CC BY
34УДК 616.127-005.8-028.77-073.43-092:599.323.45 Михайличенко В. Ю., Пилипчук А. А.
ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СЕРДЦА У КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ, ОСЛОЖНЕННЫМ ИНФАРКТОМ МИОКАРДА
Кафедра общей хирургии, Медицинская академия имени С.И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского», 295006, бульвар Ленина 5/7, Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Михайличенко Вячеслав Юрьевич, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой общей хирургии, Медицинская академия имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского», E-mail: pancreas1978@mail.ru
For correspondence: Viyacheslav Yu. Mykhailichenko, Dr.Sci.Med., Head of the department of general practice surgery, Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, E-mail: pancreas1978@mail.ru
INFORMATION ABOUT AUTHORS Mykhaylichenko V. Yu., orcid.org/0000-0003-4204-5912 Pilipchuk A. A., orcid.org/0000-0001-6788-4363
РЕЗЮМЕ
В экспериментальной работе продемонстрирована роль контринсулярных и инсулярных гормонов в патофизиологических процессах развивающихся при сахарном диабете. Доказана соответствие модели аллоксанового диабета у крыс, сахарному диабету 1 типа у человека. Моделирование инфаркта миокарда у крыс на фоне сахарного аллоксанового диабета, сопровождается более низкими показателями сократительной способности левого желудочка сердца по отношению к крысам без диабета, снижением толерантности миокарда к стресс-иммитирующей нагрузке изопропилнордадреналину. Развивающаяся при массивной гибели В-клеток гипоинсулинемия приводит к нарушению усвоения клетками глюкозы и дистрофическим изменениям, особенно в артериальных сосудах, что проявляется мукоидным и фибриноидным набуханием в их стенке, повышением проницаемости с развитием периваскулярных плазморрагий. Это имеет свое отражение в нарушение гистоархитектоники почек, сердца, сосудов и др. Исследование показало, что нарушение перекисного окисления липидов, а также энергетического обмена кардиомиоцитов, с усилением патологического влияния контринсулярных гормонов надпочечников и щитовидной железы, усугубляют течение острого инфаркта миокарда у крыс и усиливает проявление сердечной недостаточности, а также снижает адаптационный резервуара миокарда.
Ключевые слова: аллоксановый диабет, инфаркт милокарда, контринсулярные гормоны.
SUMMARY
PATHOPHYSIOLOGICAL FEATURES OF HEART IN RATS WITH EXPERIMENTAL DIABETES WHICH IS COMPLICATED BY MYOCARDIAL INFARCTION
Mykhaylichenko V. Yu., Pilipchuk A. A.
In the experimental work demonstrated the role rontrinsular and insular hormones in the pathophysiological processes of developing diabetes. Proved compliance with the model of alloxan diabetes in rats with type 1 diabetes in humans. Modeling of myocardial infarction in rats with diabetes alloxan diabetes, accompanied by lower levels of contractility of the left ventricle of the heart in relation to the non-diabetic rats, decreased myocardial tolerance to stress simulates isopropilnordadrenalinu load. Developing with massive destruction of p-cells ,that leads to disruption gipoinsulinemiya glucose uptake by cells and dystrophic changes, especially in the arterial vessels, that as manifested by swelling fibrinoid and mucoid in the vessel wall increased permeability to the development of perivascular plasmorrhages. This is reflected in histoarchitectonics renal, cardiac, vascular, and others. The study found that the violation of lipid peroxidation, as well as the energy metabolism of cardiomyocytes, with the strengthening of the influence pathologic contrinsular hormones of the adrenal and thyroid gland, aggravated course of acute myocardial infarction in rats and increases the expression of heart failure, as well as decreases myocardial reserve adaptation.
Key words: alloxan diabetes, myocardial infarction, contrinsular hormones.
В настоящее время сахарный диабет (СД) занимает третье место среди причин высокой инвалидизации и смертности больных после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний [1,2]. По расчетам экспертов ВОЗ, ожидается значительное увеличение заболеваемости СД среди лиц старше 25 лет. Так, число больных этой возрастной категории в пери-
од с 1995 по 2025 гг. возрастет со 135 млн. чел. до 300 млн. (WHO technical report series №844: Prevention of diabetes mellitus. Report of a WHO study group. - Copenhagen: HO Regional office for Europe, 1994.-31p.). Несмотря на значительные успехи современной диабетологии, остаются проблемы профилактики развития вторичных осложнений, ранней инвалидизации и высокой
смертности пациентов с сахарным диабетом 1 типа. В развитии СД 1-го типа ведущее значение принадлежит аутоиммунной деструкции в-клеток поджелудочной железы [2,7]. Важную роль в развитии сахарного диабета 1 типа и его осложнений играет дисбаланс инсулярных и контринсулярных гормонов, а также нарушения белкового и жирового, а не только углеводного видов обмена [3,4-6]. Все эти факторы приводят к высокому риску возникновения патологии сердечно-сосудистой системы и таких социально значимых заболеваний как артериальная гипертензия, инфаркт миокарда [4,5].
Цель исследования - изучить дисбаланс ин-сулярных и контринсулярных гормонов у крыс с моделью аллоксанового сахарного диабета и их влияния на острый инфаркт миокарда (ИМ).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Экспериментальное исследование выполнено на крысах инбредной линии Ви-стар-Киото. Работа выполнена на шести-месчных особях средней массой 302,4±13,2 грамм. Нами было сформировано 3 группы:
• 1 группа (n=30) контрольная - ин-тактные животные, результаты которых использовались для дальнейшей стандартизации проводимых инструментальных и лабораторных методов исследования.
• 2 группа (n=30) - крысы, которым помимо торакотомии выполнялось хирургическое моделирование ИМ.
• 3 группа (n=30) - крысы, которым помимо торакотомии выполнялось хирургическое моделирование ИМ на фоне аллоксанового сахарного диабета.
Сахарный диабет моделировали путем введения водного раствора аллоксана крысам подкожно в дозе 200 мг/кг. Для повышения чувствительности в -клеток к аллоксану все животные предварительно 2 суток голодали. Раствор аллоксана готовили путем растворения кристаллического субстрата Alloxan Tetrahydrate фирмы Fluka-Sigma (Германия) в стерильной дистиллированной воде. После растворения кристаллов вещества стерильность раствора добивались путем пропускания его через мембрану Millex-GV с фильтром 0,22 mm фирмы MILLIPORE (Франция) и помещали в стерильные закатанные флаконы. Для уменьшения смертности от гипогликемической комы животным через 2-4 часа (после контроля глюкозы крови) давали пить воду с сахаром. После формирования модели сахарного диабета (в опыт брали животных с СД средней тяжести, уровень глюкозы в крови от 8 до 14 ммоль/л) исчезновения токсического эффекта аллоксана (30 сутки).
Моделирование инфаркта миокарда проводили по разработанной нами методике [4-6]. Оперативное вмешательство выполнялось в условиях общего обезболивания, путем интра-перитонеального введения калипсола (Гедеон Рихтер А.О., Венгрия) и ксилазина (Ксила, Interchemie, Нидерланды) в дозах 60мг/кг и 7,5 мг/кг соответственно. Чтобы предотвратить летальный исход, с целью адекватной интрао-перационной вентиляции и обеспечения проходимости дыхательных путей, осуществлялось наложение трахеостомы, в просвет трахеи вводился пластиковый катетер 14G (диаметр до 2мм). Параметры ИВЛ подбирались исходя из физиологических особенностей крыс. Производилась левосторонняя торакотомия в 5 межре-берье. Передняя левожелудочковая артерия прошивалась на уровне левого ушка после первого деления нитью Prolene 7/0 (фирмы Ethicon, Inc.) и лигировалась. Макроскопически, непосредственно после завязывания лигатуры, оценивали формирование зоны ИМ. После этого производится послойное ушивание грудной полости.
Всем животным проводились общий анализ крови, мочи, АЛТ, АСТ, альфа-амилазу, глюкозу крови, холестерин, триглицериды, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП по стандартной методике. Для исследования гормонального статуса кровь забирали в количестве 2 мл в условиях основного обмена утром натощак. Кровь центрифугировали в течение 30 мин с ускорением не менее 3000g при температуре +40С на рефреджира-торной центрифуге К-23 (Германия). Полученную плазму тубировали в заранее промаркированные пластиковые тубы типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл, в которых хранили (не более 3-4 недель) при температуре -700С. Определение содержания инсулина, кортикостерона, С-пептида, тироксина и трийодтиронина проводили радиоиммунологическим методом с использованием стандартных коммерческих наборов реактивов фирмы "Immunotech" (Чехия).
После предварительных записей показателей ЭКГ и ЧСС по описанной выше методике, животное, все ещё находящееся под действием медикаментозного сна, подвергалось стресс нагрузке, которая моделировалась путем внутримышечного введения 1% раствора изопро-пилнорадреналина в дозе 3мкг/кг. Затем измерения повторяли каждые 3 минуты в течение последующих 15 минут. Таким образом мы получали контрольные 5 точек изучения реакции сердца на стресс-имитирующие условия.
Гистологическое исследование органов проводили на 3, 6, 7, 10, 14 и 30 сутки, 3,6,12 месяц после трансплантации клеточно-ткане-вых культур, а также выполнения операции
депортализации и симультанном операции депортализации с трансплантацией культуры клеток поджелудочной железы. Органы фиксировались в 10% нейтральном формалине и затем заливались парафином. Гистологические срезы окрашивались гематоксилином и эозином, по Вергоффу, альциановым синим при рН 1,0 и 2,6, выполняли ШИК-реакцию.
Исследование окрашенных препаратов и морфометрическое исследование проводили с помощью исследовательского микроскопа Olympus AX70 (Япония) и соединенной с ним компьютерной системы с программой анализа изображения AnalySIS 3.1 (Германия).
Экспериментальный материал диссертационной работы подвергся компьютерной обработке на персональном компьютере с программами "Excel 7,0", "Statistica 6.0" фирмы StatSoft. При выполнении работы степень достоверности различий средних величин в сопоставляемых группах определялась пу-
Динамика глюкозы крови крысы при разных
тем использования критериев Стьюдента и Фишера. Для характеристики взаимосвязей между определенными параметрами использовали подсчет линейной корреляции (критерий Пирсона) и составляли уравнения линейной и нелинейной регрессии.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Сахарный диабет определяют, как синдром хронической гипергликемии и глю-козурии, поэтому диагноз «сахарный диабет» должен быть подтвержден результатами лабораторного исследования.
После введения диабетогенных доз аллок-сана наблюдалось несколько фаз изменения сахарной кривой в крови: первая фаза - ги-пергликемическая, достигающая максимума в течение первых 2-4 часов; вторая - гипогли-кемическая, которая в основном проявлялась на протяжении 15-24 часов, и наконец третья фаза - фаза стойкой гипергликемии (Табл.1).
Таблица 1
фазах развития сахарного диабета (M±m)*
Показатель Норма 1 фаза 2 фаза 3 фаза
Глюкоза крови, (ммоль/л) 4,31±0,13 19,66±1,35 1,42±0,42 13,19±1,17
Инсулин мкМЕ/л 3,53±0,21 0,76±0,02 27,4±1,25 2,3±0,04
Примечание: *- различия между нормой и 1 фазой, а также между фазами достоверны (р<0,001)
Первая фаза, сопровождающаяся повышением показателя глюкозы крови в 4,56 раза по сравнению с нормой, объясняется резкой блокадой выделения инсулина ^-клетками поджелудочной железы, что говорит о проникновении аллоксана внутрь клетки. Во вторую фаза отмечается резкое падение уровня глюкозы крови в 13,85 раза по сравнению с 1 фазой и в 3 раза меньше нормы. Это объясняется тем, что разрушается мембрана ^-клетки островка Лангерганса, что приводит к выходу в организм всего инсулина, что находился внутри нее. В эту фазу с целью уменьшения смертности животных от гипогликемической комы мы давали воду с сахаром, что позволило более чем в 3 раза уменьшить этот показатель. В третью
фазу, которая обычно наступает через 24-48 часа, проявляется стабильное повышение показателя глюкозы крови и составляет в среднем 13,19±1,17 ммоль/л, что в 9,29 раза больше, чем в предыдущую фазу, и в 3,06 раза больше нормы. Третья фаза характеризует полное формирование аллоксанового диабета и сопровождается гибелью основного числа в -клеток.
К концу 3 суток диабета концентрация глюкозы крови составляет 11,43±0,12 ммоль/л, что недостоверно меньше чем в 3 фазу (1=1,49, Р>0,05). В дальнейшем отмечается незначительный рост концентрации глюкозы крови, которая к концу 1 месяца заболевания составляет 13,74±0,25 ммоль/л (Табл.2), что недостоверно отличается от концентрации глюкозы в 3 фазу (1=0,5, Р>0,05).
Таблица 2
Динамика глюкозы крови крысы при разных сроках сахарного диабета (M±m)
Срок/Показатель Норма 3 сутки диабета 7 сутки диабета 1 месяц диабета
Глюкоза, ммоль/л 4,31±0,13 11,43±0,12* 12,67±0,07** 13,74±0,25**
Примечания: * - различия с нормой достоверны (р<0,001); **- различия между 3 и 7 сутками, а также между 7 сутками и 1 месяцем достоверны (р<0,001)
Инсулиновая недостаточность при аллок-сановом диабете приводит к усиленному распаду тканевых белков, нарушению не только углеводного, но и липидного обмена (Табл.3). Для сахарного диабета характерным является нарушение липидного обмена, который проявляется в повышение содержания в сыворотке бета-холестерина (ЛПНП), пребетахолестери-на (ЛПОНП), триглицеридов и холестерина, а также снижение содержания альфа-холестерина (ЛПВП). Причем, в отличие от углеводного обмена, метаболизм липидов нарушается постепенно. Так различия между фракциями в сроки 3 сутки и нормой статистически недо-
стоверны, между 3 и 7 сутками, а также между 7 сутками и нормой также недостоверна (Р>0,05). Через 1 месяц после развития аллоксанового диабета отмечается достоверное уменьшение содержания ЛПВП до 0,81±0,105 ммоль/л, что ниже нормы в 1,54 раза, а также достоверное повышение содержания атерогенных липидов: ЛПНП до 3,1±0,21 ммоль/л, что выше нормы в 1,35 раза и ЛПОНП до 1,08±0,094 ммоль/л, что выше нормы в 2,29 раза. Параллельно повышается содержание триглицеридов до 2,11±0,11 ммоль/л, что выше нормы в 1,7 раза, и увеличивается концентрация холестерина до 5,08±0,39 ммоль/л, что в 1,35 раза выше нормы.
Таблица 3
Показатели липидного обмена у крыс с аллоксановым диабетом (M±m)
Срок/Показ атель Норма 3 сутки диабета 7 сутки диабета 1 месяц диабета
ЛПВП, (ммоль/л) 1,25±0,06 1,25±0,07* 1,21±0,06* 0,81±0,11**
ЛПНП, (ммоль/л) 2,29±0,06 2,32±0,24* 2,43±0,31* 3,1±0,21***
ЛПОНП, (ммоль/л) 0,47±0,08 0,48±0,08* 0,52±0,06* 1,08±0,09**
Триглицериды, (ммоль/л) 1,24±0,12 1,2±0,12* 1,49±0,14* 2,11±0,11**
Холестерин, (ммоль/л) 3,75±0,07 3,75±0,12* 3,86±0,05* 5,08±0,39***
Альфа-амилаза, Е/л **** 791.22±56,79 1234,85±43,37 772,17±37,73 784,14±46,35
Примечания: * - различие между предстоящим и сравниваемым показателем недостоверно (р>0,05); **- различие между предстоящим и сравниваемым показателем достоверно (р<0,001); ***- различие между предстоящим и сравниваемым показателем достоверно (р<0,05); **** - различие между нормой и 7 сутками, а также 7 сутками и 1 месяцем, нормой и 1 месяцем недостоверно (р>0,05); различие между нормой и 3 сутками, а также 3 и 7 сутками достоверно (р<0,001)
Показатели АЛТ, АСТ, мочевины и креатинина не изменялись на протяжении 1 месяца развития сахарного диабета и оставались в пределах нормы.
Следует отметить, что к 3 суткам отмечается достоверное увеличение уровня альфа-амилазы в 1,56 раза по сравнению с нормой, что говорит о массивной гибели ткани поджелудочной железы. Данный показатель нормализуется к 7 суткам и остается в пределах нормы (Табл.4).
В конце каждого месяца опыта определяли уровень гликозилированного гемоглобина (HbA1c), который находится в прямой зависимости от уровня глюкозы крови и является интегрированным показателем компенсации углеводного обмена на протяжении последних 60-90 дней. В конце 1 месяца заболевания аллоксано-вым диабетом концентрация HbA1c достоверно выше нормы в 1,94 раза и равняется 5,54±0,72 %.
При исследовании мочи через 1 месяц болезни: удельный вес - 1,03±0,06; рН - 6±1,5; глюкоза - 10±2 ммоль/л; белок - 100± 11 мг/дцЛ, что говорит о развитии диабетической нефропатии.
Через 1 месяц после формирования диабета и выбраковки животных с диабетом, не соответствующим средней степени тяжести (уровень глюкозы крови не был в пределах 8-14 ммоль/л), приступали к созданию 4 групп животных. Кровь для анализов забирали на 1,6,14,30 сутки, 3,6 и 12 месяц для 2-3 групп и на 1,3,6,9 месяц для контрольной группы.
В разные фазы развития аллоксанового диабета отмечалось соответствующее колебаниям уровня глюкозы крови, изменение концентрации инсулина (Табл.1), который в 1 фазу равнялся 0,76±0,02 мкМЕ/л, во 2 фазу - 27,41±1,25 мкМЕ/л и в 3 фазу - 2,32±0,04 мкМЕ/л.
С целью изучения динамики концентрации инсулярных и контринсулярных гормо-
нов, нами были выбраны следующие виды гормонов: инсулин, С-пептид - представители инсулярных гормонов, кортикостерон, тироксин и трийодтиронин - представители
контринсулярных гормонов. Половые гормоны не брали во внимание, т.к. у крыс 5-7 дневный половой цикл и их динамика не отражают сути изменений, протекающих в организме.
Таблица 4
Уровни инсулярных и контринсулярных гормонов при аллоксановом диабете у крыс в срок до 1
месяца (M±m)
Показатель Норма 3 сутки 7 сутки 14 суток 1 месяц
Инсулин мкМЕ/л 3,53±0,21 2,34±0,02 **** 2,05±0,04 **** 2,07±0,01 ** 1,94±0,1 ***
Опептид нг/мл 0,733±0,02 0,231±0,015 **** 0,175±0,002 **** 0,173±0,001 ** 0,152±0,01*, #
Кортико-стерон нмоль/л 355,22±25,2 513,69±11,73 **** 597,72±13,26 **** 597,93±11,13** 609,3±20,7**, #
Тироксин нмоль/л 39,54±1,93 27,91±1,4 **** 22,46±0,97 * 22,51±0,83 ** 20,12±0,82**, #
Трийодти-ронин нмоль/л 2,42±0,15 1,75±0,12 **** 1,22±0,02 * 1,24±0,03 ** 1,08±0,09**,#
Примечания: *-различие между предстоящим и сравниваемым показателем достоверно (р<0,05); **- различие между предстоящим и сравниваемым показателем недостоверно (р>0,05); ***- различие между первоначальным и конечным показателем недостоверно (р<0,05); **** - различие между предстоящим и сравниваемым показателем достоверно (р<0,001); # - различие между первоначальным и конечным показателем достоверно (р<0,05).
После окончания моделирования аллоксано-вого диабета концентрация инсулина (Табл.4.) на 3 сутки равнялась 2,34±0,02 мкМЕ/л, что в 1,5 раз ниже нормы при Р<0,001. Далее показатель инсулина статистически достоверно уменьшался и к 7 суткам равнялся 2,05±0,04 мкМЕ/л и оставался на этом уровне до 14 суток. Затем достоверно наступала вторая волна падения уровня инсулин и к 1 месяцу его концентрация равнялась 1,94±0,1 мкМЕ/л, что в 1,82 раза ниже нормы при Р<0,001. Концентрация С-пептида к 3 суткам уменьшилась в 3,17 раза при Р<0,001 и равнялась 0,231±0,015 нг/мл. Далее она не изменялась до 14 суток и концу 1 месяца достоверно понижалась в 1,14 раза и равнялась 0,152±0,01 нг/мл, что в 4,8 раз меньше исходного уровня при Р<0,001. Причем существует четкая линейная зависимость между концентрацией инсулина и С-пептида при х=0,99 и зависимость подчиняется линейной регрессии, которую можно представить в виде С= 1,65+2,63*И, где С- С-пептид, И- инсулин при Б = 156,32, Ш = 0,987, р<0,006, где Б-критерий Фишера, М-степень точности описания модели процесса, р-уровень значимости критерия Фишера.
Уровень кортикостерона к 1 суткам повысился в 1,45 раз по сравнению с исходным при Р<0,001 и равнялся 513,69±11,73 нмоль/л. Затем он постепенно повышался и к 7 суткам равнялся 597,72±13,21 нмоль/л и до 14 суток статистически достоверно оставался на этом уровне,
что в 1,68 раз выше исходного значения при Р<0,001. Далее к 1 месяцу концентрация корти-костерона достоверно повысилась до 609,3±20,7 нмоль/л, что в 1,72 раз выше нормы при Р<0,001.
Между уровнем кортикостерона и инсулина существует линейная зависимость х=0,99 и она подчиняется линейной регрессии: И = 5,66 - 0,02»К/3 где К - кортикостерон, И - инсулин при Б = 92,388, Ш = 0,97, р<0,011. Между концентрацией С-пептида и кортикосте-рона также существует линейная регрессия Х=0,97 и зависимость можно представить в виде формулы линейной регрессии: С = 1,5-0,0068.К/3, при Б = 29,67, М = 0,94, р<0,03.
Первоначально при нормальных показателях инсулина и С-пептида, уровень кортико-стерона находится на низком (нормальном) уровне, но при длительном пребывании инсулина и С-пептида на показателях ниже нормы, концентрация кортикостерона прогрессивно увеличивается, даже если инсулярные гормоны и остаются стабильные на низком уровне. Таким образом, мы видим, что патологическая низкая концентрация инсулярных гормонов приводит к дисфункциональному патологическому росту уровня кортикостерона.
Концентрация тироксина на 3 сутки уменьшается в 1,42 раза по сравнению с исходным уровнем при р<0,05 и продолжает статистически достоверно снижаться до 7 суток и равняется 22,46±0,97 нмоль/л и остается на этом
уровне до 14 суток. В 1 месяц показатель равняется 20,12±0,82 нмоль/л, что недостоверно отличается от данных за 14 сутки , что в 1,96 раз меньше исходных данных при р<0,05. Уровень трийодтиронина к 3 суткам уменьшился в 1,38 раза по сравнению с исходными данными при Р<0,001, затем к 7 суткам он понижался до 1,22±0,02 нмоль/л и статистически достоверно не изменялся до 1 месяца. В 1 месяц он равнялся 1,08±0,09 нмоль/л, что в 2,24 раза ниже первоначального уровня при Р<0,001.
В отдаленные сроки уровень инсулина до 3 месяца остается достоверно неизмененным и к 6 месяцу уменьшается до 1,84±0,023 мкМЕ/л при Р<0,001, что в 1,94 раза меньше нормы при Р<0,001 и статистически достоверно не
отличается от 1 месячного показателя. Концентрация С-пептида статистически достоверно остается на стабильном низком уровне и к концу 9 месяца равняется 0,148±0,015 нг/ мл при р<0,05, что в 4,95 раз достоверно ниже нормы. Уровень кортикостерона так же оставался стабильным до конца опыта и равнялся к 9 месяцу 642,9±25,8 нмоль/л, что в 1,81 раза достоверно выше нормы. Концентрация тироксина аналогично оставалась стабильной и к 9 месяцу составляла 16,41±0,51 нмоль/л, что в 2,41 раза ниже нормы. Показатель трий-одтиронина к 3 месяцу достоверно уменьшился до 0,57±0,04 нмоль/л, т.е. в 2,08 раз по сравнению с предстоящим показателем, что в 4,65 раза меньше нормы при Р<0,001 (табл.5).
Таблица 5
Уровни инсулярных и контринсулярных гормонов при аллоксановом диабете у крыс в срок до 1 года
(M±m)
Показатель Норма 1 месяц 3 месяца 6 месяца 9 месяцев
Инсулин, мкМЕ/л 3,53±0,21 1,94±0,1 1,9±0,1** 1,84±0,02**** 1,83±0,04**, ***
Опептид, нг/ мл 0,733±0,02 0,152±0,01 0,154±0,025** 0,15±0,03** 0,148±0,015**, #
Кортикосте-рон, нмоль/л 355,2±25,2 609,3±20,7 613,5±17,4** 622,2±22,2** 642,9±25,8**, #
Тироксин, нмоль/л 39,54±1,93 20,12±0,82 18,7±0,94** 17,6±0,67** 16,4±0,51**, #
Трийодти-ро-нин, нмоль/л 2,42±0,15 1,08±0,09 0,57±0,04* 0,52±0,02** 0,51±0,03**, ****
Примечания: ^-различие между предстоящим и сравниваемым показателем достоверно (р<0,05); **- различие между предстоящим и сравниваемым показателем недостоверно (р>0,05); ***- различие между первоначальным и конечным показателем недостоверно (р<0,05); **** - различие между предстоящим и сравниваемым показателем достоверно (р<0,001); # - различие между первоначальным и конечным показателем достоверно (р<0,05).
Зависимость инсулярных и контринсуляр-ных гормонов между собой показана на Рис.1 и Рис.2, исходя из которых видно, что первоначально, при нормальных показателях инсулина и С-пептида, уровень кортикостерона находится на низком (нормальном) уровне, но при длительном пребывании инсулина и С-пептида на показателях ниже нормы, концентрация кортикостерона прогрессивно увеличивается, даже если инсулярные гормоны и остаются стабильные на низком уровне. Уровень тироксина понижается сразу же после понижения концентрации инсулина и С-пептида, и продолжает пропорционально вместе с трийодти-ронином поддерживать эту тенденцию. Таким образом, мы видим, что патологическая низкая концентрация инсулярных гормонов приводит
к дисфункциональному патологическому росту уровня кортикостерона и уменьшению концентрации тироксина и трийодтиронина. Цветовая гамма рисунков отображает скачки концентрации гормонов по каждому из пунктов.
ОБСУЖДЕНИЕ
Весь процесс, происходящий в гормональном статусе животных с аллоксановым диабетом, можно выразить в математических уравнениях. Так, при изучении взаимосвязи между инсулином и С-пептидом, установлено, что параметры связаны между собой только прямой линейной связью (х=0,98), и процесс можно описать следующим уравнением: И=1,52+2,78.С при Ш=0,94, Б=28,770, р<0,033, 8БОБ (стандартная ошибка эстимации)=0,1.
Рис.1. Зависимость инсулина, с-пептида и кортикостерона между собой при аллоксановом диабете (уаг1-инсулин, уаг2-С-пептид, уаг3-кортикостерон, сазе-срок диабета, уаг4-тироксин, уаг5-
трийодтиронин)
Рис.2. Зависимость инсулина, с-пептида и кортикостерона между собой при аллоксановом диабете (уаг1-инсулин, уаг2-С-пептид, уаг3-кортикостерон, сазе-срок диабета, уаг4-тироксин, уаг5-
трийодтиронин)
Концентрация инсулина также связана с корти-костероном прямой линейной связью (х=0,99), и процесс можно описать следующим уравнением: И=5,57-0,018.К/3 при Ш=0,98, Б=272,28, р<0,0000001, 8Б0Б=0,08993. Показатели инсулина и тироксина связаны прямой линейной связью (х=0,99), и процесс можно описать следующим уравнением: И=0,48+0,074»Т4 при Ш=0,95, Б=135,43, р<0,00002, 8Б0Б=0,26. Между параметрами инсулина и трийодтирони-
на имеется высокой степени линейная связь (Х=0,91), модель описывается уравнением линейной регрессии И=1,29+0,77»Т4 при Б=27,813, р<0,00188, но модель удовлетворительно описывает процесс (М=0,92) и возрастает соответственно (8Б0Б=0,27). Данную связь точнее отображает уравнение нелинейной регрессии И= -7,43+9,26•8QR•Т3-9,25•logТ3 при Я1=0,96, Б=64,316, р<0,00027, 8Б0Б=0,13. Исходя из вышесказанного, мы видим, что взаимосвязь ин-
сулина с трийодтиронином выраженная через уравнение нелинейной регрессии позволила снизить в 2 раза стандартную ошибку эстима-ции при гораздо более высокой степени описания процесса. Взаимосвязь концентрации С-пептида и кортикостерона отвечает требованиям прямой линейной корреляции (х=0,96), и процесс можно описать следующим уравнением линейной регрессии: С=1,41-0,006»К/3 при М=0,92 (модель удовлетворительно описывает процесс), Б=71,240, р<0,00015, 8Е0Е=0,061, однако между параметрами С-пептида и тироксина хотя и существует высокая прямая линейная корреляция (х=0,93), но процесс удовлетворительно описывается уравнением линейной регрессии (М=0,87) и хорошо описывается моделью нелинейной регрессии (М=0,98): С=4,27+1,9^Я.Т4-9,74^Т4 при Б=192,36, р<0,0002, 8Е0Е=0,02671. Между данными С-пептида и трийодтиронина существует невыраженная прямая линейная связь (х=0,83), но процесс неудовлетворительно описывается уравнением линейной регрессии (Ш=0,69) и хорошо описывается моделью нелинейной регрессии (М=0,96): С=-3,69+3,78^Я.Т3-3,95^Т3 при Б=29,387, р<0,00169, 8Е0Е=0,066. Взаимосвязь концентрации кортикостерона и тироксина отвечает требованиям прямой линейной корреляции (х=0,99), и процесс можно описать следующим уравнением линейной регрессии: К=(285,21-4,126.Т3) .3 при М=0,97, Б=254,80, р<0,00001, 8Е0Е=5,15. Между данными корти-костерона и трийодтиронина существует невыраженная прямая линейная связь (х=0,85), но процесс удовлетворительно описывается уравнением линейной регрессии (М=0,85) и хорошо описывается моделью нелинейной регрессии (М=0,96): К=(391,37-42,34^Я.Т4) .3 при Б= 133,88, р<0,00003, 8Е0Е=7,04.
На 30 день после введения аллоксана в поджелудочной железе по-прежнему отмечается резкое уменьшение количества и размеров островков Лангерганса, их удельный объём составил 0,0648%±0,0045, что в 14,3 раза меньше, чем в норме. Количество клеток в островке было крайне мало (от 3 до 7, в среднем 5,68±0,14). Отмечаются резкие дистрофические изменения в некоторых дольках экзокринной части поджелудочной железы, а также разрастание соединительной ткани между дольками. В почках отмечается нерезко выраженная вакуольная дистрофия извитых канальцев, отложения гликогена в цитоплазме эпителиоцитов (рис. 3). Стенка некоторых сосудов в почках утолщена, в единичных сосудах встречается гиалиноз стенки. В сердце отмечаются признаки гипертрофии кардиомиоци-
тов. В сосудах сердца наблюдается расширение просвета сосудов, стаза крови в них, утолщение и разволокнение стенки, вокруг сосудов наблюдаются участки плазморрагии (рис. 4), в единичных сосудах стенка гиалинизирована.
Рис.3. Почка, 30 сутки аллоксанового диабета. Гранулы гликогена в эпителии извитых канальцев. ШИК-реакция, х150.
Рис.4. Сердце, 30 сутки аллоксанового диабета. Расширение просвета сосудов, признаки стаза в них, утолщение и разволокнение стенки, участки плазморрагии вокруг сосудов. Окраска гематоксилином и эозином. Х 200.
ДИСКУССИЯ
Развивающаяся при массивной гибели В-клеток гипоинсулинемия приводит к нарушению усвоения клетками глюкозы и дистрофическим изменениям, особенно в артериальных сосудах, что проявляется мукоидным и фибри-ноидным набуханием в их стенке, повышением проницаемости с развитием периваскулярных плазморрагий. Уже к 30 дню развивается выраженная диабетическая микроангиопатия, которая проявляется утолщением стенок со-
судов всех органов за счет набухания и иногда гиалиноза, в совокупности с нарушениями гемостаза в них формируются гиалиновые тромбы. Микроангиопатия приводит к усугублению дистрофических изменений в различных органах. В почках кроме вакуольной дистрофии наблюдается накопление гликогена в извитых канальцах, что связано с активацией процессов реабсорбции глюкозы из мочи. В сердце развивается гипертрофия миокарда, которая может быть связана с развитием гипертензии у животных, и мелкие очаги дистрофических изменений кардиомиоцитов. Развивающаяся при массивной гибели В-клеток гипоинсулине-мия приводит к нарушению усвоения клетками глюкозы и дистрофическим изменениям, особенно в артериальных сосудах, что проявляется мукоидным и фибриноидным набуханием в их стенке, повышением проницаемости с развитием периваскулярных плазморрагий. Уже к 30 дню развивается выраженная диабетическая микроангиопатия, которая проявляется утолщением стенок сосудов всех органов за счет набухания и иногда гиалиноза, в совокупности с нарушениями гемостаза в них формируются гиалиновые тромбы. Микроангиопатия приводит к усугублению дистрофических изменений в различных органах. В почках кроме вакуольной дистрофии наблюдается накопление гликогена в извитых канальцах, что связано с активацией процессов реабсорбции глюкозы из мочи. В сердце развивается гипертрофия миокарда, которая может быть связана с развитием гипертензии у животных, и мелкие очаги дистрофических изменений кардиомиоцитов.
Можно предположить, что оставшиеся в живых островковые клетки могут стать источни-
ком регенерации, однако считается, что нейро-эндокринные клетки обладают ограниченной регенераторной способностью, что мы и увидели в группе животных, которые не получали никакого лечения. В этой группе с течением времени мы не обнаружили никаких признаков регенерации островковой ткани. Также регенерация не обнаруживалась и у животных после операции депортализации, увеличение удельного объема островков можно объяснить атрофией, постнекротическим фиброзом и липоматозом экзокринной части железы, но количество клеток в островках остается неизменным.
При изучении хронотропной функции сердца у крыс с помощью изопропилнорадре-налиновой стресс-нагрузкой, мы получили следующие данные представленные в табл.6. Базовое значение средней ЧСС крыс линии Вистар-Киото принимавших участие в эксперименте составило 485 ± 13 уд/мин. Следует отметить что мониторинг данного показателя во время основного этапа эксперимента и в ближайшем постоперационном периоде выявил значительное повышение ЧСС во всех группах животных, которым проводилось моделирование ИМ. В дальнейшем при развитии стресса, в группе крыс с ИМ происходит увеличение ЧСС до 535±15уд/мин и к концу опыта находится на более высоком уровне, чем в норме 515±15. В группе 3 на фоне сахарного диабета происходит более грубые изменения хронотропной функции сердца, так все изучаемые величины были гораздо выше группы 2, что свидетельствует об больших энергетических затратах сердца, для компенсации стрессовой нагрузки по сравнению с ИМ у фоново здоровых крыс.
Таблица 6
Показатели ЧСС у экспериментальных животных при моделировании стрессовой нагрузки изопро-
пилнорадреналином на 30 сутки эксперимента.
Группа Базовые значения ЧСС (уд/мин) Максимальные показатели ЧСС (уд/мин) Результат ЧСС на момент окончания нагрузки (уд/мин)
1 485±13 527±18** 490±13***
2 503±13 535±15 515±15*
3 534±12 557±14* 533±10***
Примечание: *- при р<0,05; ** - при р<0,01; *** - при р<0,001 1 группа - интактные животные; 2 - группа крыс с ИМ; 3 - группа крыс с ИМ на фоне аллоксанового сахарного диабета.
По данным УЗИ (табл.7), нами изучались пять основных показателей функции левого желудочка: конечный диастолический и систолический внутренние диаметры левого желудочка, ударный объем (УО), а также фрак-
цию укорочения (ФУ) и выброса (ФВ). В ходе проведенного анализа полученных данных, мы убедились, что при моделировании инфаркта миокарда у крыс значительно снижается сократительная способность левого желудочка, что
проявляется в снижении фракции сокращения и укорочения левого желудочка, уменьшении ударного объема, увеличении конечного систолического и диастолического размера левого желудочка. На фоне сахарного диабета у крыс
происходит значительное ухудшение изучаемых показателей, что свидетельствует о патофизиологических негативных влияний сахарного диабета на течение инфаркта миокарда у крыс.
Таблица 7
Ультразвуковые показатели функционирования сердца у крыс
Показатель Группа
1 2 3
LVIDd, mm 6,16±0,12 7,19±0,16 7,23±0,11
LVIDs, mm 2,82±0,18 3,82±0,11 3,96±0,12
FS, % 45,3±1,7 26,8±0,8 22,1±0,5
EF, % 76,9±2,5 55,3±3,4 46,2±1,8
SV, ml 0,25±0,08 0,13±0,03 0,1±0,02
Примечание: статистическая достоверность показателей представлена в тексте. LVIDd - end-diastolic left ventricular internal dimensions (конечный диастолический внутренний диаметр левого желудочка); LVIDs - end-systolic left ventricular internal dimensions (конечный систолический внутренний диаметр левого желудочка); FS - fractional shortening (ФУ, фракция укорочения); EF - ejection fraction (ФВ, фракция выброса); SV - stroke volume (УО, ударный объем).
ВЫВОДЫ
Таким образом аллоксановая модель сахарного диабета у крыс позволяет добиться аналогию течения патофизиологических процессов сахарного диабета 1 типа у человека. Доказана важная роль в развитии сахарного диабета кон-тринсулярных гормонов, что в свою очередь требуют определенного пересмотра отношения патофизиологов и эндокринологов к ним при сахарном диабете. Раскрытые механизмы могут лечь в основу развития различных осложнений сахарного диабета, таких как микро- и макро-ангиопатии, соответственно патологии сердечно-сосудистой системы. В частности нами продемонстрировано снижение сократительной способности сердца у крыс с инфарктом миокарда на фоне сахарного диабета и ухудшение показателей хронотропной функции сердца при изопропилнорадреналиновой стресс-нагрузке.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гринь В.К., Михайличенко В.Ю., Гнилорыбов А.М. и др. Клеточная кардиомиопластика при экспериментальном инфаркте миокарда. Донецк; 2014.
2. Дедов И.И., Шестакова М.В., Миленькая Т.М. Сахарный диабет: ретинопатия, нефропатия. М.: Медицина; 2001.
3. Михайличенко В.Ю., Самарин С.А. Обоснование эффективности различных видов кардиомиопласти-ки при инфаркте миокарда в эксперименте. Таврический медико-биологический вестник. 2014; 68(4):73-81.
4. Михайличенко В.Ю. Ангиогенез при инфаркте миокарда и его коррекция трансплантацией мульти-потентных мезенхимальных стволовых клеток в эксперименте. Кубанский научный медицинский вестник. 2015;151(2):98-105.
5. Михайличенко В.Ю., Самарин С.А. Влияние мезенхимальных стволовых клеток на эндотелиальную дисфункцию и баланс ангиогенных факторов при лечении экспериментального инфаркта миокарда. Universum: Медицина и фармакология. 2015;14(1):3.
6. Михайличенко В.Ю., А.А. Пилипчук, С.А. Самарин, П.А. Татарчук Патофизиологические аспекты моделирования инфаркта миокарда у крыс в эксперименте (данные ангиогенеза и ультразвукового исследования сердца). Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2016;11(2):260-263.
7. Смирнова О.М. Аутоиммунный латентный сахарный диабет у взрослых. Проблемы эндокринологии. 2008; 54(2):3-7.
8. Mykhaylichenko V.Yu., Kubyshkin A.V., Samarin S.A. et al. Experimental induction of reparative morphogenesis and adaptive reserves in the ischemic myocardium using multipotent mesenchymal bone marrow-derived stem cells. Pathophysiology. 2016;2-10. http:// dx.doi.org/10.1016/j.pathophys. 2016.04.002
REFERENCES
1. Grin V.K. Cellular cardiomyoplasty of experimental myocardial infarction / V.K. Grin, V.Yu. Mykhaylichenko, A.M. Gniloryibov et al. Donetsk; 2014. (In Russ).
2. Dedov I.I., Shestakova M.V., Milenkaya T.M. Diabetes: retinopathy, nephropathy. M .: Medicine.; 2001. (In Russ).
3. Mykhaylichenko V.Yu., Samarin S.A. Substantiation of efficiency of different cardiomyoplasty types in experimental myocardial infarction. Tavricheskiy mediko-biologicheskiy vestnik. 2014; 68(4):73-81. (In Russ).
4. Myhaylichenko V.Yu., Samarin S.A. Regulation of angiogenesis in experimental myocardial infarction zone by application of multipotent mesenchymal stem cells. Kubanskiy nauchnyiy meditsinskiy vestnik. 2015;151(2):98-105. (In Russ).
5. Mykhaylichenko V.Yu., Samarin S.A. The influence of mesenchymal stem cells on endothelial dysfunction and the balance of vasoformative factors in treatment of experimental myocardium infarction. Universum: IVIeditsina i farmakologiya. 2015;14(1):3. (In Russ).
6. Myhaylichenko V.Yu., Pilipchuk A.A., Samarin S.A., Tatarchuk P.A. Pathophysiological aspects of modeling of myocardial infarction in rats in experimentation (the materials of angiogenesis and ultrasound studies of the heart). International journal of applied and fundamental research. 2016;11(2):260-263. (In Russ).
7. Smirnova O.M. Autoimmune latent diabetes mellitus in adults. Problems of endocrinology.2008; 54(2):3-7. (In Russ).
8. Mykhaylichenko V.Yu., Kubyshkin A.V., Samarin S.A. et al. Experimental induction of reparative morphogenesis and adaptive reserves in the ischemic myocardium using multipotent mesenchymal bone marrow-derived stem cells. Pathophysiology. 2016;2-10. http://dx.doi.org/10.1016j pathophys. 2016.04.002
