CC BY
38
Т.А. Шелковникова, И.Э. Вассерлауф, В.Н. Стегний
ИЗМЕНЕНИЕ АРХИТЕКТУРЫ ЯДЕР ПРИ РАЗВИТИИ ТРОФОЦИТОВ ЯИЧНИКОВ У ВИДОВ DROSOPHILA ПОДГРУППЫ MELANOGASTER
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 04-04-48175), целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2006-2008)» (проект РНР.2.2.1.1.2038) и НШ- 4283.2006.4.
Выявлены изменения морфологии хромосом и архитектуры ядер трофоцитов, связанные с ростом ядрышка при развитии тро-фоцитов яичников у видов D. mauritiana, D. melanogaster, D. simulans, D. orena и межвидовых гибридов D. simulans х D. mau-ritiana. Видоспецифичность взаиморасположения хромосом в ядрах трофоцитов у изученных видов выявляется на определенной стадии развития трофоцита (стадия удлиненных политенных хромосом). Несмотря на изменение морфологии первичных политенных хромосом в процессе развития трофоцита, сохраняются общие принципы их взаиморасположения у всех видов подгруппы melanogaster.
В процессе изучения архитектуры интерфазного ядра рядом исследователей [1-3] было показано, что ядро не является «жесткой» и статичной структурой, напротив, подвержено определенной хромосомной динамике. Было выявлено, что в некоторых случаях перемещение хрома-тиновых доменов может быть связано с функционированием ядрышка [3]. Известно, что нутриментарный тип оогенеза, имеющий место у Diptera, характеризуется тем, что функцию синтеза основной массы рибосомальной РНК, необходимой для развития зародыша, берут на себя трофоциты (тогда как ооциты неактивны в этом отношении), поэтому в них активно функционирует ядрышко [4]. В связи с этим объектом нашего исследования являлась организация ядер трофоцитов Drosophila, а именно: изменения морфологии первичных политенных хромосом и архитектуры ядер трофоцитов яичников, связанные с ростом ядрышка, у некоторых видов подгруппы melano-gaster, а также у межвидовых гибридов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы следующие виды подгруппы Drosophila melanogaster комплекса melanogaster: D. melanogaster (лабораторная линия Canton S), D. simulans, D. mauritiana; подгруппы D. melanogaster комплекса yakuba: D. orena, любезно предоставленная F. Le-meunier (Laboratoire Populations, Ge'ne'tique et Evolution, UPR CNRS, Gif-sur-Yvette, Франция).
Цитологические препараты. Яичники 1-1,5-суточных самок Drosophila выделяли в 0,7% физрастворе NaCl и фиксировали в этанол-уксусной смеси (3:1). Воздушно-сухие давленые препараты готовили по стандартной методике [5], в которую были внесены некоторые изменения, подобранные для используемого объекта экспериментально.
Ag-окраска. Применялся упрощенный метод Ag-окрашивания с использованием только инкубации в растворе азотно-кислого серебра [5]. Для анализа окрашенных препаратов и регистрации результатов использовали микроскоп Laboval (увеличение 10х100), фотонасадку и фотокамеру Olympus.
Получение межвидовых гибридов. Было поставлено скрещивание внутри подгруппы melanogaster, ^ D. simulans x g D. mauritiana.
Мухи содержались на стандартной агародрожжевой среде. Для скрещивания использовалась схема 10^ x 10g.
РЕЗУЛЬТАТЫ Архитектура ядер трофоцитов D. melanogaster
Ранее было установлено, что хромосомы в ядрах трофоцитов D. melanogaster (и ее линии Canton S) не имеют общего хромоцентра и полярной ориентации, все плечи хромосом прицентромерными районами связаны с оболочкой ядра [6].
С помощью Ag-окрашивания было обнаружено, что наряду со связью плеч первичных политенных хромосом с ядерной мембраной выявляются тяжи, связывающие их с ядрышковым материалом (рис. l). Несмотря на то что у всех видов подгруппы D. melanogaster ядрышкообразующей является Х-хромосома [7], были выявлены хромати-новые тяжи, связывающие прицентромерные районы плеч хромосом 2 и З с ядрышком (рис. l, б-е).
На протяжении эндоцикла было выявлено, что на более ранних стадиях (стадия тонких первичных политен-ных хромосом), когда ядрышко относительно небольшого размера, контактов хромосом 2 и З с ядрышком не обнаруживается, с ним связана только Х-хромосома (рис. l, а). На более поздних стадиях все хромосомы контактируют с ядрышком (рис. l, б-е), однако часть хроматиновых тяжей по-прежнему связана с мембраной ядра (рис. l, б).
Таким образом, на всех стадиях функционирования ядер трофоцитов D. melanogaster хромосомы сохраняют связь с оболочкой ядра. Однако на определенных стадиях эндоредупликации можно наблюдать возникновение контактов плеч хромосом 2 и З, не являющихся ядрышкообразующими, с ядрышковым материалом.
Архитектура ядер трофоцитов D. mauritiana
Показано, что видоспецифичность ядер трофоцитов у D. mauritiana выявляется на определенной стадии эндоцикла, на последующих стадиях наблюдается определенная динамика хромосомных плеч в пространстве ядра. На стадии удлиненных хромосом хромосома З имеет объединенные в центромерном районе плечи, которые в прицентромерном районе расконъюгирова-ны, и гомологи в прицентромерном районе содержат яркие гетерохроматические блоки. В отличие от других видов этого комплекса, у D. maurutiana хромосома 4 не входит в центромерную область хромосомы З. Плечи хромосомы 2 не рассредоточены и имеют перетяжку в прицентромерном районе [6] (рис. 2, а).
Затем происходят следующие изменения морфологии хромосом: декомпактизация прицентромерного гетерохроматинового блока хромосомы 3 (рис. 2, б), декомпактизуется второй блок, и плечи хромосом разобщаются в прицентромерном районе (рис. 2, в). Далее незначительной деконденсации подвергается при-
центромерный блок гетерохроматина хромосомы 2. На этой стадии на месте блоков визуализируются тонкие хроматиновые тяжи, отходящие от хромосомных плеч (рис. 2, г). Все хромосомные плечи затем разобщаются (рис. 2, д'), что особенно хорошо заметно на стадии компактных хромосом (рис. 2, е').
Рис. 1. Первичные политенные хромосомы ядер трофоцитов яичников Drosophila melanogaster (линия Canton S). Окрашивание азотно-кислым серебром: N - ядрышко, Х-ХЬ - плечо; стрелками показаны прикрепления к оболочке ядра
Рис. 2. Первичные политенные хромосомы D. Mauritiana: а-е - лактоацетоорсеиновое окрашивание; а -е - Ag-окрашивание; стрелками указаны гетерохроматиновые блоки и разрывы плеч;
N - ядрышко, Х-ХЬ - плечо; цифрами обозначены соответствующие хромосомы
22З
При анализе окрашенных серебром препаратов было обнаружено, что подобные изменения морфологии хромосом связаны с формированием связи хромосом с ядрышком. На ранних стадиях с ядрышком связана только Х-хромосома (рис. 2, а'). Деконденсация гетерохроматиновых блоков, наблюдаемая далее, происходит одновременно с появлением ядрышкового материала между плечами хромосом (сначала 3, затем 2) (рис. 2, б', в'). Плечи хромосом разобщаются, хромати-новые тяжи связывают хромосомы с материалом яд-
рышка (рис. 2, г', д'). На стадии компактных хромосом все хромосомные плечи прицентромерными районами контактируют с ядрышком (рис. 2, е').
У О. 8ІтиІаж плечи хромосом рассредоточены в пространстве ядра (рис. 3, а), прицентромерные районы не образуют локальный хромоцентр, а объединены между собой тонким хроматиновым тяжем (рис. 3, б). Хромосома 4 связана с центромерной областью хромосомы 3 [6].
При анализе окрашенных серебром препаратов оказалось, что ядрышко контактирует либо с отдельными хромосомами (рис. 3, а'), либо с хроматиновым тяжем, связывающим между собой все хромосомы (рис. 3, б').
Рис. 3. Первичные политенные хромосомы ядер трофоцитов О. з1ти1ат: а, б - лактоацетоорсеиновое окрашивание; а , б'- Ag-окрашивание; стрелкой указан гетерохроматиновый тяж,
объединяющий хромосомные плечи
Архитектура ядер трофоцитов межвидовых гибридов Б. ъйпиЫш х Б. таипйапа
У межвидовых гибридов О. simulans х О. таигіґіапа наблюдается полное или частичное асинаптирование хромосомных плеч. На лактооцетоорсеиновых препаратах на более ранней стадии эндоцикла (тонкие удлиненные хромосомы) гомеологи имеют незначительный асинапсис, который чаще наблюдается в прицентро-мерных районах (рис. 4, а). На более поздних стадиях хромосомы часто асинаптируют по всей длине хромо-
сомных плеч или даже разобщены в пространстве ядра (рис. 4, б-г).
С помощью Ag-окрашивания было обнаружено, что на стадии тонких хромосом ядрышко цельное (рис. 4, а'). Затем, при увеличении асинапсиса гомеологов, ядрышко приобретает неправильную форму, позднее происходит «разрыв» (фрагментация) материала ядрышка (рис. 4, б', в'). На стадии компактных хромосом гомеологи разобщены в пространстве ядра, прослеживается связь отдельных фрагментов ядрышка с неспаренными гомеологами (рис. 4, г').
Рис. 4. Архитектура ядер у гибридов О. з1ти1апз х О. таигШапа в процессе развития трофоцита: ранние стадии; а-г - лактоацетоорсеиновое окрашивание; а'-г' - Ag-окрашивание; стрелками обозначены асинапсисы хромосомных плеч; N - ядрышко
D. orena - единственный вид из подгруппы melanogaster, который имеет хромоцентральную организацию хромосом в ядрах трофоцитов, подобную организациии хромосом в ядрах слюнных желез, - с большим гетерохроматиновым блоком в центре [8]. На всех стадиях цикла отчетливо выявляется гетерохроматиновый блок, который часто является двойным (рис. 5, a-в).
После распада всех хромосом блок по-прежнему остается (ретикулярная структура ядра), распадаясь либо самым последним, либо не распадаясь вообще (все ядра с ретикулярной структурой, проанализированные у данного вида, имели гетерохроматиновый блок, одинарный или двойной) (рис. 5, в).
При анализе окрашенных азотно-кислым серебром препаратов, было обнаружено, что ядрышко вплотную «прилегает» к хромоцентру, как бы «подвешено» на нем, контактов плеч с ядрышком не было выявлено (рис. 5, г-е).
Рис. 5. Стадии развития первичных политенных хромосом в ядрах трофоцитов яичников Э. огепа: а-в - лактоацетоорсеиновое окрашивание; а -в - окрашивание азотно-кислым серебром; стрелкой обозначен гетерохроматический блок, N - ядрышко
ОБСУЖДЕНИЕ
Обобщая полученный экспериментальный материал по всем изученным видам подгруппы D. melanogaster, следует отметить, что несмотря на то, что ядрышкообразующей у всех видов является Х-хромосома (у D. melanogaster ядрышковый организатор (ЯО) находится в проксимальном гетерохроматическом районе Х-хромосомы) [9], выявляются связи между прицентромерными районами плеч других хромосом и ядрышком. Формирование этих связей в процессе развития трофоцита сопровождается изменением морфологии хромосом в прицентромер-ных гетерохроматиновых районах и, следовательно, архитектуры ядер. Таким образом, архитектура ядра трофоцитов яичников у видов рода Drosophila может служить таксономическим критерием для определения близких (в том числе и гомосеквентных) видов только на определенной стадии развития трофоцита, чаще всего на стадии удлиненных первичных политенных хромосом.
Однако, несмотря на изменение морфологии первичных политенных хромосом в процессе развития трофоци-та, у всех видов подгруппы D. melanogaster сохраняются общие принципы их территориальности в пространстве ядра. Так, прицентромерные районы XL-хромосомы и хромосомы 3 близко ассоциированы по отношению друг к другу, а хромосома 2 в пространстве ядра располагается напротив этих хромосом.
Объяснить феномен формирования хромосомами, не являющимися ядрышкообразующими, связи с яд-
рышком при помощи хроматиновых тяжей, а также связанных с ними изменений архитектуры ядра в процессе развития трофоцита, можно следующими фактами:
1. Многочисленные наблюдения на политенных хромосомах Б. melanogaster контактов материала ядрышка с гетерохроматиновыми районами, не содержащими рибосомных цистронов, объясняются, возможно, тем, что здесь содержатся фрагменты ЯО [9], или предположением о наличии в районах интеркалярного гетерохроматина «гнезд» полигенов (в том числе и генов рРНК) [10].
2. Показано, что последовательности рДНК имеются и в других районах хромосом, т.е. могут быть не встроены в ЯО, а располагаться в каких-то других участках генома, которые в определенных условиях могут участвовать в синтезе рРНК [9, 11].
3. У дрозофилы большая часть генов 28В рРНК содержит инсерции, которые расположены и за пределами ЯО, например в прицентромерном гетерохроматине Х-хромосом, длинных аутосом у некоторых видов подгруппы, которые могут способствовать формированию связи с ядрышком на основе гомологии последовательностей [11].
Известно, что у многих многоклеточных эукариот локусы рибосомальной ДНК располагаются в гетерохроматине, что свидетельствует о его важной роли в обеспечении функции рДНК и/или для ее поддержания. Также известно, что гетерохроматин играет одну из ключевых ролей в образовании архитектуры интерфаз-
ного ядра. Архитектура ядер зависит не только от распределения гетерохроматиновых районов на хромосомах и в пространстве ядра, но и от степени деконденсации гетерохроматина, которая тесно связана с активностью генов, находящихся в гетерохроматине, в том числе и с активностью генов рРНК. Так, при активизации генов рРНК в процессе развития трофоцита у Drosophila происходит изменение ядерной архитектуры, наблюдается определенная динамика хромосом внутри ядра [10, 11].
Несмотря на то что согласно литературным данным в политенных хромосомах политенизируются гены рРНК преимущественно одного из ЯО (явление «ядрышкового доминирования») [11], у изученных межвидовых гибридов при разобщении гомеологов в пространстве ядра прослеживается связь отдельных фрагментов ядрышкового материала с гомеологами обоих видов.
Существуют данные, что видообразование может происходить за счет изменения количества гетерохроматина и перераспределения его в геноме. М.Б. Евгеньев и Л.И. Корочкин предположили, что такого рода события происходят благодаря подвижным генетическим элементам, как бы «растаскивающим» кусочки гетерохроматиновой ДНК по разным ячейкам генома [12].
В ядрах трофоцитов яичников D. orena содержится большое количество гетерохроматина, основная часть которого сосредоточена в хромоцентре. Интерес к изучению этого вида вызван тем, что, возможно, он является филогенетически исходным для остальных видов подгруппы melanogaster [8]. В процессе эволюционных преобразований, возможно, происходили либо перераспределения гетерохроматина по остальным хромосомам, либо его элиминация.
ЛИТЕРАТУРА
1. Csink A.K., Henikoff S. Large-scale chromosomal movements during interphase progression in Drosophila // J. Cell. Biol. 1998. Vol. 143, № 1. P. 13-
22.
2. Marshall W.F. et al. Interphase chromosomes undergo constrained diffusional motion in living cells // Current Biology. 1997. № 7. Р. 930-939.
3. De Boni U., Mintz A.H. Curvilinear, three-dimensional motion of chromatin domains and nucleoli in neuronal interphase nuclei // Science. 1986.
№ 234. P. 863-866.
4. Грузова М.Н. Функциональная морфология ядерных структур в связи с различными типами овогенеза // Успехи современной генетики. 1971.
№ 3.
5. Макгрегор Г., Варли Дж. Методы работы с хромосомами животных. М.: Мир, 1986. С. 104.
6. Cтегний В.Н., Вассерлауф И.Э. Особенности взаимного расположения политенных хромосом в генеративной ткани у Drosophila
melanogaster // Генетика. 1991. Т. 27, № 7. С. 1163-1168.
7. Ritossa F.M., Spiegelman S. Localization of DNA complementary to ribosomal RNA in the nucleolus organizer region of D. melanogaster // Proc.
Nat. Acad. Sci. USA. 196S. T. S3. P. 737-74S.
8. Cтегнuй В.Н., Вассерлауф И.Э. Видовая архитектоника хромосом генеративной ткани и проблемы филогенетических отношений в подгруп-
пе melanogaster рода Drosophila (Sophophora) // Генетика. 1994. Т. 30, № 4. С. 478-483.
9. Прокофьева-Бельговская А.А. Гетерохроматические районы хромосом. М.: Наука, 1986. 430 с.
10. Михайлова П.В., Семенов Г.К., Генова Г.К., Константинов Г.Х. Дополнительные ядрышки и их связь с политенными хромосомами в клетках слюнных желез Drosophila melanogaster // Цитология. 1982. Т. 24, № 3. С. 248-2S1.
11. Жимулев И.Ф. Хромомерная организация политенных хромосом. Новосибирск: Наука, 1994. S6S с.
12. Корочкин Л.И. Гены, онтогенез и проблемы эволюционного развития. Томск: ТГУ, 2001. С. 37^9.
Статья поступила в редакцию журнала 4 декабря 2006 г., принята к печати 11 декабря 2006 г.
