Научная статья на тему 'Локализация ДНК хромоцентра Drosophila orena на хромосомах «Псевдопитающих» клеток и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster'

Локализация ДНК хромоцентра Drosophila orena на хромосомах «Псевдопитающих» клеток и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

103
55
Поделиться
Ключевые слова
ПОЛИТЕННЫЕ ХРОМОСОМЫ / МУТАЦИЯ OTU11 / "ПСЕВДОПИТАЮЩИЕ" КЛЕТКИ / КЛЕТКИ СЛЮННЫХ ЖЕЛЕЗ / "PSEUDONURSE" CELLS / DROSOPHILA ORENA / DROSOPHILA MELANOGASTER / POLYTENE CHROMOSOMES / OTU11 MUTATION / SALIVARY GLAND CELLS

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Немирович-данченко Николай Михайлович, Стегний Владимир Николаевич

Изучена локализация ДНК хромоцентра Drosophila orena на политенных хромосомах Drosophila melanogaster. Обнаружено, что ДНК хромоцентра Drosophila orena диспергирована у Drosophila melanogaster по всей длине хромосом. При этом анализ распределения ДНК хромоцентра Drosophila orena на хромосомах из «псевдопитающих» клеток яичников и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster позволил выявить как общие, так и тканеспецифичные места её локализации.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Немирович-данченко Николай Михайлович, Стегний Владимир Николаевич

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Distribution of DNA chromocenter from Drosophila orena on ovarian pseudo-nurse cell chromosomes of Drosophila melanogaster

Distribution of DNA chromocenter from Drosophila orena on ovarian pseudonurse cell polytene chromosomes of Drosophila melanogaster has been determined. Chromocenter DNA of D. orena is spread alongside all chromosomes of D. melanogaster. D. orena chromocenter DNA distribution analysis of ovarian nurse cells and salivary gland cells showed that these tissues possess both common and tissue-specific features in chromocenter DNA distribution.

Текст научной работы на тему «Локализация ДНК хромоцентра Drosophila orena на хромосомах «Псевдопитающих» клеток и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster»

ЦИТОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА

УДК 575.1:576.3

Н.М. Немирович-Данченко, В.Н. Стегний

ЛОКАЛИЗАЦИЯ ДНК ХРОМОЦЕНТРА DROSOPHILA ORENA НА ХРОМОСОМАХ «ПСЕВДОПИТАЮЩИХ» КЛЕТОК И КЛЕТОК СЛЮННЫХ ЖЕЛЕЗ DROSOPHILA MELANOGASTER

Работа выполнена при финансовой поддержке: РФФИ (грант №07-04-01484), гранта Президента Российской Федерации по государственной поддержке ведущих научных школ Российской Федерации № НШ-2027.2008.4

Аннотация. Изучена локализация ДНК хромоцентра Drosophila orena на поли-тенных хромосомах Drosophila melanogaster. Обнаружено, что ДНК хромоцентра Drosophila orena диспергирована у Drosophila melanogaster по всей длине хромосом. При этом анализ распределения ДНК хромоцентра Drosophila orena на хромосомах из «псевдопитающих» клеток яичников и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster позволил выявить как общие, так и тканеспецифичные места её локализации.

Ключевые слова: Drosophila orena, Drosophila melanogaster, политенные хромосомы, мутация otu11, «псевдопитающие» клетки, клетки слюнных желез.

К настоящему времени сформировалось представление о гетерохроматине как наиболее изменчивой части генома. По содержанию и распределению гетерохроматина могут сильно различаться близкородственные виды и даже разные популяции одного вида [1, 2]. Кроме того, может значительно варьировать представленность гетерохроматических районов в разных тканях одного организма, что обусловлено разной реплицированностью соответствующих последовательностей [3, 4]. В нашем исследовании изучали распределение ДНК, взятой из хромоцентра Drosophila orena, на хромосомах Drosophila melanogaster, причём исследовались хромосомы двух типов клеток: «псевдопитающие» клетки яичников и клетки слюнных желез.

Материалы и методы

Материалом исследований служили мухи Drosophila melanogaster. Для работы использовали мух дикого типа (линия Canton's) и мух, гомозиготных по мутации otu11 (линия y w otu11 sn3).

Цитологические препараты. Для приготовления препаратов политенных

хромосом для гибридизации in situ использовались яичники самок, гомози-

11

готных по мутации otu , а также слюнные железы личинок из линии Canton's. Яичники и слюнные железы выделяли в 0,7% растворе NaCl и фиксировали в упрощенном растворе Карнуа (этанол и ледяная уксусная кислота 3:1), затем яичники инкубировали в 45% уксусной кислоте в течение 5 мин, накрывали покровным стеклом и раздавливали. Препараты замораживали в жидком азоте, удаляли покровные стёкла при помощи лезвия бритвы, затем

проводили по батарее спиртов (этанол) увеличивающейся концентрации (50% - при -20°С 5 мин, 70, 100% - при -4°С по 5 мин), инкубировали в растворе Карнуа при -4°С 5 мин, высушивали на воздухе в течение 5 мин, ополаскивали в 100% спирте и снова высушивали.

Введение метки в ДНК микродиссекционных ДНК-библиотек. В работе использовалась библиотека ДНК хромоцентра Drosophila orena Dorel, полученная ранее в нашей лаборатории [5]. ДНК метили в 20 циклах полимеразной цепной реакции (амплификатор фирмы Eppendorf (Mastercycler® personal), температура крышки — 105оС). 1 мкл DOP-библиотеки добавляли к 20 мкл ПЦР-смеси: 1*ПЦР — буфер, 0,2 мМ дАТФ, дЦТФ, дГТФ и 0,15 мМ дТТФ и 0,1 мМ Tamra-5'-dUTP, 1 мкМ DOP-праймера, 1 мМ MgCl2 и 2,5 ед. ДНК-полимеразы. ПЦР проводили в режиме: денатурация при 94оС — 1 мин; отжиг при 56оС — 1,5 мин; элонгация цепей при 72оС — 2 мин; с завершающей элонгацией цепей при 72оС — 8 мин.

Флуоресцентная in situ гибридизация. Полученный ДНК-зонд использовали для проведения флуоресцентной in situ гибридизации на хромосомы «псевдопитающих» клеток яичников и клеток слюнных желез.

1. Приготовление гибридизационной смеси. К 10 мкл ДНК-зонда добавляли 1 мкл 5М NaCl и 10 мкл спермальной ДНК лосося (10 мг/мл). Полученную смесь перемешивали на вортексе, затем к ней добавляли 300 мл 96% этанола и оставляли на ночь. На следующее утро смесь центрифугировали 30 мин при 13,2 тыс. об/мин. Потом 96% этанол заменяли на такой же объём 70% этанола и снова центрифугировали 30 мин при 13,2 тыс. об/мин. 70% этанол сливали, а осадок высушивали 20 мин при 50°C. К осаждённому ДНК-зонду добавляли гибридизационную смесь в расчёте 12 мкл на препарат (50% деионизованного формамида, 10% декстрансульфата, 1% Tween 20, в 2*SSC, pH = 7). ДНК-зонд растворяли в гибридизационной смеси 2 ч, перемешивая на вортексе.

2. Предгибридизационные обработки и гибридизация. Препараты хромосом промывали в 2*SSC при 37°C 3 раза по 5 мин, проводили по батарее спиртов (70, 80, 96% по 5 мин в каждом) при комнатной температуре. Затем их высушивали при 37°C 10 мин, обрабатывали пепсином (0,2 мг пепсина на 1 мл 10% 1 М HCl) при 37°C 10 мин, отмывали от пепсина в 1*PBS 2 раза по 5 мин при комнатной температуре и снова проводили по батарее спиртов при комнатной температуре. Потом препаратам давали высохнуть, после чего на них наносили гибридизационную смесь с ДНК-зондом по 10 мкл на препарат, накрывали покровными стёклами и выдерживали 5 мин при 75°C (денатурация ДНК-зонда и ДНК хромосом) и 18 ч при 37°C (гибридизация).

3. Постгибридизационные обработки и окрашивание хромосом. С препаратов удаляли покровные стёкла, после чего их промывали в 50% деионизованном формамиде (в 2*SSC) при 45°C 3 раза по 5 мин, в 2*SSC при 45°C 5 мин, в 2*SSC с добавлением 1 капли Tween 20 при 45°C 5 мин, в 0,2*SSC при 45°C 2 раза по 5 мин и в 0,1*SSC при 60°C 5 мин. Препараты проводили по батарее спиртов и высушивали. Для окрашивания хромосом на препараты наносили смесь DAPI - VECTASHIELD и накрывали покровными стёклами.

Анализ и регистрацию результатов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss AxioImager (Zeiss, Германия), ССD-камеры AxioCam и программного обеспечения AxioVision LE Rel. 4.5.

Результаты

Ранее была проведена гибридизация зонда Dore1 на первичные политен-ные хромосомы трофоцитов Drosophila melanogaster [5]. В этом исследовании ДНК, гомологичная последовательностям зонда, была обнаружена только в прицентромерных районах. Первичные политенные хромосомы трофо-цитов у Drosophila отличаются от обычных политенных хромосом укорочен-ностью и сильной уплотнённостью структуры. Поэтому мы предположили, что какие-то районы, содержащие исследуемую ДНК, могли быть не выявлены из-за их трудной доступности для зонда. Мутация otu11 была выбрана нами в связи с тем, что в трофоцитах яичников гомозиготных по ней самок (в так называемых «псевдопитающих» клетках) образуются политенные хромосомы с хорошо развитой дисковой исчерченностью. Гибридизация зонда Dore 1 на хромосомы «псевдопитающих» клеток мутантов otu11 и на хромосомы слюнных желез позволила выявить многочисленные сайты связывания по всей длине хромосом (рис. 1, 2). Нами были идентифицированы районы хромосом, гибридизующиеся с зондом Dore1. При изучении хромосом «псевдопитающих» клеток мы основывались на работе Н.И. Мальцевой и др. [6], в которой авторы картировали политенные хромосомы «псевдопитающих» клеток, сопоставляя их дисковую исчерченность с таковой хромосом слюнных желёз. Сравнение распределения метки на хромосомах исследуемых тканей позволило выявить как общие, так и тканеспецифичные места локализации (табл. 1, 2).

Обсуждение

Как показывают наши данные, ДНК хромоцентра Drosophila orena у Drosophila melanogaster распределена по всей длине хромосом, локализуясь не только в прицентромерных, но и в интеркалярных районах. Drosophila orena, по всей видимости, является предком для видов подгрупп melanogaster и yakuba, в том числе и для Drosophila melanogaster. Об этом говорят комплексные данные по хромосомным инверсиям и последовательностям ДНК [7], а также проведённый в нашей лаборатории сравнительный анализ архитектоники ядер трофоцитов [8]. Схема эволюционных отношений в подгруппах melanogaster и yakuba дана на рис. 3, там же показано, как в филогенезе изменялась архитектоника ядер трофоцитов. Для Drosophila orena характерно объединение прицентромерных районов всех хромосом в локальный хромоцентр. У дочерних видов хромоцентр становится более диффузным или исчезает совсем, как у Drosophila melanogaster.

|М i sc. «"‘"S.. *****" г in.« ^ V* тМ XL CL , ■ ■jn П g\ 7 \\ АЫ ‘ '**xL *м* ' -**г XL ,-fc —•И* V z? k и ' U » П

21с п, » *■< » V" и« jL t * 4Ш 2L Ч, L3 и» w 2*c % :«« Ж t rij» i* ,„,v ^ % »' Mk { J2f’f » , 1 V Ш2L a ■

M *w “ Чй: 2R wj '*** % я -Ci «> _ 4Ш *“* ■44*-»* <; V> “ VY** •-M. 2R '/’V, w w»*a я

»•% > ““I», Л Vм 3R ^ 1 W т ' 2 1 Г к \ "■ * * 1 • ««•„ л ч п » •# “ИЬ^ИЫ ИГ vf Л 1*»- ”. 3R ч ИНоД:» I'“ Wrf/» «ь. Wfc *'* % * J % \*>< ** m V’ •’tr*« r* * ; * я

Рис. 1. FISH Dore1 на хромосомы клеток слюнных желез Drosophila melanogaster (линия Canton's): a, b, c, d, e, f- окраска DAPI; a', b', c', d', e’, f - Dorel, меченная Tamra-5'-dUTP; XL, 2L, 2R, 3L, 3R, 4 - плечи хромосом; стрелками и скобками обозначены районы, в которых произошла гибридизация с зондом

Рис. 2. FISH Dorel на хромосомы «псевдопитающих» клеток Drosophila melanogaster (мутация otu11): a, b, c, d, e, f- окраска DAPI; a', b', c', d', e’, f - Dorel, меченная Tamra-5'-dUTP; XL, 2L, 2R, 3L, 3R, 4 - плечи хромосом; стрелками и скобками обозначены районы, в которых произошла гибридизация с зондом (в работе Мальцевой и др. [6. T. 3. C. 191] не было найдено сходства с хромосомами слюнных желез в районах 30 a - b, 66 a - b и 95 a - f Поэтому определение локализации зонда в этих районах может быть неточным (30 a, 66 a и 95 a обозначены звёздочками))

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Т а б л и ц а 1

Локализация ДНК хромоцентра Drosophila orena на хромосомах «псевдопитающих» клеток яичников и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster. Хромосомы X и 2

р а 0 XL р а о 2L р а о 2R р 5 О 2R

Псевдо- питающие клетки Клетки слюнных желез Псевдо- питающие клетки Клетки слюнных желез Псевдо- питающие клетки Клетки слюнных желез Псевдо- питающие клетки Клетки слюнных желез

1а + - 21а - + — 41 f + + 53Ь + +

1Ь - + 21 d + - 42а + + 53с + +

За + - 21е + - 42Ь + + 53d + +

ЗЬ + - 22а + + 42d - + 53е + +

Зс + + 24аЬ - + 43а + - 53f + -

3d + - 24de - + 43Ь + + 54а + +

4Ь + + 25е - + 44d + + 54Ь + -

4с - + 26аЬ + - 44ef - + 55а + +

4d - + 27Ьс - + 45bc + - 55Ь + -

4е + - 27d + - 45ef + - 55d - +

4f + - 28с + + 46bc - + 56а + -

5а + + 28d + - 47a + + 56Ь + +

5с + - 28ef + + 47b + + 56с + +

5d - + 29е + - 47c + + 56е + +

6а - + 29f + - 47d + + 56f + +

6d + - 30а + + 47e + + 57а + +

7а + - 30d + - 47f + + 57Ь + +

7Ь - + 32а + - 48a + + 57с - +

7с - + 32b + - 48b + + 58а + +

7d - + 32с + + 48c + + 58Ь - +

8Ь + + 32d + - 48d + + 58с + +

8с - + 32е + - 48e + + 58d + +

8е - + 32f + + 4^. 00 + + 59а + +

9de - + 33а + - 49a + + 59Ь + +

10а - + 34с - + 49b + + 59с + +

11 cd + + 34d - + 49c + + 59d + +

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

12а + - 34е + + 49d + + 59е + +

12f + + 34f + + 49e + + 59f + +

13b - + 35а - + 49f + + 60а + +

14с + + 35Ь - + 50a + + 60Ь + +

14d + - 35d + + 50b + + 60с + +

15а + - 35е + + 50c + + 60d + +

15d + + 36а + + 50d + + 60е + +

15е + - 36Ь + + 50e + + 60f + +

16а - + 36с - + 50f + +

16d + - 36d - + 51a + +

16f - + 37с - + 51b + +

17b + - 37d + - 51c + +

17с + + 38а + + 51 d + +

17de + + 38Ь + + 51e + +

19а + - 38с + + 51 f + +

19b + + 38d + - 52a + +

19с + + 38е + - 52b + +

19d + + 38f + - 52c + +

1 Эе + + 39а- + + 52e + -

19f + + 52f + -

20а- + + 53a + +

Примечание. XL, 2L, 2R - плечи хромосом.

Т а б л и ц а 2

Локализация ДНК хромоцентра Drosophila orena на хромосомах «псевдопитающих» клеток яичников и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster. Хромосомы 3 и 4

р 3L р 3R р 4

а Псе в до- Клетки й Псе в до- Клетки а Псе в до- Клетки

о питаю иц-іе слюнных о питаю іщле слюнных о питами І1Ц-1Є слюнных

н клетки желез н клетки желез н клетки желез

61а - + — 81 f + + - 101f + +

61 cd - + 820 + - 102b + +

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

61 f - + 83 а + - 102с + +

61 f-62а - + 83 с + + 102d + +

62с + + 83 d + +

62d + + 83 е + +

62е + + 34 а + +

62f + + 84 b + +

63с - + 84 d + +

63de - + 34 е + -

64а + - 84f - +

64с + + 85 а - +

64d + + 85Ьс - +

65а - + 85 d - +

65 Ь - + 85f + -

65d + - 86 b - +

66а + - 86 с - +

67 d + + 86 d + +

67е + - 86 е + +

67f + - 86f - +

68а + - 87 а - +

68Ьс + - 87 b + +

70 ef - + 87 с - +

71а + + 87 d + +

71с + + 89 b - +

71 f + + 89 e - +

72а + + 90 d - +

73cd + + 90 e + +

74а + + 91a + +

74 Ь + + 92 a + -

75а + + 92 b - +

75с + + 92 c + +

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

75d + - 92 d + +

75f + - 92 e + +

76а + + 93f - +

76 Ь + + 94 a - +

76с - + 94 b + +

76е + + 94 d + +

76f + + 95 a + +

77а - + 97 a + -

77 Ь + + 97 c + -

77е + + 98 a + +

78а + + 98 b + -

78е + + 98 c + -

79а + + 98 d + -

79 Ь + + 98 e + +

79с + + 98f + +

79d + + 99 ef - +

79е + + 100ab - +

79f + + 100c + +

80а - + + 10Oe + +

Примечание. 3L, 3R, 4 - плечи хромосом.

" melanogaster

simulans sechellia mauritiana

i

teissieri

Рис. 3. Схема видообразования подгруппы melanogaster иyakuba [8]

Уменьшение способности прицентромерных районов к эктопической конъюгации могло быть связано с тем, что значительная часть участвовавшего в ней прицентромерного гетерохроматина распределилась по плечам хромосом. Такая реорганизация могла быть связана с повышением активности мобильных элементов генома, которые, распространяясь из прицентромер-ных районов в интеркалярные, захватывали с собой блоки гетерохроматина. Заметим, что у Drosophila melanogaster, самого молодого вида в подгруппе, имеется значительно больше копий мобильных элементов, чем у предковых видов [9]. Это согласуется с рассматриваемой гипотезой, поскольку передвижение мобильных элементов может быть сопряжено с их дупликацией [10]. Правильность приведённых выше рассуждений подтверждают также данные о распределении копий мобильных элементов на хромосомах Drosophila orena и Drosophila melanogaster. У Drosophila melanogaster они обнаружены как в прицентромерных, так и в интеркалярных районах хромосом, тогда как у Drosophila orena - только в прицентромерных [9]. Наблюдаемое нами распределение зонда Dore1 по плечам хромосом Drosophila melanogaster, по всей видимости, является свидетельством происходившего в филогенезе перераспределения гетерохроматина. Выявленные в ходе сравнительного анализа различия по локализации метки между хромосомами «псевдопитающих» клеток мутантов otu11 и клеток слюнных желез линии Canton's могут объясняться как разным распределением исследуемой ДНК в этих линиях, так и её разной реплицированностью в исследованных тканях. Дальнейший анализ распределения разных классов ДНК Drosophila orena на политенных хромо-

сомах «псевдопитающих» клеток и клеток слюнных желез Drosophila melanogaster позволит более детально выявить характер эволюционных преобразований гетерохроматина в подгруппе Drosophila melanogaster.

Авторы выражают искреннюю благодарность Т.А. Шелковниковой и К.Е. Усову за предоставление библиотеки Dore1 и И. Ф. Жимулёву за предоставление линии y w otu11 sn3.

Литература

1. Yoon J.S., Richardson R.H. Evolution in Hawaiian Drosophilidae // Evolution. 1978b. Vol. 32,

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

№ 3. Р. 475-484.

2. Ananiev E.V., Gvozdev V.A., Ilyin Y.V. Reiterated genes with varying location in intercalary

polytene chromosomes // Chromosoma. 1978. Vol. 70, № 1. Р. 1-17.

3. Endow S.A., Gall J.G. Differential replication of satellite DNA in polyploidy tissues of Droso-

phila virilis // Chromosoma. 1975. Vol. 50, № 2. Р. 175-192.

4. Lozovskaya E.R., Slesinger S.I., Prokofieva-Belgovskaya A.A. Comparative study of human

chromosome replication in primary cultures of embryonic fibroblasts and in cultures of peripheral blood leucocytes. III. Distribution of AT and GC-nucleotide pairs along length of chromosomes 1, 2, 3 and 16 in the two types of human cells // Chromosoma. 1977. Vol. 60, № 1. Р. 69-79.

5. Усов К.Е., Шелковникова Т.А., Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н. Молекулярноцитогенетический анализ прицентромерного гетерохроматина хромосом трофоцитов яичников у видов подгруппы melanogaster рода Drosophila // Цитология. 2008. Т. 50, № 12. С. 1043-1047.

6. Mal'ceva N.I., Gyurkovics H., Zhimulev I.F. General characteristics of the polytene chromo-

somes from ovarian pseudonurse cells of the Drosophila melanogaster otu 11 and fs(2)B mutants // Chromosome Research. 1995. Vol. 3, № 3. Р. 191-200.

7. O'Grady P.M., Baker R.H., Durando C.M. et al. Polytene chromosomes as indicators of phy-

logeny in several species groups of Drosophila // Evolutionary Biology. 2001. Vol. 1, № 1. Р. 6-11.

8. Cтегний В.Н., Вассерлауф И.Э. Видовая архитектоника хромосом генеративной ткани и

проблемы филогенетических отношений в подгруппе melanogaster рода Drosophila (Sophophora) // Генетика. 1994. T. 30, № 4. С. 478-483.

9. Biemont C., Cizeron G. Distribution of transposable elements in Drosophila species // Ge-

netica. 1999. Vol. 105, № 1. С. 43-62.

10. Galas D.J., Chandler M. On the molecular mechanisms of transposition // Proc. Nati Acad. Sci. USA. 1981. Vol. 78, № 8. Р. 4858-4862.