CC BY
26
© Полупанов А.С., Якушева Е.Н., 2007 УДК 616.379-008.64-085
ВОЗМОЖНОСТИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ
МЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ В
ЭКСПЕРИМЕНТЕ
А.С. Полупанов Е.Н. Якушева
Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова
В статье приводятся результаты исследования посвященного изучению влияния симвастатина и ловастатина на активность лизосомальных ферментов - катепсина Д, ДНКазы и ß-галактозидазы в миокарде и на содержание глюкозы крови при аллоксановом диабете. Показано, что при аллоксановом диабете в миокарде повышается неседиментированная активность ферментов на фоне снижения седиментированной. Статины приводят к уменьшению неседиментированной активности лизосомальных ферментов в миокарде и к снижению уровня глюкозы крови относительно уровня патологии.
Сахарный диабет является одним из наиболее распространенных заболеваний современного общества. Согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения, в разных странах мира сахарным диабетом страдает от 3% до 10% населения. Течение сахарного диабета осложняется поражениями сердечнососудистой системы, которые классифицируют как микроваскулярные (диабетическая нефропатия, потеря зрения, ампутации конечностей, центральная автономная и периферическая нейропатия) и макроваскулярные (инфаркт миокарда, инсульт, периферический атеросклероз) [12]. В связи с этим сахарный диабет занимает лидирующую позицию среди других социально значимых заболеваний. Большая частота сердечно-сосудистых осложнений связана с особенностями нарушения обмена веществ в организме при данной патологии. Помимо нарушения углеводного обмена при сахарном диабете серьезно страдает липидный и белковый обмен. Патология липидного обмена характеризуется изменением атерогенных свойств плазмы крови, то есть повышением уровня липопротеидов низкой и очень низкой плотности и триацилглицеридов и снижением содержания липопротеидов высокой плотности, что приводит к быстрому прогрессированию атеросклероза и развитию его осложнений [13]. Кроме того, сахарный диабет сопровождается значительной активацией перекисного окисления липидов, что также является важным патогенетическим звеном в развитии эндотелиальной дисфункции и повреждении клеточных мембран и, в конечном счете, прогрессировании сердечно-сосудистой патологии. Гипергликемия также оказывает неблагоприятное влияние на структурную целостность биомембран за счет гликозилирования белков, что в свою очередь способствует нарушению их функции и делает их более подверженными влиянию других неблагоприятных факторов. Одним из первых проявлений повреждения биологических мембран является реакция лизосомального аппарата клетки, которая
сопровождается выходом лизосомальных гидролаз за пределы органелл. В связи с этим представляет практический интерес поиск и применение при сахарном диабете лекарственных препаратов, которые могли бы нивелировать влияние основных патогенетических факторов вызывающих быстрое прогрессирование сердечно-сосудистой патологии.
В последнее время значительное место в терапии сахарного диабета занимают ингибиторы 3-гидрокси-3-метилглутирил-КоА редуктазы - статины. В проведенных многоцентровых рандомизированных плацебоконтролируемых исследованиях они доказали свою высокую эффективность, оказывая нормализующее действие на липидный спектр крови и снижая риск развития ишемической болезни сердца и ее осложнений (нестабильной стенокардии, инфаркта миокарда, внезапной коронарной смерти) в различных группах больных [3], в том числе и с сопутствующим сахарным диабетом [5,6]. Положительное влияние статинов имеет многогранный характер - помимо основного эффекта -ингибирования ключевого фермента синтеза холестерина статины имеют и ряд эффектов, механизм развития которых не связан с гиполипидемическим свойством препаратов. Это так называемые плейотропные эффекты.
Целью нашего исследования явилось установить влияние ингибиторов 3-гидрокси-3-метилглутирил-КоА редуктазы на активность лизосомальных ферментов - катепсина Д, ДНКазы и ß-галактозидазы в миокарде и на содержание глюкозы крови при аллоксановом диабете.
Материалы и методы
Исследование проводилось на 42 половозрелых нелинейных белых крысах самцах массой 150-220 г. Экспериментальный диабет у животных моделировали однократным внутримышечным введением 5% водного раствора аллоксана в дозе 125 мг/кг после их предварительного 24 часового голодания. Взятие крови из хвостовой вены проводили на 3-е сутки после инъекции аллоксана. В опыт брали животных с уровнем гликемии более 13 ммоль/л. Содержание глюкозы определяли глюкозооксидазным методом с использованием набора реактивов фирмы
LACHEMA, (Чехия). Препараты вводили внутрижелудочно ежедневно в течение 7 и 14 дней, начиная с первого дня развития патологии: симвастатин в дозе 24 мг/кг, ловастатин в дозе 20 мг/кг, контрольным животным вводили дистиллированную воду. На 7 и 14 день развития патологии животных эвтаназировали под эфирным наркозом. У крыс забирали сердце, орган отмывали в физиологическом растворе и гомогенизировали на холоду в гомогенизаторе Heidolph DIAX 900 (Германия) при 24000 об/мин в течение 60 сек в 0,25М растворе сахарозы, содержащем 1мМ ЭДТА. Затем гомогенат центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 10 минут при 4°С, осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость повторно центрифугировали при 20000 об/мин в течение 30 минут при 4°С. Осадок повторно ресуспендировали в
0,25М растворе сахарозы, содержащем 0,1% тритон XI00.
Активность ß-галактозидазы, катепсина Д и ДНК-азы определяли в надосадке (неседиментированная активность) и в осадке, содержащем лизосомы (седиментированная активность), спектрофотометрическим методом по гидролизу ß-D-галактопиранозида [4], гемоглобина [7] и ДНК [4] соответственно. Активность ß-галактозидазы выражали в нмоль n-нитрофенола/мг белка в минуту, катепсина Д - в нмоль тирозина/мг белка в минуту, ДНК-азы - в нмоль 5 АМФ/мг белка в
минуту. Результаты обработаны методом вариационной статистики с использованием 1-критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
В миокарде контрольной группы животных седиментированная активность Р-галактозидазы составила 0,02±0,003 нмоль п-нитрофенола/мг белка в минуту, ДНКазы 1,89±0,04 нмоль 5 АМФ/мг белка в минуту, катепсина Б 0,31±0,02 нмоль тирозина/мг белка в минуту, неседиментированная активность 0,18±0,03, 0,82±0,02 и 1,09±0,10 соответственно. Уровень глюкозы крови в контрольной группе составил 4,53±0,25 ммоль/л.
На 7 день развития аллоксанового диабета седименитрованная активность катепсина Д снизилась на 29,0%(р<0,01), ДНКазы на 41,3% (р<0,001);
неседиментированная активность Р-галактозидазы, ДНКазы и катепсина Д повысилась на 216,7%(р<0,001), 184,1 %(р<0,001) и 233,9% (р<0,001)
соответственно. Уровень глюкозы крови составил 22,60±0,99 ммоль/л и повысился на 398,9% (р<0,001) по сравнению с контрольными показателями.
На 14 день развития аллоксанового диабета седиментированная активность катепсина Б уменьшилась на 38,7% (р<0,05), ДНКазы на 50,8%(р<0,001). Неседиментированная активность Р-галактозидазы, ДНКазы, катепсина Б увеличилась на 227,8% (р<0,001), 212,2% (р<0,001) и 260,6% (р<0,001) соответственно. Содержание глюкозы составило 20,89±1,08 ммоль/л и повысилось относительно уровня контрольных животных на 361,2% (р<0,001).
Таблица 1.
Ферменты серии В-галактозидаза ДН] Каза катепсин Д
НСА СА НСА СА НСА СА
контроль 0,18±0,03 0,020±0,003 0,82±0,02 1,89±0,04 1,09±0,10 0,31±0,02
диабет 7 дней 0,57±0,04* 0,025±0,002 2,33±0,12* 1,11±0,09* 3,64±0,25* 0,22±0,01*
диабет 14 дней 0,59±0,04* 0,021±0,005 2,56±0,10* 0,93±0,07* 3,93±0,29* 0,19±0,03*
симвастатин 7 дн. 0,39±0,04 * ** 0,026±0,006 1,84±0,08 * ** 1,46±0,09 * ** 2,46±0,13 * ** 0,26±0,04
симвастатин 14 дн. 0,43±0,04 * ** 0,023±0,002 2,02±0,12 * ** 1,27±0,09 * ** 3,08±0,18 * ** 0,21±0,03*
ловастатин 7 дн. 0,31±0,02 * ** 0,030±0,008 1,78±0,08 * ** 1,39±0,08* 2,61±0,11 * ** 0,26±0,03
ловастатин 14 дн. 0,34±0,03 * ** 0,027±0,005 2,12±0,12 * ** 1,24±0,06 * ** 2,98±0,23 * ** 0,22±0,02*
Активность лизосомальных ферментов в миокарде в норме, при аллоксановом диабете и введении статинов на фоне диабета.
НСА - неседиментированная активность, СА - седиментированная активность * данные достоверны относительно контроля
данные достоверны относительно контроля диабета
Введение ловастатина курсом 7 дней на фоне аллоксанового диабета приводило к снижению неседиментированной активности ß-галактозидазы, ДНКазы и катепсина D, по сравнению с контролем патологии, на 45,6% (р<0,01), 23,6% (р<0,01) и 28,3% (р<0,01) соответственно. При применении симвастатина на 7 день исследования неседиментированная активность ß-галактозидазы, ДНКазы и катепсина D снизилась по сравнению с контролем диабета на 31,6% (р<0,05) , 21,0% (р<0,05) и 32,4 % (р<0,01) соответственно, седиментированная активность ДНКазы повысилась относительно контроля патологии на 31,5% (р<0,05). На 7 день введения обоих препаратов уровень гликемии достоверно от группы контроля патологии не отличался.
Курсовое применение ловастатина на 14 день развития аллоксанового диабета приводило к снижению неседиментированной активности ß-галактозидазы, ДНКазы и катепсина D, по сравнению с контролем патологии, на 42,4% (р<0,01), 17,2% (р<0,05) и 24,2% (р<0,05) соответственно, седиментированная активность ДНКазы повысилась на 33,3% (р<0,05) по сравнению с уровнем патологии. При 14 дневном назначении симвастатина на фоне экспериментального диабета неседиментированная активность ß-галактозидазы, ДНКазы и катепсина D снизилась на 27,1% (р<0,05) , 21,1% (р<0,05) и 21,6 % (р<0,05) соответственно, по отношению к контролю патологии, седиментированная активность ДНКазы повысилась на 36,6% (р<0,05) относительно показателей патологии.
При введении ловастатина на 14 день наблюдали снижение уровня глюкозы до 14,14±0,38 или на 32,3% (р<0,01) по сравнению с контролем патологии. Назначение симвастатина курсом 14 день сопровождалось уменьшением уровня глюкозы до 15,94±0,64 или на 23,7% (р<0,01) по сравнению с контролем диабета.
Таким образом, нами установлено, что при аллоксановом диабете происходит значительное повышение неседиментированной активности лизосомальных гидролаз, при одновременном снижении седиментированной активности. Эти данные характеризуют выраженное повреждение мембран лизосом, развившееся в результате негативного влияния аллоксанового диабета на обменные процессы в клетке. Кроме того, при аллоксановом диабете значительно активируются процессы перекисного окисления липидов, что также способствует дестабилизации мембран клеток и внутриклеточных органелл [1].
При введении статинов на фоне аллоксанового диабета наблюдается достоверное снижение неседиментированной активности лизосомальных ферментов относительно уровня патологии. Наблюдаемые изменения позволяют говорить о том, что статины оказывают мембранопротекторный эффект при аллоксановом диабете. Механизм развития подобного эффекта не связан с основным механизмом действия статинов, поскольку гиполипидемический эффект препаратов этой группы начинает реализовываться через 2 недели приема, и достигает максимума в течение месяца. Следовательно, данный эффект статинов является плейотропным. Статины обладают выраженным антиоксидантным действием, которое реализуется посредством ряда механизмов. Статины подавляют
экспрессию прооксидантных ферментативных систем и модулируют экспрессию ферментов и интермедиаторов с антиоксидантными свойствами [2]. Статины, подавляют оксидазную активность HAД H/HAД(Ф) Н-оксидаз и уменьшают продукцию свободных радикалов, через снижение образования нестероидных изопреноидов [8]. Aнтиоксидантный эффект статинов реализуется также через влияние на экспрессию Rho гуанозинтрифосфатазы. Гуанозинтрифосфатаза необходима для активации HAД(Ф)H-оксидазы. Ингибируя активность Rho гуанозинтрифосфатазы, статины приводят к подавлению HAД(Ф)H-оксидазной активности NO-синтазы со снижением продукции супероксид-анион радикала и повышением синтеза NO [10]. Кроме того, статины повышают активность антиоксидантных ферментов каталазы и параоксоназы, что так же способствует проявлению антиоксидантного эффекта [9].
Умеренное гипогликемическое действие статинов связано со способностью препаратов активировать ядерные PPAR рецепторы, которые напрямую участвуют в процессах обмена глюкозы. В эксперименте показано, что статины могут активировать PPAR. Их активация приводит к повышению чувствительности тканей к инсулину, что сопровождается снижением уровней глюкозы и липидов в сыворотке крови, как у экспериментальных животных, так и у больных сахарным диабетом. [11]
Выводы
При аллоксановом диабете в миокарде происходит повышение неседиментированной активности лизосомальных ДНКазы, катепсина Д, ß-галактозидазы и снижение седиментированной активности этих ферментов, что связано с дестабилизацией лизосомальных мембран.
Введение симвастатина и ловостатина курсами 7 и 14 дней на фоне экспериментального диабета способствует стабилизации лизосомальных мембран, что подтверждается снижением неседиментированной активности лизосомальных гидролаз в ткани миокарда.
Ловастатин и симвастатин обладают гипогликемическим действием при аллоксановом диабете при назначении курсом 14 дней, эффект более выражен у ловастатина.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гурина А.Е. Состояние цитоплазматических мембран при экспериментальном
сахарном диабете [Электронный ресурс] / А.Е. Гурина, С.Г. Дзугкаев -
Электрон. дан. - Режим доступа: www.diabet.ru/Sdiabet/1999-03/12.htm
2. Дриницина С.В. Антиоксидантные свойства статинов / С.В. Дриницина, Д.А. Затейщиков // Кардиология. - 2005. - №4. - с. 65-72.
3. Карпов Ю.А. Факторы риска ИБС: когда и как проводить коррекцию? Повышение роли статинов / Ю.А. Карпов, Е.В. Сорокин // Рус. мед. журнал. -2003. - №19. - С. 1041-1045.
4. Покровский А. А. Методы разделения и ферментной идентификации субклеточных фракций / А.А. Покровский, А.И. Арчаков, О.Н. Любимова // Современные методы в биохимии. - М., 1968. - С.5-59.
5. Сусеков А.В. Статины при лечении сахарного диабета типа 2 / А.В. Сусеков // Consilium medicum. - 2004. - №5. - C. 299-303.
6. Щербак А.В. Опыт клинического применения препарата Ловастатин - КМП в отделении общей эндокринной патологии городской эндокринологической больнице г. Киева (база кафедры эндокринологии) / А.В. Щербак, Д.В. Кириенко // Новости медицины и фармации. - 2004. - №15. - C. 23-24.
7. Anson ML. //J. Gen. Physiol. -1939. - V.22. -P. 79
8. Babior B.M. NADPH oxidase: an update / B.M. Babior // Blood. - 1999. - Vol. 93. -P. 1464-1476.
9. Cellular antioxidant effects of atorvastatin in vitro and in vivo / S.Wassmann [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. - 2002. - Vol. 22. - P. 300-305.
10. Gary M. Current molecular models for NADPH oxidase regulation bv Rac GTPase / M. Gary, A. Bokoch, A. Becky // Blood. - 2002. - Vol. 8. - P. 2692-2695.
11. Grip O. Atorvastatin activates PPARg and attenuates the inflammatory response in human monocytes / O. Grip, Jancianskiene S, Lindgren A. // Inflamm. Res. - 2002. -Vol. 51. - Р. 58-62.
12. Laakso M. Epidemiology of Diabetic Dyslipidemia / M. Laakso // Diabetes Rev. -1995. - Vol. 3. - P. 408-422.
13. Steiner G. The dyslipoproteinemias of diabetes / G. Steiner // Atherosclerosis. -1994. - Vol. 110 (Suppl.). - P. S27-S33.
THE POSSIBILITIES OF PHARMACOLOGICAL CORRECTION OF METABOLIC DISTURBANCE IN EXPERIMENTAL DIABETES MELLITUS
A.S. Polupanov, E.N. Yakusheva
The results of study devoted to simvastatin and lovastatin influence on the activity of lysosomic enzymes - Katepsin D, DNAase and galactosidase in myocardium and on the blood glucose in alloxan diabetes are presented in the article. Non-sedimentation enzyme activity is considered to increase in myocardium on the background of sedimentation decrease in alloxan diabetes. Statines lead to the decrease of non-sedimentation activity of lysosomic enzymes in miocardium and to the decrease of glucose level in blood as far as pathology level is considered.
