CC BY
95
© Полупанов А.С., Якушева Е.Н., 2010 УДК 615.275.015.44:616.379-008.64-092.9
ВЛИЯНИЕ СТАТИНОВ НА ПРОНИЦАЕМОСТЬ ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ МЕМБРАН ПРИ
АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ
А. С. Полупанов, Е.Н. Якушева
Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова
В статье показано, что при аллоксановом диабете у крыс повышается коэффициент лабильности мембран лизосом в печени и скелетной мышце. Ловастатин и симвастатин лабилизуют мембраны лизосом у интактных животных и стабилизируют их в исследуемых органах у крыс с аллоксановым диабетом.
Ключевые слова: аллоксановый диабет, эксперимент, статины, лизосомальные мембраны.
Статины - это гиполипидемические средства, которые реализуют свой основной эффект за счет ингибирования ключевого фермента синтеза холестерина 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА редуктазы [7]. В настоящее время статины занимают более 90% рынка антиатеросклеротических препаратов [5]. В многочисленных крупных исследованиях доказана их эффективность в предотвращении атеросклероза и снижение риска развития его осложнений [9]. Кроме того, статины значительно снижают кардиальную и общую смертность [1], в том числе и в группе больных сахарным диабетом. Однако применение статинов в ряде случаев сопровождается развитием нежелательных лекарственных реакций, среди которых гепатотоксичность [13], миопатия и рабдомиолиз [14] требуют мониторинга безопасности. Предполагается, что эти побочные эффекты могут быть связаны со способностью статинов подавлять образование естественного антиоксиданта - убихинона, который образуется из того же предшественника, что и холестерин. В результате происходит активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), что влечет за собой повреждение мембран клеток и внутриклеточных органелл, нарушает их структуру и проницаемость [6]. Органотоксичность статинов также связывают с ингибированием синтеза холестерина и метаболитов мевалоновой кислоты, что приводит к структурно-функциональным изменениям клеточных и субклеточных мембран, повышению их проницаемости для кальция с последующим нарушением метаболических процессов в митохондриях. [10].
За последнее время в противовес гипотезе активации ПОЛ накопилось большое количество данных, которые свидетельствуют о том, что статины обладают значительно выраженными антиоксидантными свойствами [3].
Известно, что лабилизация мембран лизосом характерна для патогенеза многих заболеваний, она также отражает повреждающее действие ряда лекарственных средств на субклеточном уровне.
В связи с вышеизложенным целью работы является изучить влияние статинов на проницаемость лизосомальных мембран в условиях аллоксанового диабета - патологии, основным патогенетическим звеном которой является резкая стимуляция процессов ПОЛ, приводящая к тяжелому повреждению мембран клеток и органелл.
Материалы и методы
Исследование проводилось на 77 половозрелых нелинейных белых крысах самцах массой 150-220 г. Экспериментальный диабет моделировали однократным внутримышечным введением 5% водного раствора аллоксана в дозе 125 мг/кг после их предварительного 24 часового голодания. Взятие крови из хвостовой вены проводили на 3-е сутки после инъекции аллоксана. В опыт брали животных с уровнем гликемии более 13 ммоль/л. Содержание глюкозы определяли глюкозооксидазным методом с использованием набора реактивов фирмы LA CHEMA (Чехия). Препараты вводили внутрижелудочно ежедневно в 18 часов в течение 7 и 14 дней, начиная с первого дня развития патологии: ловастатин в дозе 20 мг/кг, симвастатин в дозе 24 мг/кг, контрольным животным вводили дистиллированную воду. На 7 и 14 день развития патологии животных эвтаназировали под эфирным наркозом. У крыс забирали печень и бедренную мышцу, органы отмывали в физиологическом растворе и гомогенизировали на холоду в гомогенизаторе Heidolph DIAX 900 (Германия) при 24000 об/мин в течение 60 сек в 0,25М растворе сахарозы,
Таблица 1
Коэффициент лабильности лизосомальных мембран для катепсина Д, ß-галактозидазы и .nH^^bi в печени и скелетной мышце в норме, при введении статинов, при аллоксановом диабете и введении статинов
на фоне диабета.
содержащем 1мМ ЭДТА. Затем гомогенат центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 10 минут при 4°С, осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость повторно центрифугировали при 20000 об/мин в течение 30 минут при 4°С. Осадок повторно ресуспендировали в 0,25М растворе сахарозы, содержащем 0,1% тритон Х100.
Активность Р-галактозидазы, катепсина Д и ДНК-азы определяли в надосадке (неседиментируемая активность) и в осадке, содержащем лизосомы (седиментируемая активность), спектрофотометрическим методом по гидролизу Р-Б-галактопиранозида [8], гемоглобина [11] и ДНК [8] соответственно. Активность Р-галактозидазы выражали в нмоль п-нитрофенола/мг белка в минуту, катепсина Д - в нмоль тирозина/мг белка в минуту, ДНК-азы - в нмоль 5 АМФ/мг белка в минуту. Коэффициент лабильности (КЛ) рассчитывали как отношение неседиментируемой активности к общей. Результаты обработаны методом вариационной статистики с использованием 1-критерия Стьюдента.
Результаты и их обсуждение КЛ лизосомальных мембран для катепсина Д, Р-галактозидазы и ДНК-азы в печени и скелетной мышце животных контрольной группы представлены в таблице 1.
На 7 сутки развития аллоксанового диабета КЛ для катепсина Д, Р-галактозидазы и ДНК-азы в печени повысился на 47,5% (р<0,001), 36,1% (р<0,001) и 100,0% (р<0,001) соответственно. В скелетной мышце отмечалось повышение КЛ для катепсина Д на 49,0% (р<0,001) и для ДНК-азы на 100,0% (р<0,001). На 14 сутки развития аллоксанового диабета наблюдаемые изменения приобрели еще более выраженный характер. Так, КЛ в печени для катепсина Д увеличился на 50,8% (р<0,001), для Р-галактозидазы на 49,2%
Катепсин Д ß-галактозидаза ДЖ^-аза
Контрольная группа печень Q,59±Q,Q1 Q,61±Q,Q3 Q,36±Q,Q1
мышца Q,51±Q,Q1 Q,978±Q,QQ3 Q,4Q±Q,Q2
Диабет 7 сутки печень Q,87±Q,Q1* Q,83±Q,Q1* Q,72±Q,Q2*
мышца Q,76±Q,Q1* Q,982±Q,QQ3 Q,8Q±Q,Q1*
Диабет 14 сутки печень Q,89±Q,Q* 1 Q,91±Q,Q1* Q,77±Q,Q1*
мышца Q,81±Q,Q2* Q,986±Q,QQ2 Q,84±Q,Q1*
Ловастатин 7 сутки печень Q,63±Q,Q4 Q,69±Q,Q3 Q,4Q±Q,Q1
мышца Q,55±Q,Q3 Q,971±Q,Q1 Q,42±Q,Q2
Ловастатин 14 сутки печень Q,66±Q,Q1* Q,86±Q,Q4* Q,43±Q,Q1*
мышца Q,61±Q,Q2* Q,979±Q,Q1 Q,46±Q,Q2
Симвастатин 7 сутки печень Q,62±Q,Q1 Q,62±Q,Q1 Q,38±Q,Q1
мышца Q,58±Q,Q1* Q,978±Q,QQ2 Q,42±Q,Q3
Симвастатин 14 сутки печень Q,65±Q,Q1* Q,66±Q,Q2 Q,4Q±Q,Q3
мышца Q,6Q±Q,Q3* Q,981±Q,QQ3 Q,48±Q,Q1*
Диабет + ловастатин 7 сутки печень Q,82±Q,Q1* Q,74±Q,Q1* ** Q,63±Q,Q1* **
мышца Q,7Q±Q,Q2* ** Q,969±Q,Q1Q Q,71±Q,Q2* **
Диабет + ловастатин 14 сутки печень Q,86±Q,Q1* ** Q,88±Q,Q1* ** Q,69±Q,Q2* **
мышца Q,72±Q,Q2* ** Q,985±Q,QQ3 Q,77±Q,Q3* **
Диабет + симвастатин 7 сутки печень Q,8Q±Q,Q1* ** Q,74±Q,Q1* ** Q,58±Q,Q2* **
мышца Q,67±Q,Q1* ** Q,978±Q,QQ5 Q,68±Q,Q2* **
Диабет + симвастатин 14 сутки печень Q,84±Q,Q1* ** Q,83±Q,Q1* ** Q,67±Q,Q1* **
мышца Q,7Q±Q,Q3* ** Q,972±Q,QQ2 Q,74±Q,Q3* **
* данные достоверны относительно контроля ** данные достоверны относительно контроля диабета
и для ДЖ^-азы на 113,9% (р^^!). В скелетной мышце КЛ для катепсина Д и ДЖ^-азы вырос на 58,8% и 11Q,Q% соответственно.
Введение ловастатина курсом 7 дней не сопровождалось существенным изменением состояния лизосомальных мембран в исследуемых органах. ^ 14 сутки курсового применения ловастатина КЛ для катепсина Д, ß-галактозидазы и ДHК-азы в печени повысился соответственно на 11,9% (р^^), 37,7% (р^^) и 19,4% (р^^). В скелетной мышце отмечалось увеличение КЛ для катепсина Д на 19,6% (р^^).
Семидневное курсовое введение симвастатина вызывало достоверное возрастание на 13,7% (р^^) КЛ для катепсина Д в скелетной мышце. При введении симвастатина курсом 14 дней наблюдалось повышение КЛ для катепсина Д в печени на 1Q,2% (р^^). В скелетной мышце КЛ увеличился для катепсина Д и ДHК-азы на 17,6% (р^^), 2Q,Q% (р^^) соответственно.
Курсовое 7 дневное применение ловастатина на фоне аллоксанового диабета приводило, по сравнению с контролем патологии, к снижению КЛ в печени для ß-галактозидазы и ДHК-азы на 1Q,8% и 12,5% (р^^), в скелетной мышце для катепсина Д на 7,9% ^<Q,Q5) и ДЖ^-азы
на 11,3% (р^^) соответственно. При 14 дневном назначении ловастатина животным с экспериментальным диабетом КЛ в печени уменьшился по отношению к контролю патологии для катепсина Д, ß-галактозидазы и ДЖ^-азы на 3,4% (р^^), 3,3% (р^^) и 1Q,4% (р^^) соответственно. В скелетной мышце отмечалось снижение КЛ по сравнению с контролем патологии для катепсина Д на 11,1% fa<Q,Q5) и ДЖ^-азы на 8,3% (р^^).
Введение симвастатина курсом 7 дней при аллоксановом диабете приводило, относительно контроля патологии, к снижению КЛ для катепсина Д, ß-галактозидазы и ДHК-азы на 8,Q% (р^ДО^, 1Q,8% (р<Q,QQ1) и 19,4% (р^^). КЛ в скелетной мышце уменьшился по сравнению с контролем патологии для катепсина Д на 11,8% (р^^) и для ДЖ^-азы на 15,Q% (р^^). Курсовое применение симвастатина на 14 сутки развития экспериментального диабета характеризовалось понижением КЛ относительно контроля патологии в печени для катепсина Д на
5,6% (р<0,01), для ß-галактозидазы на 8,8% (р<0,01), для ДНК-азы на 13,0% (р<0,01). В скелетной мышце отмечалось снижение КЛ по сравнению с контролем патологии для катепсина Д на 13,6% (р<0,05) и ДНК-азы на 11,9% (р<0,01).
Следует отметить, что при использовании ловастатина и симвастатина на фоне аллоксанового диабета нормализации КЛ для исследуемых ферментов не отмечалось во все сроки эксперимента.
Таким образом, установлено, что при аллоксановом диабете в печени и скелетной мышце происходит значительная лабилизация мембран лизосом, что доказывает повышение КЛ для катепсина Д, ß-галактозидазы и ДНК-азы. Выраженное повреждение мембран лизосом, вероятно развивается в результате дефицита инсулина, оказывающего ингибирующее действие на активность лизосомальных ферментов и индукции процессов ПОЛ из-за генерации активных форм кислорода [2].
Повышение КЛ лизосомальных мембран в печени и скелетной мышце при использовании статинов у интактных крыс обусловлено, видимо, потенциальным цитотоксическим действием препаратов и особенностями их распределения. Одной из вероятных причин их влияния на мембраны может быть блокада синтеза убихинона, что инициирует активацию ПОЛ [4, 6]. Причиной органотоксичности статинов также считается нарушение синтеза холестерина и производных мевалоновой кислоты (фарнезол, геранилгераноил и др.), являющихся структурными компонентами мембран. Изменение соотношения холестерин/фосфолипиды существенно влияет на стабильность мембран лизосом. Показано, что под действием статинов это соотношение, а следовательно и свойства мембран меняются [4]. Структурно-функциональные изменения клеточных и субклеточных мембран вызывают повышение их проницаемости для кальция, что опосредует усиленное сокращение миофибрилл и нарушение метаболических процессов в митохондриях [10]. Имеются данные, что способность статинов вызывать миопатию может быть также связана с их повреждающим действием на хлорные каналы [4].
При введении статинов на фоне аллоксанового диабета наблюдается достоверное снижение КЛ лизосомальных мембран относительно уровня патологии. Полученные данные позволяют считать, что статины оказывают мембранопротективный эффект при экспериментальном диабете. Мембраностабилизирующие свойства статинов могут быть связаны активацией ферментативного и неферментативного звеньев антиоксидантной защиты. Статины подавляют экспрессию прооксидантных ферментативных систем и модулируют экспрессию ферментов и интермедиаторов с антиоксидантными свойствами [3], угнетают оксидазную активность НАДН/НАД(Ф) Н-оксидаз, тем самым снижая образование свободных радикалов [12]. Повышая экспрессию Rho гуанозинтрифосфатазы, статины ингибируют НАД(Ф) Н-оксидазную активность NO-синтазы со снижением продукции супероксиданионрадикала и повышением синтеза NO [12]. Проявлению антиоксидантного эффекта статинов способствует также стимуляция активности антиоксидантных ферментов каталазы, параоксоназы [3]. Выраженность антиоксидантного действия статинов пропорциональна степени пероксидации [15].
Выводы
1. Курсовое применение ловастатина (в дозе 20 мг/кг) и симвастатина (в дозе 24 мг/кг) у интактных крыс вызывает увеличение коэффициента лабильности для катепсина Д, ß-галактозидазы и ДНКазы в печени и скелетной мышце крыс, что является показателем повреждающего действия препаратов на данные органы.
2. При аллоксановом диабете наблюдается нарастающая дестабилизация мембран лизосом, которая проявляется значительным повышением коэффициента лабильности для катепсина Д, ß-галактозидазы и ДНКазы в печени и скелетной мышце крыс.
3. Курсовое назначение ловастатина (в дозе 20 мг/кг) и симвастатина (в дозе 24 мг/кг) при аллоксановом диабете вызывает снижение коэффициента лабильности изучаемых ферментов, что характеризует стабилизацию лизосомальных мембран в печени и скелетной мышце крыс.
4. Ловастатин и симвастатин в одинаковой степени лабилизируют мембраны лизосом в печени и скелетной мышце у интактных животных и стабилизируют их у крыс с аллоксановым диабетом.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аронов Д.М. Кардиостабилизация больных ишемической болезнью сердца: рецепт для России
/ Д.М. Аронов // Лечащий врач . - 2007. - № 3. - С. 22-26.
2. Гурина А.Е. Состояние цитоплазматических мембран при экспериментальном сахарном
диабете: [Электронный ресурс] / А.Е. Гурина, С.Г. Дзугкаев. - Электрон. дан. - Режим
доступа: www.diabet.ru/Sdiabet/1999-03/12.htm
3. Дриницина С.В. Антиоксидантные свойства статинов / С.В. Дриницина, Д.А. Затейщиков // Кардиология. - 2005. - №4. - С. 65-72.
4. Затейщиков Д. А. Проблемы безопасности статинов / Д. А. Затейщиков // Фарматека. - 2005. -№8.- С.63-72.
5. Красницкий В.Б. Вторичная профилактика ишемической болезни сердца: сочетание
медикаментозной терапии и физических тренировок / В.Б. Красницкий // Лечащий врач . -2007. - № 3. - С. 32-36.
6. Ланкин В.З. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях / В.З. Ланкин, А.К. Тизазе, Ю. Н. Беленков. - М., 2001. - 78 с.
7. Метелица В.И. Справочник по клинической фармакологии сердечно-сосудистых лекарственных средств / В.И. Метелица. - М.: Медпрактика, 1996. - 784c.
8. Покровский А. А. Методы разделения и ферментной идентификации субклеточных фракций / А.А. Покровский, А.И. Арчаков, О.Н. Любимова // Современные методы в биохимии. - М., 1968. - С.5-59.
9. Сорокин Е.В. Современные подходы к лечению артериальной гипертонии и ишемической болезни сердца / Е.В. Сорокин // Кардиология . - 2006. - № 4. - С. 81-84.
10. Ушкалова Е.А. Миопатии и рабдомиолиз при применении гипохолестеринемических препаратов / Е.А. Ушкалова // Фарматека. - 2002. - №7-8.- С. 74-80
11. Anson ML. // J. Gen. Physiol. -1939. - Vol.22. - P. 79.
12. Babior B.M. NADPH oxidase: an update / B.M. Babior // Blood. - 1999. - Vol. 93. - P. 1464-1476.
13. Expanded Clinical Evaluation of Lovastatin (EXCEL) study results. I. Efficacy in modifying plasma lipoproteins and adverse event profile in 8245 patients with moderate hypercholesterolemia / R.H. Bradford [et al.] // Arch. Intern. Med. - 1991. -Vol. 151. - P. 43-49.
14. Gaist D. Lipid-lowering drugs and risk of myopathy: a population-based follow-up study / D. Gaist, J. Chang, I. Green // Epidemiology. - 2001. - Vol. 12. - P. 565-569.
15. MacNee W. Treatment of stable COPD: antyoxydant / W. MacNee // Eur. Respir. Rev. - 2005. -Vol.14,№94. - P. 12-22.
EFFECTS OF STATINES ON LYSOSOMAL MEMBRANES PERMEABILITY IN ALLOXAN DIABETES
A.S.Polupanov, E.N.Yakusheva
Paper shows that alloxan diabetes in rats increases labilisation coefficient of lysosomal membranes in liver and skeletal muscle. Lovastatin and simvastatin labilase lysosomal membranes in normal rats and stabilase lysosomal membranes in investigated organs of rats with alloxan diabetes.
Key words: alloxan diabetes, experiment, statins, lysosomal membrane
Якушева Е.Н. - доцент, канд.мед. наук, доцент кафедры фармакологии с курсом фармакотерапии ГОУ ВПО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Росздрава; root@,ryazgmu.ryazan.ru
Полупанов А. С. - ассистент кафедры фармакологии с курсом фармакотерапии ГОУ ВПО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Росздрава; [email protected]
