CC BY
12__ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
2021, том 24, № 2
УДК 616.127-005.8:616.378-008.64]-018.1-089.843.819-028.77 DOI: 10.37279/2070-8092-2021-24-2-99-103
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ РАЗЛИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР ПРИ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА НА ФОНЕ САХАРНОГО ДИАБЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Пилипчук А. А., Михайличенко В. Ю., Самарин С. А., Трофимов П. С., Каракурсаков Н. Э., Кисляков В. В.
Институт «Медицинская академия имени С.И. Георгиевского» ФГАОУ ВО КФУ имени В.И. Вернадского, 295006, бул. Ленина, 5/7, г. Симферополь, РФ
Для корреспонденции: Михайличенко Вячеслав Юрьевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой общей хирургии Института «Медицинская академия имени С.И. Георгиевского» ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского», e-mail: pancreas1978@mail.ru
For correspondence: Vyacheslav Yu. Mikhaylichenko, MD, Head of the department of General Surgery, Institute «Medical Academy named after S.I. Georgievsky» of Vernadsky CFU, е-mail: pancreas1978@mail.ru
Information about authors:
Pilipchuk A. A., http://orcid.org/0000-0001-6788-4363 Mykhaylichenko V. Yu., http://orcid.org/0000-0003-4204-5912 Samarin S. A., http://orcid.org/0000-0002-7046-624Х Trofimov P. S., http://orcid.org/0000-0101-9674-9865 Karakursakov N. E., https://orcid.org/0000-0002-6691-9349 Kislyakov V. V., https://orcid.org/0000-0002-6604-5549
РЕЗЮМЕ
Значительный успех фармакологических и интервенционных методов лечения инфаркта миокарда (ИМ), сопоставляется неутешительными отдаленными результатами лечения на фоне сахарного диабета (СД). Цель: изучить эффективность применения трансплантации мезенхимальных стволовых клеток при инфаркте миокарда на фоне сахарного диабета 1 типа. Материал и методы исследования. В качестве экспериментального животного нами были избраны крысы инбредной линии Вистар-Кайото. Было сформировано 5 групп по 20 животных в каждой: 1 группа - контрольная (норма); 2 группа - ИМ + СД без лечения; 3 группа - ИМ + СД, которым на 1 сутки после моделирования выполнена трансплантация культуры клеток поджелудочной железы; 4 группа - ИМ + СД, которым на 1 сутки после моделирования выполнена трансплантация мезенхимальных стволовых клеток; 5 группа - ИМ + СД, которым на 1 сутки после моделирования выполнена трансплантация мезенхимальных стволовых клеток с культурой клеток поджелудочной железы. Результаты и их обсуждения. После моделирования ИМ на фоне СД происходит значительно расширение полости левого желудочка, что соответствует увеличению LVIDd (end-diastolic left ventricular internal dimensions) с 6,16±0,12 до 7,19±0,16 мм, а также LVIDs (end-systolic left ventricular internal dimensions) с 2,82±0,18 до 3,82±0,11 мм. В 5 группе получены наиболее перспективные результаты, так конечный диастолический и систолический внутренний диаметр левого желудочка, фракция выброса и ударный объем остались не измененными по сравнению с нормой, несколько снизилась фракция укорочения левого желудочка с 45,3±1,7 до 44,2±0,8%. В группе 5 группе, отмечалось восстановление концентрации инсулина до 3,52±0,11 мкМЕ/л, С-пептида до 0,89±0,05 нг/мл, что так же было выше нормы, мы это связываем с повышенной регенерацией ткани поджелудочной железы. При этом кортикостерон, тироксин и трийодтиронин полностью нормализовались. Выводы. Трансплантация микс-культуры позволяет достичь двойного эффекта, заключающегося в нормализации показателей инсулярных и контринсулярных гормонов, а также восстановление функции левого желудочка, что является перспективным направлением в клеточной трансплантации.
Ключевые слова: инфаркт миокарда, сахарный диабет, клеточная трансплантация.
COMPARATIVE ANALYSIS OF THE EFFICIENCY OF TRANSPLANTATION OF DIFFERENT CELL CULTURES IN MYOCARDIAL INFARCTION IN DIABETES MELLITUS IN
THE EXPERIMENT
Pilipchuk A. A., Mykhaylichenko V. Yu., Samarin S. A., Trofimov P. S., Karakursakov N. E., Kislyakov V. V.
Institute «Medical Academy named after S.I. Georgievsky « of Vernadsky Crimean Federal University, 295006, Simferopol, Russia.
ABSTRACT
The significant success of pharmacological and interventional methods of treating myocardial infarction (MI) is compared with the disappointing long-term results of treatment against the background of diabetes mellitus (DM). The aim. To study the effectiveness of mesenchymal stem cell transplantation in myocardial infarction against the background of type 1 diabetes mellitus. Methods. As an experimental animal, we selected rats of the Wistar-Kayoto inbred line. 5 groups of 20 animals each were formed: group 1 - control (norm); group 2 - MI + DM without treatment; Group 3 - MI + DM, who underwent pancreatic cell culture transplantation on day 1 after modeling; Group 4 - MI + DM, who underwent mesenchymal stem cell transplantation on day 1 after modeling; Group 5 - MI + DM, who underwent transplantation of mesenchymal stem cells with pancreatic cell
2021, том 24, № 2
ТАВРИЧЕСКИЙ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ ВЕСТНИК
culture on day 1 after modeling. Results. Based on Table 1, we see that after modeling myocardial infarction against the background of diabetes mellitus there is a significant expansion of the left ventricular cavity, which corresponds to an increase in LVIDd (end-diastolic left ventricular internal dimensions) from 6.16 ± 0.12 to 7.19 ± 0.16 mm, as well as LVIDs (end-systolic left ventricular internal dimensions) with 2.82 ± 0.18 to 3.82 ± 0.11 mm. In group 5, the most promising results were obtained, as the end diastolic and systolic inner diameter of the left ventricle, ejection fraction and stroke volume remained unchanged compared with the norm, the fraction of the shortening of the left ventricle slightly decreased from 45.3±1.7 to 44.2±0.8%. In group 5, there was a recovery in the concentration of insulin to 3.52±0.11 |IU / L, C-peptide to 0.89±0.05 ng / ml, which was also higher than normal, we associate this with increased tissue regeneration pancreas. At the same time, corticosterone, thyroxine and triiodothyronine were completely normalized. Conclusions. Mix culture transplantation allows to achieve a double effect, which consists in normalizing the indices of insular and contrainsular hormones, as well as restoring the function of the left ventricle, which is a promising direction in cell transplantation.
Keywords: myocardial infarction, diabetes mellitus, cell transplantation.
С каждым годом, количество больных страдающих коморбидной патологией значительно увеличивается, так довольно часто встречается инфаркт миокарда (ИМ) на фоне сахарного диабета (СД). Известно. Что частота встречаемости ИМ на фоне СД у женщин выше в 8 раз, а у мужчин -в 1,6 раз по сравнению с среднестатистическими показателями [1]. Установлено, что чем длительней анамнез СД у пациента, тем больше вероятность возникновения ИМ и обширней поражение сердца [2; 3]. Нами в ряде работ в эксперименте, было продемонстрирован важность участия в патогенезе СД и ИМ не только инсулярных и в особенности контринсулярных гормонов, которые усугубляют ишемию тканей и уменьшают возможные адаптационные резервы миокарда [4; 5]. Известный факт, что у пациентов с СД высокий риск кардиоваскулярного риска развития сердечно-сосудистых осложнений связан прежде всего с гиперкоагуляцией и дисфункцией эндотелия, что приводит к вазоконстрикции, воспалительным реакциям и нарушению гемостаза [6]. Вышеописанные факторы приводят к генерализованному поражению сосудов атеросклерозом со значимо большей степенью стеноза коронарных артерий [7; 8]. В связи с чем, применение чрескожных рентгенэндоваскулярных вмешательств при ИМ на фоне СД малоэффективна, в связи с тем, что адекватный магистральный кровоток не может компенсировать нормальное кровоснабжение миокарда из-за микроваскулярной обструкции
[9; 10].
Цель работы: изучить эффективность применения трансплантации мезенхимальных стволовых клеток при инфаркте миокарда на фоне сахарного диабета 1 типа.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В качестве экспериментального животного нами были избраны крысы инбредной линии Ви-стар-Кайото. Моделирование ИМ выполняли на самках, используя культуру клеток, полученных из костного мозга самцов, чтобы в дальнейшем по Y-хромосоме верифицировать транспланти-
руемые клетки в организме реципиента. После моделирования ИМ на 5 сутки крысам подкожно вводили аллоксан тетрагидрат из расчета 200мг/ кг. Через 3 суток после моделирования ИМ и СД крысам внутривенно вводили мезенхимальные стволовые клетки. Нами было сформировано 5 групп по 20 животных в каждой: 1 группа - контрольная (норма); 2 группа - ИМ+СД без лечения; 3 группа - ИМ+СД, которым на 1 сутки после моделирования выполнена трансплантация культуры клеток поджелудочной железы (ПЖ); 4 группа - ИМ+СД, которым на 1 сутки после моделирования выполнена трансплантация мезен-химальных стволовых клеток (МСК); 5 группа -ИМ+СД, которым на 1 сутки после моделирования выполнена трансплантация МСК с культурой клеток ПЖ.
Эксплантацию костного мозга проводили в асептических условиях из бедренной кости в количестве 20-40 мл с добавлением 625 ед/мл гепарина (Дарница, Украина). Аспират костного мозга наслаивали на градиент Histopaque-1077 плотностью 1,077 г/мл (Sigma, США) и центрифугировали в течение 30 мин при 1500 об/мин. Полученные мононуклеары собирали и последовательно отмывали 3-4 раза в растворе Хенк-са (Биолот, Россия) путем центрифугирования при 1000 об/ мин в течение 14 мин. Полученную таким образом суспензию МСК костного мозга засевали на покрытые коллагеном культураль-ные флаконы площадью 75 см2 (Corning-Costar, США) в концентрации 2-5*106 клеток на флакон. Культивирование МСК проводили в смеси питательной среды DMEM/F12 (Sigma, США) 1:1 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот, Россия), 0,75 мг/мл глюта-мина (Институт полиомиелитов и вирусных энцефалитов, Россия), 2 нг/мл основного фактора роста фибробластов (Sigma, США) и по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина (Дарница, Украина) в CO2 -инкубаторе (Jouan, Франция) при 37°С и 5% атмосфере CO2. Смену среды проводили каждые 3-4 суток культивирования. Культуры достигали первичного монослоя на 8-11-е сутки
2021, том 24, № 2
культивирования в зависимости от плотности засева первично выделенной клеточной суспензии, индивидуальных особенностей доноров и уровня пролиферативной активности клеток. При пассировании клетки суспендировали с помощью смеси растворов трипсин/ЕДТА (Биолот, Россия) в соотношении 0,05:0,02% в фосфатно-солевом буфере рН 7,4 (Sigma, США). Коэффициент пассирования составлял 1:2 или 1:3.
В опыте использовали клеточный трансплантат ПЖ новорожденного кролика, содержащегося в обычных условиях вивария Института неотложной и восстановительной хирургии им. В.К. Гусака (г. Донецк, ДНР). В стерильных условиях экспериментального операционного блока под внутримышечным наркозом Ketamine+Xylazine в дозе 40+7,5 мг/кг, выполняли верхнесрединную лапаротомию, мобилизовали ПЖ, пунктировали главный проток ПЖ кролика и вводили 0,25% раствор трипсина. После чего железу немедленно вынимали из организма животного и помещали в стерильный раствор среды S 199 с антибиотиком и передавали для дальнейшей обработки в Лабо-
Ультразвуковые пок
раторию клеточного и тканевого культивирования Всем животным на 7 сутки после трансплантации и моделирования ИМ+СД, выполняли ультразвуковое исследование сердца на УЗИ аппарате GE Vivid, с датчиком 12 Гц. В плазме крови крыс определяли концентрацию инсулина, С-пептида, кортикостерона, тироксина и трийодтиронина с помощью ИФА и наборов Immunothech, согласно инструкции производителя.
Статистическая обработка материала выполнялась c применением методов вариационной статистики с вычислением средних величин - M и оценкой вероятности расхождения (m) и использованием критерия Манни-Уитни для малых выборок.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ
Исходя из таблицы №1, мы видим, что после моделирования ИМ на фоне СД происходит значительно расширение полости левого желудочка, что соответствует увеличению LVIDd с 6,16±0,12 до 7,19±0,16 мм, а также LVIDs с 2,82±0,18 до 3,82±0,11 мм.
Таблица 1
атели сердца у крыс
Показатель Группа
1 2 3 4 5
LVIDd, мм 6,16±0,12 7,19±0,16* 6,82±0,19* 6,55±0,12* 6,34±0,11
LVIDs, мм 2,82±0,18 3,82±0,11* 3,74±0,16* 2,73±0,16* 2,91±0,12
FS, % 45,3±1,7 26,8±0,8* 27,8±0,9* 43,1±0,7* 44,2±0,8
EF, % 76,9±2,5 55,3±3,4* 57,2±3,8* 76,1±2,6 76,2±1,9
SV, ml 0,25±0,08 0,13±0,03* 0,15±0,05* 0,18±0,06* 0,25±0,04
Примечание: статистическая достоверность показателей представлена в тексте. LVIDd - end-diastolic left ventricular internal dimensions (конечный диастолический внутренний диаметр левого желудочка); LVIDs - end-systolic left ventricular internal dimensions (конечный систолический внутренний диаметр левого желудочка); FS - fractional shortening (ФУ, фракция укорочения); EF - ejection fraction (ФВ, фракция выброса); SV - stroke volume (УО, ударный объем). *-различие между предстоящим и сравниваемым показателем достоверно (р<0,05)
При этом фракция укорочения левого желудочка уменьшилась с 45,3±1,7 до 26,8±0,8%, фракция выброса с 76,9±2,5 до 55,3±3,4 %, а УО с 0,25±0,08 до 0,13±0,03 мл. В 3 группе, мы видим такую же динамику исследуемых параметров, причем LVIDd на 0,37мм выше, чем во 2 группе и ФВ в 3 группе больше на 1,9% по сравнению со 2 группе, в остальных параметрах разницы не было. В 4 группе отмечается незначительное расширение полости левого желудочка и уменьшения сократительной функции миокарда, так LVIDd увеличился с 6,16±0,12 до 6,55±0,12 мм, а LVIDs уменьшился
с 2,82±0,18 до 2,73±0,16 мм, что свидетельствует об усиления сократительной функции сердца. При этом фракция укорочения левого желудочка уменьшилась с 45,3±1,7 до 43,1±0,7%, а УО с 0,25±0,08 до 0,18±0,06 мл, при этом фракция выброса осталась неизменной. В 5 группе получены наиболее перспективные результаты, так конечный диастолический и систолический внутренний диаметр левого желудочка, фракция выброса и ударный объем остались не измененными по сравнению с нормой, несколько снизилась фракция укорочения левого желудочка с 45,3±1,7 до 44,2±0,8%.
2021, том 24, № 2
ТАВРИЧЕСКИИ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИИ ВЕСТНИК
Уровни инсулярных и контринсулярных гормонов у крыс в срок 1 месяц (M±m)
Таблица 2
Показатель 1 2 3 4 5
Инсулин, мкМЕ/л 3,53±0,21 1,94±0,12* 3,51±0,08 2,68±0,07* 3,52±0,11
C-пептид, нг/мл 0,733±0,02 0,152±0,01* 0,84±0,07* 0,43±0,05* 0,89±0,05*
Кортикостерон, нмоль/л 355,2±25,2 457,2±21,1* 331,02±7,3 395,4±31,2* 362,2±13,2
Тироксин, нмоль/л 39,54±1,93 20,12±0,82* 37,12±0,68* 29,14±0,12* 38,7±0,83
Трийодтиронин, нмоль/л 2,42±0,15 1,08±0,09* 2,13±0,05* 1,84±0,04* 2,31±0,07
Примечание. * - различие между предстоящим и сравниваемым показателем достоверно (р<0,05)
При изучении концентрации инсулярных и контринсулярных гормонов в плазме крови у крыс (табл.1), мы получили следующие результаты. В группе без лечения, отмечалось значительное снижение концентрации инсулина с 3,53±0,21 до 1,94±0,12 мкМЕ/л, С-пептида с 0,733±0,02 до 0,152±0,01 нг/мл, при этом кортикостерон вырос с 355,2±25,2 до 457,2±21,1 нмоль/л, тироксин снизился с 39,54±1,93 до 20,12±0,82 нмоль/л, а трийодтиронин с 2,42±0,15 до 1,08±0,09 нмоль/л. В группе 3 группе, отмечалось восстановление концентрации инсулина до 3,51±0,08 мкМЕ/л, С-пептида до 0,84±0,07нг/мл, что было выше нормы, мы это связываем с повышенной регенерацией ткани поджелудочной железы. При этом кор-тикостерон полностью нормализовался, тироксин снизился с 39,54±1,93 до 37,12±0,68 нмоль/л, а трийодтиронин с 2,42±0,15 до 2,13±0,05 нмоль/л. В группе 4 группе, отмечалось незначительное снижение концентрации инсулина с 3,53±0,21 до 2,68±0,07 мкМЕ/л, С-пептида с 0,733±0,02 до 0,43±0,05 нг/мл, при этом кортикостерон вырос с 355,2±25,2 до 395,4±31,2 нмоль/л, тироксин снизился с 39,54±1,93 до 29,14±0,12 нмоль/л, а трийодтиронин с 2,42±0,15 до 1,84±0,04 нмоль/л. В группе 5 группе, отмечалось восстановление концентрации инсулина до 3,52±0,11 мкМЕ/л, С-пептида до 0,89±0,05 нг/мл, что так же было выше нормы, мы это связываем с повышенной регенерацией ткани поджелудочной железы. При этом кортикостерон, тироксин и трийодтиронин полностью нормализовались.
ВЫВОДЫ
Таким образом, мы видим, что при ИМ на фоне СД происходит значительное ухудшение показателей функционирования левого желудочка. Трансплантация культуры клеток ПЖ приводит к нормализации показателей инсулярных и кон-тринсулярных гормонов, трансплантация МСК нормализует в основном функциональные пока-
затели левого желудочка сердца и незначительно показатели изучаемых гормонов. Трансплантация микс-культуры позволяет достичь двойного эффекта, заключающегося в нормализации показателей инсулярных и контринсулярных гормонов, а также восстановление функции левого желудочка, что является перспективным направлением в клеточной трансплантации.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ЛИТЕРАТУРА
1. Азизов В. А., Керимова Э. З., Садыгова Т. А. Сравнительный анализ факторов высокого риска инфаркта миокарда у больных сахарным диабетом типа 2 различного пола. Кардиология в Беларуси. 2011;5(18):127.
2. Дадабаева Н. А., Рамазанова Н. А., Ми-рахмедова Х. Т. Влияние сахарного диабета на тяжесть течения инфаркта миокарда. Евразийский кардиологический журнал. 2017;3:109.
3. Биккужин К. Р., Ахметов Р. М., Колосова Е. Г. Риск возникновения инфаркта миокарда у больных с сахарным диабетом. Молодой ученый. 2019;45(283):247-250.
4. Михайличенко В. Ю., Пилипчук А. А. Патофизиологические особенности сердца у крыс с экспериментальным сахарным диабетом, осложненным инфарктом миокарда. Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. 2017;7(1):27-37.
5. Михайличенко В. Ю. Ангиогенез при инфаркте миокарда и его коррекция трансплантацией мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток в эксперименте. Кубанский научный медицинский вестник. 2015;151(2):98-105.
6. Кияк Ю. Г., Лабинская О. Е., Галькевич М. П., Барнетт О. Ю., Кияк Г. Ю., Ковалишин В. И. Острый тромбоз стента при инфаркте миокарда,
2021, том 24, № 2
осложненном кардиогенным шоком, при наличии сахарного диабета 2-го типа. Международный эндокринологический журнал. 2018;14(8):776-782.
7. Непомнящих М. Н. Влияние сахарного диабета на возникновение инфаркта миокарда. Известия Российской Военно-медицинской академии. 2018;37(1):80-82.
8. Азизов В. А., Керимова Э. З., Мирзазаде В. А. Риск инфаркта миокарда у больных сахарным диабетом типа 2. I Евразийский конгресс кардиологов. I Национальный конгресс кардиологов Казахстана (сборник тезисов). 2009:36.
9. Kornienko E. A. Prophylaxis of reperfusion complications in treatment of acute myocardial infarction in type 2 diabetes mellitus patients. General Reanimatology. 2019;15(3):4-18.
10. Михайличенко В. Ю., Пилипчук А. А., Самарин С. А., Татарчук П. А. Патофизиологические аспекты моделирования инфаркта миокарда у крыс в эксперименте (данные ангиогенеза и ультразвукового исследования сердца). Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2016;11-2:260-263
REFERENCES
1. Azizov V. A., Kerimova E. Z., Sadigova T. A. Comparative analysis of high risk factors for myocardial infarction in patients with type 2 diabetes mellitus of different sex. Kardiologija v Belarusi. 2011;5(18):127. (In Russ.)
2. Dadabaeva N. A., Ramazanova N. A., Mirakhmedova Kh. T. Influence of diabetes mellitus on the severity of myocardial infarction. Evrazijskij kardiologicheskij zhurnal. 2017;3:109. (In Russ.)
3. Bikkuzhin K. R., Akhmetov R. M., Kolosova E. G. The risk of myocardial infarction in patients with diabetes mellitus. Molodoj uchenyj. 2019;45(283):247-250. (In Russ.)
4. Mykhaylichenko V. Yu., Pilipchuk A. A. Pathophysiological features of the heart in rats with experimental diabetes mellitus complicated by myocardial infarction. Crimean Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2017;7(1):27-37. (In Russ.)
5. Mykhaylichenko V. Yu. Angiogenesis in myocardial infarction and its correction by transplantation of multipotent mesenchymal stem cells in experiment. Kubanskij nauchnyj medicinskij vestnik. 2015;151(2):98-105. (In Russ.)
6. Kiyak Yu. G., Labinskaya O. E., Galkevich M. P., Barnett O. Yu., Kiyak G. Yu., Kovalishin V. I. Acute stent thrombosis in myocardial infarction complicated by cardiogenic shock, in the presence of type 2 diabetes mellitus. Mezhdunarodnyj jendokrinologicheskij zhurnal. 2018;14(8):776-782. (In Russ.)
7. Nepomnyashchikh M.N. Influence of diabetes mellitus on the occurrence of myocardial infarction. Izvestija Rossijskoj Voenno-medicinskoj akademii. 2018; 37 (1): 80-82. (In Russ.)
8. Azizov V. A., Kerimova E. Z., Mirzazade V. A. The risk of myocardial infarction in patients with type 2 diabetes mellitus. I Eurasian Congress of Cardiology. I National Congress of Cardiology of Kazakhstan (abstracts). 2009:36. (In Russ.)
9. Kornienko E. A. Prophylaxis of reperfusion complications in treatment of acute myocardial infarction in type 2 diabetes mellitus patients. General Reanimatology. 2019;15(3):4-18. (In Russ.)
10. Mykhaylichenko V. Yu., Pilipchuk A. A., Samarin S. A., Tatarchuk P. A. Pathophysiological aspects of experimental modeling of myocardial infarction in rats (data of angiogenesis and ultrasound examination of the heart). Mezhdunarodnyj zhurnal prikladnyh i fundamental'nyh issledovanij. 2016;11-2:260-263. (In Russ.)
