CC BY
53
© Артамонова А.А., 2004
УДК: 615.27.015.43:577.152]:616.441-008.61-092.9
ВЛИЯНИЕ КАРНИТИНА НА АКТИВНОСТЬ ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ ГИДРОЛАЗ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПЕРТИРЕОЗЕ
А.А. Артамонова
Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова
Изучено изменение активности лизосомальных гидролаз (катепсина Д, ДНКазы, Р-галактозидазы) при экспериментальном гипертиреозе у крыс, вызванном Ь-тироксином, и возможности его коррекции назначением карнитина курсами по 10 и 20 дней. Установлено, что карнитин способствует нормализации активности лизосомальных гидролаз в сердечной и скелетных мышцах, что, по-видимому, обусловлено мембраностабилизирующим действием препарата, а также восстановлению уровня кардиоспецифической креатинкиназы сыворотки крови. При этом коррекции уровня тиреоидных гормонов не наблюдалось.
Избыток тиреоидных гормонов вызывает патологические изменения во многих органах и системах. Известно, что поражение сердечно-сосудистой системы является характерным для ги-пертиреоза. Тиреоидные гормоны, действуя на сердечную мышцу, нарушают внутриклеточные процессы, такие как сопряжение дыхания и окислительного фосфорилирования, проницаемость
мембран митохондрий [1]. Происходящая под влиянием тиреоидных гормонов перестройка внутриклеточных структур и, в частности, изменение изоферментного состава миозина ведут к снижению энергетического обеспечения сократительной функции сердечной мышцы [5].
Лизосомальные ферменты участвуют в развитии метаболических нарушений при повреждении миокарда, и в некоторой степени могут отражать степень выраженности патологических процессов. Лабилизация мембран лизо-сом под воздействием неблагоприятных факторов, например, ишемии, вызывает
быстрый выход гидролаз из клеток [4]. Это ведет к усиленному лизису кардио-миоцитов и их деструкции.
В регуляции сократительной деятельности сердечной мышцы в норме и при патологии важное место отводится креатинкиназной ферментной системе, обеспечивающей внутриклеточный транспорт энергии от мест ее образования к миофибриллам [3]. В свою очередь кардиоспецифическая креатинки-наза сыворотки крови является одним из наиболее чувствительных показателей состояния сердечной мышцы.
Карнитин обладает анаболическим и мембраностабилизирующим действием, участвуя в транспорте жирных кислот, способных разобщать дыхание и окислительное фосфорилирование, является средством, повышающим энергетический потенциал миокарда. Установлено кардиопротекторное действие карнитина при экспериментальном инфаркте миокарда на примере изменения активности кардиоспецифической креа-тинкиназы сыворотки крови [6]. Выяв-
лено положительное влияние карнитина на активность катепсина Д при некроти-зирующей дистрофии миокарда [2]. Известны данные о том, что карнитин ингибирует действие тироксина, и между обменом карнитина и тиреоидными гормонами существует обратная корреляция [8]. Отсюда, интересен анализ взаимосвязи между динамикой активности лизосомальных ферментов и уровнем тиреоидных гормонов и возможности коррекции полученных изменений карнитином.
Целью настоящего исследования явилась оценка влияния карнитина на активность лизосомальных гидролаз (катепсина Д, ДНКазы, р-галактоз-идазы) и уровень кардиоспецифической креатинкиназы сыворотки крови при экспериментальном гипертиреозе, подтвержденном содержанием тироксина, трийодтиронина и тиреотропина.
Материалы и методы
Работа выполнена на 32 половозрелых белых нелинейных крысах-самках, синхронизированных по фазам эстраль-ного цикла, массой 150-170 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. Гипертиреоз вызывали введением L-тироксина (Берлин Хеми) внутрибрюшин-но в дозе 50 мкг/кг массы 1 раз в сутки в течение 10 дней. Контрольной группе вводили внутрибрюшинно растворитель (0,02М раствор NaOH) и дистиллированную воду внутрь.
Экспериментальным группам животных карнитина хлорид вводили перорально в дозе 25 мг/кг в течение 20 дней (10 из которых до введения тироксина и 10 дней наряду с тироксином).
В опыт брали по 8 животных. Эвтаназию проводили под эфирным наркозом. Плазму крови для РИА-определения гормонов и исследования активности креатинфосфокиназы получали после 10-
минутного центрифугирования при 3000 об/мин.
Креатинкиназу фракции МВ определяли спектрофотометрически на биохимическом анализаторе Humalyzer 2000 с использованием жидкого реагента на креатинкиназу МВ фирмы Human (Германия) при 340 нм. Активность фермента выражали в U / L.
Содержание тироксина, трийодти-ронина и тиреотропина измеряли радио-иммунологическим методом с использованием стандартных тест-систем на основе J125 (производство «Immunotech» Чехия) с дальнейшей обработкой полученных результатов на анализаторе «Иммунотест» (Москва) в ЦНИЛ Ряз-ГМУ.
Для определения активности лизо-сомальных ферментов сердце, отмытое в физиологическом растворе, а также печень и скелетную мышцу (взятую из области бедра) измельчали и гомогенизировали на холоду в гомогенизаторе типа Поттера-Эльвейма с тефлоновым пестиком при 1200 об/мин в течение 60 сек в
0,25М растворе сахарозы, содержащем 1мМ ЭДТА. Отношение массы органа к объему среды выделения составляло 1 : 10. Для отделения в полученном гомогенате ядер и неразрушенных при гомогенизации клеток его центрифугировали 10 минут при 1000 g и температуре 4°С. Для отделения митохондриальной фракции, содержащей и лизосомы, супернатант 1 подвергали дополнительному центрифугированию в течение 30 минут при 20000 об/мин. После отделения супернатанта 2 осадок ресуспендировали в равном по объему исходной среде выделения 0,25М растворе сахарозы, содержащем 0,1% тритон Х100 (седимен-тируемая активность). В супернатанте 2 определяли неседиментируемую активность лизосомальных ферментов.
Активность катепсина Д оценивали
спектрофотометрически по степени гидролиза гемоглобина методом, описанным Anson [7]. Активность фермента выражали в нМ тирозина / мг белка в минуту.
Для определения активности ДНКазы использовали метод, предложенный Покровским А.А. с соавторами. Активность фермента выражали в нМ 5 АМФ / мг белка в минуту.
Об активности р-галактозидазы судили по степени гидролиза n-нитро-фенилгалактопиранозида. Активность выражали в нМ нитрофенола / мг белка в минуту. Белок определяли микробиуре-товым методом.
Результаты статистической обработки полученных данных представлены в следующий формате: медиана (нижний квартиль; верхний квартиль). Для проверки статистических гипотез о степени различия двух несвязанных выборок с отличным от нормального распределением использовался непараметрический критерий Манна-Уитни.
Результаты и их обсуждение
При курсовом введении L-тироксина интактным животным уровень этого гормона в крови возрос в 4 раза, уровень трийодтиронина увеличился в 1,45 раза, при этом наблюдалось снижение содержания тиреотропного гормона в 3,6 раза, что указывает на развитие гиперти-реоза (табл. 2). Активность креатинкина-зы фракции МВ увеличилась на 136,5% по отношению к контролю, что свидетельствует о развитии патологии сердечной мышцы (табл.3). В скелетных мышцах и миокарде наблюдалось достоверное повышение неседиментируемой активности катепсина Д на 102% и на 233% соответственно (p<0,010), ДНКазы
- на 326,4% и 509% (p<0,010),
Р-галактозидазы на 92% и 230,4% (p<0,010). Седиментируемая активность
катепсина Д при этом возрастала в скелетных мышцах на 145,2% (p<0,010), в миокарде на 183% (p<0,010), ДНКазы на 57,7% (p<0,010) и 1,4% (p>0,050) и Р-галактозидазы на 260% (p<0,010) и 51,4% (p<0,010) соответственно. Седи-ментируемая и неседиментируемая активность всех трех ферментов в печени изменялась незначительно. Полученные результаты свидетельствуют о нарушении целостности лизосомальных мембран и массивном выходе гидролаз из лизосом в клетках миокарда и скелетных мышц.
После курсового применения кар-нитина наблюдались следующие изменения: активность креатинкиназы МВ сыворотки крови восстановилась до значений, близких к контролю (разница статистически не значима) (табл. 3). Несе-диментируемая активность катепсина Д, ДНКазы и р-галактозидазы в скелетных мышцах и миокарде снизилась до значений, близких к контрольным, причем при 20-дневном применении препарата изменения более выраженные при оценке активности р-галактозидазы в скелетных мышцах и миокарде и катепсина Д в сердечной мышце (табл. 1). Седименти-руемая активность при этом снижалась незначительно. Полученные результаты указывают на мембраностабилизирующее действие карнитина, что соответствует данным других исследователей [2, 6]. Мембраностабилизирующее действие карнитина может быть обусловлено его способностью к утилизации длинноцепочечных жирных кислот, которые оказывают кардиотоксическое действие при их накоплении, и снижению соотношения цАМФ/цГМФ [2]. Необходимо отметить, что уровень тиреоидных гормонов после проведенной терапии не нормализовался - изменения концентрации тироксина, трийодтиронина и тиреотро-пина статистически не значимы (табл. 2).
Таблица 1
Изменение активности катепсина Д, ДНКазы и р-галактозидазы в скелетных мышцах и миокарде эутиреоидных и гипертиреоидных крыс, а также после лечения карнитином в течение 10 и 20 дней
Условия эксперимента катепсин Д ДНКаза Р-галактозидаза
НСА СА НСА СА НСА СА
сердце Контроль п=8 мышцы 1,01 (0,69; 1,34) 0,31 (0,15; 0,49) 0,53 (0,46; 0,53) 1,40 (1,29; 1,42) 0,23 (0,15; 0,31) 0,070 (0,059; 0,086)
0,88 (0,78; 0,96) 0,85 (0,80; 1,12) 0,41 (0,29; 0,61) 0,71 (0,52; 0,94) 0,85 (0,73; 0,95) 0,010 (0,008; 0,013)
сердце Ь-тироксин 10дней п=8 мышцы 3,37 (2,59; 4,65) * 0,76 (0,59; 0,99) * 2,26 (1,92; 2,61) * 1,42 (1,30; 1,53) 0,76 (0,73; 0,83) * 0,106 (0,081; 0,123) *
1,78 (1,56; 1,82) * 2,41 (1,78; 3,13)* 2,50 (2,37; 2,89) * 1,12 (1,12; 1,37) * 1,63 (1,31; 2,00) * 0,036 (0,019; 0,054) *
сердце Ь-тироксин 10дней+ карни-тин 10дней п=8 мышцы 1,64 (1,46; 1,75) ** 0,67 (0,61; 0,75) 0,72 (0,55; 0,79) ** 0,81 (0,64; 0,91) ** 0,24 (0,22; 0,27) ** 0,084 (0,073; 0,108)
1,32 (1,21; 1,45) ** 0,97 (0,70; 1,06) ** 0,66 (0,47; 0,82) ** 0,92 (0,67; 1,08) 0,79 (0,67; 0,88) 0,047 (0,041; 0,066)
сердце Ь-тироксин 10дней + карнитин 20дней п=8 мышцы 1,44 (1,27; 1,61) ** 1,16 (0,81; 1,38) 0,92 (0,82; 1,17) ** 1,11 (1,07; 1,51) 0,203 (0,153; 0,256) ** 0,054 (0,043; 0,075) **
1,27 (1,12; 1,31) ** 1,04 (0,92; 1,15) ** 0,070 (0,043; 0,100) ** 0,61 (0,51; 0,78) ** 0,446 (0,425; 0,459) ** 0,060 (0,059; 0,065)
Примечание: НСА - неседиментируемая активность, СА - седиментируемая активность. Активность ферментов выражена в нМоль/ мг белка в минуту.
* - статистическая значимость отмечена в сравнении с контролем - р<0,010.
** - статистическая значимость отмечена в сравнении с серией экспериментального гипертиреоза - р<0,050.
Таблица 2
Изменение уровня тироксина, трийодтиронина и тиреотропина сыворотки крови после курсового введения Ь-тироксина и на фоне терапии карнитином в течение 10
и 20 дней
Условия эксперимента Содержание, нмоль/л Содержание, мМЕ/мл
Т3 Т4 ТТГ
Контроль п=8 0,96 (0,84; 1,12) 43,53 (38,07; 50,54) 0,53 (0,28; 0,78)
Ь-тироксин 10дней п=8 1,39 (1,23; 1,62) * 176,26 (162,79;192,08)* 0,135 (0,108; 0,213) *
Ь-тироксин 10дней + карнитин 10дней п=8 1,04 (0,82; 1,23) 199,23 (180,16; 225,73) 0,115 (0,107; 0,147)
Ь-тироксин 10дней + карнитин 20дней п=8 0,89 (0,73; 1,06) 199,28 (181,66; 213,75) 0,100 (0,077; 0,110)
Примечание: * - статистическая значимость отмечена в сравнении с контролем р<0,010.
Таблица 3
Изменение уровня креатинкиназы сыворотки крови после курсового введения Ь-тироксина и на фоне терапии карнитином в течение 10 и 20 дней
Условия эксперимента Контроль п=8 Ь-тироксин 10дней п=8 Ь-тироксин 10дней + карнитин 10дней п=8 Ь-тироксин 10дней + карнитин 20дней п=8
Содержание креатинкиназы, и/Ь 4368 (3960,5; 4603,5) 10317 (6899; 10381)* 4766 (3554,5; 5141)** 2769 (2398,5; 3245,5) **
Примечание: * - статистическая значимость отмечена в сравнении с контролем
- р < 0,011.
** - статистическая значимость отмечена в сравнении с серией экспериментального гипертиреоза - р <0,011.
Это дает основания предполагать, что действие карнитина не связано с прямым влиянием на гормоны щитовидной железы, и подтверждает мем-
браностабилизирующий механизм действия препарата. Ранее предполагалось, что карнитин ингибирует действие тироксина, и между обменом карнитина и
тиреоидными гормонами существует обратная корреляция [8]. Возможно, что данная связь существует при физиологической регуляции метаболических процессов и нарушается при развитии патологии щитовидной железы.
Выводы
1. Тироксин в дозе 50 мкг/кг, применяемый в течение 10 дней, вызывает гипертиреоз, подтвержденный динамикой уровня тиреоидных гормонов, и выраженные патологические изменения в сердечной и скелетных мышцах по показателям кардиоспецифического фермента креатинкиназы крови и активности лизосомальных гидролаз (преимущественно неседиментируемой).
2. Назначение карнитина в дозе 25 мг/кг в сутки курсами 10 и 20 дней нормализует показатели креатин-киназы крови и активности лизосо-мальных ферментов, более эффективно при 20-дневном применении.
3. Карнитин в исследуемой дозе не оказывает прямого воздействия на уровень тиреоидных гормонов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Балаболкин М.И. Эндокринология / М.И. Балаболкин. - М., 1998.
2. Кременецкая Т.В. Воздействие карнитина и инсулина на активность лизосо-мальных ферментов при некротизи-рующей дистрофии миокарда / Т.В. Кременецкая // Вопросы клиники, диагностики и коррекции физического состояния организма. - Рязань, 1996. - С. 44-49.
3. Макарова В.Г. Действие карнитина и ретаболила на активность ферментов креатинкиназной системы сердца крыс /
В.Г. Макарова, Е.А. Строев // Кардиология. - 1985. - Т.25, №8. - С.96-97.
4. Макарова В.Г. Активность лизосомаль-ных ферментов при ИБС / В.Г. Макарова, Е.А. Строев, А.В. Бороздин // ИБС и артериальные гипертензии: Сб. науч. тр.
- Рязань, 1992. - С. 75-79.
5. Моркин Е. Влияние гормонов на работу сердца / Е. Моркин // Физиология и патофизиология сердца / Под ред. Н. Спе-релакиса. - М., 1990. - Т.2. - С. 275-291.
6. Янсон Т.М. Изучение кардиопротек-торного действия карнитина и его синтетического аналога 3-(2,2,2-триметил-гидразиний) пропионата при экспериментальном инфаркте миокарда у крыс / Т.М. Янсон, Н.П. Бауман, Н. Гром // Вопр. мед. химии. - 1988. - Т.34, вып.4.
- С.122-124.
7. Anson M.L. // J. Gen. Physiol. - 1939. -V.22. - P.79.
8. Bartol R. Carnitine and endocrine disorders / R. Bartol // Rew. nout mid. Sir. Endocrinol. - 1981. - V.19, N4. - P. 269270.
INFLUENCE OF CARNITINE ON THE ACTIVITY OF LYSOSOMAL ENZYMES IN
HYPERTHYROIDISM
A.A. Artamonova
The influence of carnitine on the activity of lysosomal enzymes in hyperthyroidism caused by L-thyroxin in dose 50mkg/kg was experimentally studied. It was found that administration of L-thyroxin leads to increasing of thyroid hormones level, creatincinasa MB activity in blood and lysosomal enzymes activity in myocardium and skeleton muscles. Treating with carnitine in dose 25 mg/kg normalizes the activity of enzymes, however does not influence on thyroid hormones level. Thus it can be supposed, that cardio protective effect of carnitine does not correlate with straight action on thyroid hormones, and it proves membrane-stabilizing effect of carnitine.
