с тем, что в трофоцитах яичников гомозиготных по ней самок (в так называемых «псевдопитающих» клетках) образуются политенные хромосомы с хорошо развитой дисковой исчерченностью. Гибридизация зонда Dore 1 на хромосомы «псевдопитающих» клеток мутантов otu11 и на хромосомы слюнных желез позволила выявить многочисленные сайты связывания по всей длине хромосом (рис. 1, 2). Нами были идентифицированы районы хромосом, гибридизующиеся с зондом Dore1. При изучении хромосом «псевдопитающих» клеток мы основывались на работе Н.И. Мальцевой и др. [6], в которой авторы картировали политенные хромосомы «псевдопитающих» клеток, сопоставляя их дисковую исчерченность с таковой хромосом слюнных желёз. Сравнение распределения метки на хромосомах исследуемых тканей позволило выявить как общие, так и тканеспецифичные места локализации (табл. 1, 2).
Обсуждение
Как показывают наши данные, ДНК хромоцентра Drosophila orena у Drosophila melanogaster распределена по всей длине хромосом, локализуясь не только в прицентромерных, но и в интеркалярных районах. Drosophila orena, по всей видимости, является предком для видов подгрупп melanogaster и yakuba, в том числе и для Drosophila melanogaster. Об этом говорят комплексные данные по хромосомным инверсиям и последовательностям ДНК [7], а также проведённый в нашей лаборатории сравнительный анализ архитектоники ядер трофоцитов [8]. Схема эволюционных отношений в подгруппах melanogaster и yakuba дана на рис. 3, там же показано, как в филогенезе изменялась архитектоника ядер трофоцитов. Для Drosophila orena характерно объединение прицентромерных районов всех хромосом в локальный хромоцентр. У дочерних видов хромоцентр становится более диффузным или исчезает совсем, как у Drosophila melanogaster.
|М i sc. «"‘"S.. *****" г in.« ^ V* тМ XL CL , ■ ■jn П g\ 7 \\ АЫ ‘ '**xL *м* ' -**г XL ,-fc —•И* V z? k и ' U » П
21с п, » *■< » V" и« jL t * 4Ш 2L Ч, L3 и» w 2*c % :«« Ж t rij» i* ,„,v ^ % »' Mk { J2f’f » , 1 V Ш2L a ■
M *w “ Чй: 2R wj '*** % я -Ci «> _ 4Ш *“* ■44*-»* <; V> “ VY** •-M. 2R '/’V, w w»*a я
»•% > ““I», Л Vм 3R ^ 1 W т ' 2 1 Г к \ "■ * * 1 • ««•„ л ч п » •# “ИЬ^ИЫ ИГ vf Л 1*»- ”. 3R ч ИНоД:» I'“ Wrf/» «ь. Wfc *'* % * J % \*>< ** m V’ •’tr*« r* * ; * я
Рис. 1. FISH Dore1 на хромосомы клеток слюнных желез Drosophila melanogaster (линия Canton's): a, b, c, d, e, f- окраска DAPI; a', b', c', d', e’, f - Dorel, меченная Tamra-5'-dUTP; XL, 2L, 2R, 3L, 3R, 4 - плечи хромосом; стрелками и скобками обозначены районы, в которых произошла гибридизация с зондом
Рис. 2. FISH Dorel на хромосомы «псевдопитающих» клеток Drosophila melanogaster (мутация otu11): a, b, c, d, e, f- окраска DAPI; a', b', c', d', e’, f - Dorel, меченная Tamra-5'-dUTP; XL, 2L, 2R, 3L, 3R, 4 - плечи хромосом; стрелками и скобками обозначены районы, в которых произошла гибридизация с зондом (в работе Мальцевой и др. [6. T. 3. C. 191] не было найдено сходства с хромосомами слюнных желез в районах 30 a - b, 66 a - b и 95 a - f Поэтому определение локализации зонда в этих районах может быть неточным (30 a, 66 a и 95 a обозначены звёздочками))
Т а б л и ц а 1
Локализация ДНК хромоцентра Drosophila orena на хромосомах «псевдопитающих» клеток яичников и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster. Хромосомы X и 2
р а 0 XL р а о 2L р а о 2R р 5 О 2R
Псевдо- питающие клетки Клетки слюнных желез Псевдо- питающие клетки Клетки слюнных желез Псевдо- питающие клетки Клетки слюнных желез Псевдо- питающие клетки Клетки слюнных желез
1а + - 21а - + — 41 f + + 53Ь + +
1Ь - + 21 d + - 42а + + 53с + +
За + - 21е + - 42Ь + + 53d + +
ЗЬ + - 22а + + 42d - + 53е + +
Зс + + 24аЬ - + 43а + - 53f + -
3d + - 24de - + 43Ь + + 54а + +
4Ь + + 25е - + 44d + + 54Ь + -
4с - + 26аЬ + - 44ef - + 55а + +
4d - + 27Ьс - + 45bc + - 55Ь + -
4е + - 27d + - 45ef + - 55d - +
4f + - 28с + + 46bc - + 56а + -
5а + + 28d + - 47a + + 56Ь + +
5с + - 28ef + + 47b + + 56с + +
5d - + 29е + - 47c + + 56е + +
6а - + 29f + - 47d + + 56f + +
6d + - 30а + + 47e + + 57а + +
7а + - 30d + - 47f + + 57Ь + +
7Ь - + 32а + - 48a + + 57с - +
7с - + 32b + - 48b + + 58а + +
7d - + 32с + + 48c + + 58Ь - +
8Ь + + 32d + - 48d + + 58с + +
8с - + 32е + - 48e + + 58d + +
8е - + 32f + + 4^. 00 + + 59а + +
9de - + 33а + - 49a + + 59Ь + +
10а - + 34с - + 49b + + 59с + +
11 cd + + 34d - + 49c + + 59d + +
12а + - 34е + + 49d + + 59е + +
12f + + 34f + + 49e + + 59f + +
13b - + 35а - + 49f + + 60а + +
14с + + 35Ь - + 50a + + 60Ь + +
14d + - 35d + + 50b + + 60с + +
15а + - 35е + + 50c + + 60d + +
15d + + 36а + + 50d + + 60е + +
15е + - 36Ь + + 50e + + 60f + +
16а - + 36с - + 50f + +
16d + - 36d - + 51a + +
16f - + 37с - + 51b + +
17b + - 37d + - 51c + +
17с + + 38а + + 51 d + +
17de + + 38Ь + + 51e + +
19а + - 38с + + 51 f + +
19b + + 38d + - 52a + +
19с + + 38е + - 52b + +
19d + + 38f + - 52c + +
1 Эе + + 39а- + + 52e + -
19f + + 52f + -
20а- + + 53a + +
Примечание. XL, 2L, 2R - плечи хромосом.
Т а б л и ц а 2
Локализация ДНК хромоцентра Drosophila orena на хромосомах «псевдопитающих» клеток яичников и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster. Хромосомы 3 и 4
р 3L р 3R р 4
а Псе в до- Клетки й Псе в до- Клетки а Псе в до- Клетки
о питаю иц-іе слюнных о питаю іщле слюнных о питами І1Ц-1Є слюнных
н клетки желез н клетки желез н клетки желез
61а - + — 81 f + + - 101f + +
61 cd - + 820 + - 102b + +
61 f - + 83 а + - 102с + +
61 f-62а - + 83 с + + 102d + +
62с + + 83 d + +
62d + + 83 е + +
62е + + 34 а + +
62f + + 84 b + +
63с - + 84 d + +
63de - + 34 е + -
64а + - 84f - +
64с + + 85 а - +
64d + + 85Ьс - +
65а - + 85 d - +
65 Ь - + 85f + -
65d + - 86 b - +
66а + - 86 с - +
67 d + + 86 d + +
67е + - 86 е + +
67f + - 86f - +
68а + - 87 а - +
68Ьс + - 87 b + +
70 ef - + 87 с - +
71а + + 87 d + +
71с + + 89 b - +
71 f + + 89 e - +
72а + + 90 d - +
73cd + + 90 e + +
74а + + 91a + +
74 Ь + + 92 a + -
75а + + 92 b - +
75с + + 92 c + +
75d + - 92 d + +
75f + - 92 e + +
76а + + 93f - +
76 Ь + + 94 a - +
76с - + 94 b + +
76е + + 94 d + +
76f + + 95 a + +
77а - + 97 a + -
77 Ь + + 97 c + -
77е + + 98 a + +
78а + + 98 b + -
78е + + 98 c + -
79а + + 98 d + -
79 Ь + + 98 e + +
79с + + 98f + +
79d + + 99 ef - +
79е + + 100ab - +
79f + + 100c + +
80а - + + 10Oe + +
Примечание. 3L, 3R, 4 - плечи хромосом.
" melanogaster
simulans sechellia mauritiana
i
teissieri
Рис. 3. Схема видообразования подгруппы melanogaster иyakuba [8]
Уменьшение способности прицентромерных районов к эктопической конъюгации могло быть связано с тем, что значительная часть участвовавшего в ней прицентромерного гетерохроматина распределилась по плечам хромосом. Такая реорганизация могла быть связана с повышением активности мобильных элементов генома, которые, распространяясь из прицентромер-ных районов в интеркалярные, захватывали с собой блоки гетерохроматина. Заметим, что у Drosophila melanogaster, самого молодого вида в подгруппе, имеется значительно больше копий мобильных элементов, чем у предковых видов [9]. Это согласуется с рассматриваемой гипотезой, поскольку передвижение мобильных элементов может быть сопряжено с их дупликацией [10]. Правильность приведённых выше рассуждений подтверждают также данные о распределении копий мобильных элементов на хромосомах Drosophila orena и Drosophila melanogaster. У Drosophila melanogaster они обнаружены как в прицентромерных, так и в интеркалярных районах хромосом, тогда как у Drosophila orena - только в прицентромерных [9]. Наблюдаемое нами распределение зонда Dore1 по плечам хромосом Drosophila melanogaster, по всей видимости, является свидетельством происходившего в филогенезе перераспределения гетерохроматина. Выявленные в ходе сравнительного анализа различия по локализации метки между хромосомами «псевдопитающих» клеток мутантов otu11 и клеток слюнных желез линии Canton's могут объясняться как разным распределением исследуемой ДНК в этих линиях, так и её разной реплицированностью в исследованных тканях. Дальнейший анализ распределения разных классов ДНК Drosophila orena на политенных хромо-
сомах «псевдопитающих» клеток и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster позволит более детально выявить характер эволюционных преобразований гетерохроматина в подгруппе Drosophila melanogaster.
Авторы выражают искреннюю благодарность Т.А. Шелковниковой и К.Е. Усову за предоставление библиотеки Dore1 и И. Ф. Жимулёву за предоставление линии y w otu11 sn3.
Литература
1. Yoon J.S., Richardson R.H. Evolution in Hawaiian Drosophilidae // Evolution. 1978b. Vol. 32,
№ 3. Р. 475-484.
2. Ananiev E.V., Gvozdev V.A., Ilyin Y.V. Reiterated genes with varying location in intercalary
polytene chromosomes // Chromosoma. 1978. Vol. 70, № 1. Р. 1-17.
3. Endow S.A., Gall J.G. Differential replication of satellite DNA in polyploidy tissues of Droso-
phila virilis // Chromosoma. 1975. Vol. 50, № 2. Р. 175-192.
4. Lozovskaya E.R., Slesinger S.I., Prokofieva-Belgovskaya A.A. Comparative study of human
chromosome replication in primary cultures of embryonic fibroblasts and in cultures of peripheral blood leucocytes. III. Distribution of AT and GC-nucleotide pairs along length of chromosomes 1, 2, 3 and 16 in the two types of human cells // Chromosoma. 1977. Vol. 60, № 1. Р. 69-79.
5. Усов К.Е., Шелковникова Т.А., Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н. Молекулярноцитогенетический анализ прицентромерного гетерохроматина хромосом трофоцитов яичников у видов подгруппы melanogaster рода Drosophila // Цитология. 2008. Т. 50, № 12. С. 1043-1047.
6. Mal'ceva N.I., Gyurkovics H., Zhimulev I.F. General characteristics of the polytene chromo-
somes from ovarian pseudonurse cells of the Drosophila melanogaster otu 11 and fs(2)B mutants // Chromosome Research. 1995. Vol. 3, № 3. Р. 191-200.
7. O'Grady P.M., Baker R.H., Durando C.M. et al. Polytene chromosomes as indicators of phy-
logeny in several species groups of Drosophila // Evolutionary Biology. 2001. Vol. 1, № 1. Р. 6-11.
8. Cтегний В.Н., Вассерлауф И.Э. Видовая архитектоника хромосом генеративной ткани и
проблемы филогенетических отношений в подгруппе melanogaster рода Drosophila (Sophophora) // Генетика. 1994. T. 30, № 4. С. 478-483.
9. Biemont C., Cizeron G. Distribution of transposable elements in Drosophila species // Ge-
netica. 1999. Vol. 105, № 1. С. 43-62.
10. Galas D.J., Chandler M. On the molecular mechanisms of transposition // Proc. Nati Acad. Sci. USA. 1981. Vol. 78, № 8. Р. 4858-4862.
