СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ РОССИЙСКИХ ВПЧ-ТЕСТОВ НА ОСНОВЕ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВПЧ ВЫСОКОГО КАНЦЕРОГЕННОГО РИСКА В ПРОГРАММАХ ЦЕРВИКАЛЬНОГО СКРИНИНГА Текст научной статьи по специальности «Медицинские технологии»

#/

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ РОССИЙСКИХ ВПЧ-ТЕСТОВ НА ОСНОВЕ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВПЧ ВЫСОКОГО КАНЦЕРОГЕННОГО РИСКА В ПРОГРАММАХ ЦЕРВИКАЛЬНОГО СКРИНИНГА

/

О.Ю. Шипулина , i-i.o. аирамюва , л.и. иирилсп rvUuu

1 АО «ЛабКвест»

2 Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. H.H. Блохипа

Адрес для переписки:

Шипулина Ольга Юрьевна, olga1504@mail.ru

Для цитирования:

Шипулина О.Ю., Абрамова М.С., Короленкова Л.И. Сравнительный анализ эффективности российских ВПЧ-тестов на основе ПЦР в реальном времени для выявления ВПЧ высокого канцерогенного риска в программах цервикального скрининга. Вопросы практической кольпоскопии. Генитальные инфекции. 2022; (3): 26-32.

Ключевые слова:

вирус папилломы человека высокого канцерогенного риска, ВПЧ-тест, цервикальный скрининг, интеграция ВПЧ, предрак и рак шейки матки

DOI: 10.46393/27826392_2022_3_26

Аннотация

Цель исследования: провести сравнительные испытания российских ВПЧ-тестов для организованного скрининга и профилактических осмотров, оценить диагностические и технические характеристики наборов в условиях скрининга. Материал и методы. В работе использовались наборы реагентов (НР) для определения вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого канцерогенного риска четырех российских производителей: «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-FL», «Ампли-Сенс ВПЧ ВКР скрин-титр-14-FL» и «АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип-титр-FL» (ФБУН «ЦНИИЭ»), «АмплиПрайм ВПЧ ВКР 14» и «АмплиПрайм ВПЧ ВКР 14 генотип» (ООО «НекстБио»), «HPV Квант-15» и «HPV Квант-21» (ЗАО «ДНК-технология») и «РеалБест ДНК ВПЧ ВКР скрин» (АО «Вектор-Бест»). Материалом служили образцы ДНК, выделенные из соско-бов цервикального канала от женщин с онкологической патологией шейки матки (L-SIL, H-SIL), в которых ДНК ВПЧ 16, 18, 31, 33, 39, 45 и 52-го типов была обнаружена в интегрированной форме (отсутствие E1-E2 области генома ВПЧ). Всего было исследовано 56 образцов. Также исследовали 136 образцов соскобного материала в среде BD SurePath параллельно с помощью двух НР для скрининга - «АмплиСенс» и «АмплиПрайм» - для сравнения количественных результатов. Результаты. ДНК ВПЧ не обнаружена ни в одном из 56 образцов c интегрированной формой вируса с помощью НР «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-FL», обнаружена в 52 из 56 образцов в НР «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-14-FL», в 22 из 56 образцов -в «HPV Квант-15», во всех 56 - в «АмплиПрайм ВПЧ ВКР 14», в 20 из 20 образцов - в «РеалБест ДНК ВПЧ ВКР скрин». При тестировании 136 образцов наборами «АмплиПрайм» и «АмплиСенс» первый показал более высокую чувствительность и меньшее количество невалидных результатов. При определении количества ДНК ВПЧ продемонстрирован высокий коэффициент корреляции. Заключение. Чувствительность ВПЧ-теста зависит от мишени, выбранной для амплификации. Тесты, ориентированные на E1-E2 области, могут давать ложноотрицательные результаты в случае интеграции вирусной ДНК в клеточный геном, тогда как тесты, в которых выбраны E6-E7 области, не пропустят наличие ВПЧ ВКР в таких случаях. На основании полученных результатов и данных анализа мы пришли к выводу, что наиболее оптимальными для ВПЧ-скрининга являются наборы линейки «АмплиПрайм».

COMPARATIVE ANALYSIS OF MODERN REAGENT KITS ON THE BASIS OF REAL TIME PCR FOR DETECTION OF HPV WITH A HIGH CARCINOGENIC RISK IN THE FRAMEWORK OF CERVICAL SCREENING

O.Yu. Shipulina1, M.S. Abramova1, L.I. Korolenkova2

1 LabQuest, JSC

2 N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

,2

For correspondence:

Olga Yu. Shipulina, olga1504@mail.ru

For citation:

Shipulina O.Yu., Abramova M.S., Korolenkova L.I. Comparative analysis of modern reagent kits on the basis of real time PCR for detection of HPV with a high carcinogenic risk in the framework of cervical screening. Issues of Practical Colposcopy & Genital Infections. 2022; (3): 26-32. DOI: 10.46393/27826392_2022_3_26

Key words:

human papillomavirus of high carcinogenic risk, HPV test, cervical screening, HPV integration, precancer and cervical cancer

Summary

Objective. To conduct comparative tests of Russian HPV tests for organized screening and preventive examinations, evaluate the diagnostic and technical characteristics of the kits under screening conditions.

Materials and methods. Reagent kits were used to determine high carcinogenic risk HPV from four Russian manufacturers: "AmpliSense HPV HR screen-titer-FL", "AmpliSense HPV HR screen-titer-14-FL", and "AmpliSense HPV HR genotype-titer- FL" (Central Research Institute of Epidemiology), "AmpliPrime HPV HR 14" and "AmpliPrime HPV HR 14 genotype" (LLC "NextBio"), "HPV Kvant-15" and "HPV Kvant-21" (CJSC "DNA technology") and "RealBest DNA HPV HR screen" (JSC "Vector-Best"). DNA isolated from scrapings of the cervical canal from women with oncological pathology of the cervix (L-SIL, H-SIL), in which HPV types 16, 18, 31, 33, 39, 45 and 52 DNA was found in the integrated form (absence of the E1-E2 region of the HPV genome). A total of 56 samples were studied. Also, 136 samples of scraping material were examined in "BD SurePath" medium in parallel using two reagent kits for screening - "AmpliSense" and "AmpliPrime" to compare quantitative results.

Results. HPV DNA was not detected in any of the 56 samples with integrated form of virus using "AmpliSense HPV HR screen-titer-FL", detected in 52 of 56 samples in "AmpliSense HPV HR screen-titer-14-FL", in 22 of 56 samples - "HPV Kvant-15", in all 56 - in "AmpliPrime HPV HR 14" and in 20 out of 20 samples in "RealBest HPV DNA HR Screen". When testing 136 samples with the "AmpliPrime" and "AmpliSense" kits, the former showed higher sensitivity and fewer invalid results. HPV DNA quantification showed similar results.

Conclusion. The sensitivity of the HPV test depends on the target chosen for amplification. Tests that select E1-E2 regions may give false negative results if the viral DNA is integrated into the cellular genome. Whereas tests that select E6-E7 areas will not miss the presence of HPV HRC in such cases. Based on the obtained results and analysis data, we came to the conclusion that the most optimal for HPV screening are the "AmpliPrime" kits.

Заболеваемость раком шейки матки (РШМ) в Российской Федерации остается высокой, а частота запущенных форм не снижается. Главная причина - отсутствие организованного цервикального скрининга. Эффективность скрининга определяется охватом целевой группы, чувствительностью выбранного теста и стоимостью программы скрининга, при этом стоимость программы должна быть оправдана ее пользой [1]. Лабораторные методы скрининга включают цитологическое исследование - ПАП-тест (традиционный и жидкостный) и мо-лекулярно-генетическое исследование - ВПЧ-тест. В последние годы скрининг во многих странах переключают на первичное ВПЧ-тестирование по причине его более высокой чувствительности, меньшей трудоемкости в сравнении с ПАП-тестом. Согласно результатам исследования ATHENA, первичный скрининг на ВПЧ у женщин от 25 лет столь же эффективен, как и стратегия гибридного скрининга, при которой для женщин 25-29 лет используют цитологическое исследование, а для женщин с 30 лет - совместный ВПЧ-ПАП-тест. Однако первичный ВПЧ-скрининг требует меньшего количества лабораторных тестов, а значит, менее затратен [2, 3].

На сегодняшний день в мире существует большое количество коммерческих тестов для выявления ВПЧ, которые различаются по количеству выявляемых типов, выбранной мишени для амплификации и методу амплификации и детекции [4]. Однако не все тесты подходят для скрининга. Тесты для скрининга на ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВКР) должны соответствовать определенным требованиям - международным критериям по вали-дации 2009 г. (Meijer-2009) [5]. В России зарегистрированы и доступны несколько зарубежных ВПЧ-тестов, удовлетворяющих критериям, но высокая стоимость и ограниченная доступность не позволяют широко использовать их в скрининге. В то же время за последние 25 лет накоплен собствен-

ный опыт разработки и применения тестов для выявления ВПЧ российского производства. Большинство из них зарегистрированы, хорошо апробированы и уже используются в скрининге, диагностике и мониторинге ВПЧ-инфекции.

Чувствительность ВПЧ-теста в выявлении онкологической патологии зависит от многих факторов. Немаловажным является мишень, выбранная для амплификации. При прогрессировании поражения до высокой степени или инвазивного рака ДНК ВПЧ интегрируется в клеточный геном. В процессе интеграции происходит разрушение ДНК ВПЧ в участках различных генов, чаще всего Е1-Е2 области, реже Ь1. Область Е6-Е7 генов всегда встраивается в клеточный геном. Таким образом, если вирусный геном полностью интегрирован, то ВПЧ-тест, в котором мишенью выбраны области Е1-Е2, а также Ь1, может пропустить случаи предрака и рака в связи с деградацией этих областей, в то время как ВПЧ-тест, в котором мишенью для амплификации выбраны Е6-Е7 гены, не пропустит их [6]. При исследовании образцов предрака и рака шейки матки ВПЧ 16, 18 и 45-го типов значительно чаще обнаруживались в интегрированном состоянии по сравнению с ВПЧ 31-го и 33-го типов. При инфицировании 16, 18 и 45-м типами прогрессия патологии до инвазивного РШМ происходит чаще и за значительно меньшее время по сравнению с предраковыми состояниями, вызванными ВПЧ типов 31 и 33 [7, 8]. Интеграция ВПЧ в геном является неблагоприятным биологическим событием, ускоряющим процесс прогрессии дисплазии и обеспечивающим его об-лигатность, поэтому выявление в первую очередь таких пациенток является обязательным.

ВПЧ-тесты можно условно разделить на две группы. Тесты для скрининга, как правило, выявляют все типы ВПЧ ВКР «в одной пробирке», возможно с частичным генотипированием (типы 16 и 18/45), используются на первом этапе тестирования. Тесты для генотипирова-ния используют для сортировки ВПЧ-ВКР-положитель-

ных проб. Такой подход позволяет экономить затраты и увеличить пропускную способность лаборатории [9].

В Российской Федерации зарегистрировано большое количество ВПЧ-тестов как для скрининга, так и для генотипирования. Как в частных, так и в государственных лабораториях широко используются тесты производителей: ФБУН «ЦНИИЭ» Роспотреб-надзора, ЗАО «ДНК-технология», АО «Вектор-Бест». В сентябре 2020 г. были зарегистрированы ВПЧ-тесты ООО «НекстБио». Сравнительных испытаний наборов разных производителей ранее не проводилось.

Цель исследования - провести сравнительные испытания российских ВПЧ-тестов для организованного скрининга и профилактических осмотров, оценить диагностические и технические характеристики наборов в условиях скрининга.

Материал и методы

В работе были использованы наборы реагентов (НР) для скрининга на ВПЧ ВКР четырех российских производителей (ВПЧ-тесты): «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-FL» и «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-14-FL» (ФБУН «ЦНИИЭ»), «АмплиПрайм ВПЧ ВКР 14» (ООО «НекстБио»), «HPV Квант-15» (ЗАО «ДНК-технология») и «РеалБест ДНК ВПЧ ВКР скрин» (АО «Вектор-Бест»). Дизайн наборов и мишени

Таблица 1. Дизайн наборов для скрининга и мишени для амплификации ВПЧ ВКР

для амплификации ВПЧ ВКР представлены в табл. 1. Данные были получены из инструкций к НР. Сведений о мишенях для амплификации в наборах ЗАО «ДНК-технология» и АО «Вектор-Бест» в инструкциях нет. Все сравниваемые ВПЧ-тесты, кроме «РеалБест», позволяют определять относительную концентрацию - в десятичных логарифмах копий ДНК ВПЧ в пересчете на 100 тыс. клеток человека - lg/105 клеток. Количественная оценка позволяет установить порог клинически значимой концентрации, при которой есть вероятность развития онкологической патологии. Для генотипирования образцов, положительных в скрининге, использовали наборы для индивидуального количественного определения 14 типов ВПЧ ВКР - «АмплиСенс ВПЧ ВКР гено-тип-титр-FL» и «АмплиПрайм ВПЧ ВКР 14 генотип». Мишень для амплификации - участки генов E6-E7. Также использовали набор «HPV Квант-21» (ЗАО «ДНК-технология»), который позволяет количественно определять три типа низкого онкогенного риска (6, 11, 44), 14 типов ВКР и четыре типа вероятно высокого онко-генного риска (26, 53, 73, 82). Амплификацию ДНК проводили на приборах CFX96 (BIO-RAD) и DTprime (ЗАО «ДНК-Технология»). Результаты количественного определения ВПЧ учитывали с помощью FRT Manager (ООО «ИнтерЛабСервис») - программного обеспечения для управления приборами для проведения ПЦР в режиме

Канал для флуорофора FAM JOE/HEX ROX Cy5 Cy5.5 Пробирок для ПЦР

«АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-FL» (количественны й) 1

ДНК-мишень ДНК гена ß-глобина ВПЧ 16, 31, 33, 35, 52, 58 (группа А9) ВПЧ 18, 39, 45, 59 (группа А7) ВПЧ 51 и 56 (группы А5/А6) -

Область амплификации ß-globin gene E1gene E2 gene E1gene

«АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-14-FL» (количественный) 1

ДНК-мишень ВПЧ 16 ВПЧ 18 ВПЧ 16-68 ДНК гена ß-глобина ВПЧ 45

Область амплификации E6 gene E6 gene E1 gene - А9 E2 gene - А7, А6 E7 gene - 51 ß-globin gene E6 gene

«АмплиПрайм ВПЧ ВКР 14» (количественный) 1

ДНК-мишень ВПЧ 16 ВПЧ 18 ВПЧ 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 ДНК гена ß-глобина -

Область амплификации E6 gene E6 gene E6-E7 gene ß-globin gene

«HPV Квант-15» (количественный) 4

ДНК-мишень ВПЧ 16, 31, 33, 35, 52, 58 ВК - ВПЧ 56 Смесь 1

ДНК-мишень ВПЧ 18, 39, 45, 59 ВК - ВПЧ 6, 11 Смесь 2

ДНК-мишень ВПЧ 51 ВК Маркер ВПЧ 68 Смесь 3

ДНК-мишень КВМ (ген человека) ВК - Смесь 4

«РеалБест ДНК ВПЧ ВКР скрин» (качественный) 2

ДНК-мишень ВКО ВПЧ 16, 18 ВПЧ 33, 39, 45, 51, 56, 66, 68 - - Смесь 1

ДНК-мишень ВКО - 31, 35, 52, 58, 59 - - Смесь 2

реального времени, а также анализа полученных с приборов данных (регистрационное удостоверение № РЗН 2019/8870), интегрированного с лабораторной информационной системой (ЛИС). Основная работа выполнялась на базе лаборатории АО «ЛабКвест».

На первом этапе испытания наборов использовали образцы ДНК, выделенные из соскобного материала цервикального канала, помещенного в пробирку с транспортной средой «ТСМ» или флакон BD SurePath для жидкостной цитологии. Материал забирали как от женщин, проходивших скрининг, так и от женщин, направленных к онкогинекологу по результатам скрининга. Критерием отбора служили отрицательный результат в тесте «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-FL», SIL в цитологическом исследовании и положительный результат в ВПЧ-тесте для количественного дифференцированного определения ВПЧ 14 типов ВКР. Всего было отобрано 56 образцов, из них 23 образца - 16-й тип, 11 - 18-й тип, 4 - 31-й тип, 3 - 33-й тип, 2 - 39-й тип, 11 - 45-й тип, 2 - 52-й тип.

Оценку частоты выявления интегрированных ВПЧ различных типов (16, 18, 31, 33, 39, 45, 52, 58, 59) выполняли, анализируя базу данных по результатам ВПЧ-ПАП-теста за 2021 г. Также анализировали результаты генотипирования ВПЧ-ВКР-положительных образцов, в случае несоответствия результатов скрининга и генотипирования пробы отбирали для тестирования с помощью наборов других производителей.

Для сравнительной оценки количественных характеристик наборов для скрининга «АмплиСенс» и «АмплиПрайм» протестировали параллельно 136 остаточных образцов соскобного материала, взятого во флаконы для жидкостной цитологии (BD SurePath) от женщин с патологией шейки матки (ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина»), собранные за период с января 2019 по октябрь 2021 г., из них 59 были с диагнозом H-SIL. Выделение ДНК проводили вручную с помощью набора «АмплиСенс ДНК-сорб-Д» (ФБУН «ЦНИИЭ») для тестов «АмплиСенс», для теста «АмплиПрайм» - вручную и с помощью процессора магнитных частиц KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific) на наборах «МагноПрайм ВПЧ» (ООО «НекстБио»). При этом фиксировали время операции для всех методик. Эффективность выделения оценивали по количеству ДНК гена ß-глобина в пробе.

Результаты и обсуждение

Результаты, полученные при тестировании 56 образцов с интеграцией различных типов ВПЧ, представлены в табл. 2.

Набор «АмплиПрайм ВПЧ ВКР 14» выявил ВПЧ во всех 56 образцах, «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-14-FL» - в 52 (93%), пропустив при этом оба образца с 39-м типом и половину - с 31-м типом. «HPV Квант-15» выявил только 22 (39%) образца, пропустив почти все образцы с интегрированным 16-м типом. «РеалБест ДНК ВПЧ ВКР скрин» выявил 20 из 20 протестированных образцов (не включены в таблицу).

Для оценки частоты выявления интегрированных ВПЧ в скрининге, а также выявления патологии в ПАП-тесте при полном и интегрированном геноме ВПЧ проанализировали данные ВПЧ-ПАП-теста за 2021 г. Всего было протестировано 49 622 образца, из них положительными на ВПЧ ВКР (14 типов, концентрация > 3 ^ ДНК ВПЧ на 105 клеток) были 10 433 (21%) образца, среди которых 145 (1,4%) были с интеграцией ВПЧ. В этих образцах патологию (атипичные клетки) обнаруживали в 60,7% случаев (88 проб), а тяжелые поражения (> И-81Ь) - в 30,3% (44 пробы), в то время как в образцах без интеграции - в 47,5 и 9,8% соответственно. Аналогичные данные для отдельных типов представлены в табл. 3.

Таблица 2. Результаты тестирования 56 образцов с интеграцией ВПЧ тремя наборами

Тип Количество Количество (абс .) и доля (%) положительных

ВПЧ проб «АмплиСенс скрин-14» «АмплиПрайм скрин-14» «Квант-15»

16 23 23 100,0 23 100,0 1 4,3

18 11 11 100,0 11 100,0 6 54,5

31 4 2 50,0 4 100,0 1 25,0

33 3 3 100,0 3 100,0 3 100,0

39 2 0 0,0 2 100,0 2 100,0

45 11 11 100,0 11 100,0 9 81,8

52 2 2 100,0 2 100,0 0 0,0

Итого 56 52 92,9 56 100,0 22 39,3

Таблица 3. Частота выявления тяжелой патологии (> И-БИ) при полном и интегрированном ВПЧ по отдельным типам вируса

Тип ВПЧ/статус Количество > H-SIL OR Доля

Выявлено Доля, % интегрированных, %

16-й тип 1768

полный 1720 459 26,7

интегрированный 44 20 45,5 1,7 2,5

18-й тип 307

полный 275 26 9,5

интегрированный 32 10 31,3 3,3 10,4

45-й тип 310

полный 265 17 6,4

интегрированный 45 12 26,7 4,2 14,5

39-й тип 350

полный 346 5 1,4

интегрированный 4 3 75,0 51,9 1,1

59-й тип 209

полный 207 2 1,0

интегрированный 2 1 50,0 51,8 1,0

31-й тип 743

полный 739 64 8,7

интегрированный 4 1 25,0 2,9 0,5

33-й тип 464

полный 458 99 21,6

интегрированный 6 2 33,3 1,5 1,3

52-й тип 527

полный 521 21 4,0

интегрированный 6 1 16,7 4,1 1,1

58-й тип 329

полный 325 34 10,5

интегрированный 4 1 25,0 2,4 1,2

Примечание. OR - отношение шансов.

Данные демонстрируют высокую долю интегрированных ВПЧ для 16, 18 и 45-го типов. Другие типы в интегрированной форме встречаются в 0,5-1,3% случаев, но отношение шансов выявления H-SIL при интеграции значительно выше для 39-го и 59-го типов - 51,9 и 51,8 соответственно. Это означает, что при использовании ВПЧ-тестирования на первом этапе скрининга случаи предрака и рака, связанные с этими типами, будут пропущены при использовании теста, в котором в качестве мишени для амплификации используются E1-E2 гены ВПЧ. Согласно результатам крупных европейских исследований HERACLES и SCALE по выявлению различных типов ВПЧ при инвазивном РШМ (ICC) и предраковой патологии (H-SIL), типы ВПЧ, принадлежащие к филогенетической группе A7 (18, 45, 39, 59 и 68), чаще выявляли при ICC, чем при H-SIL [10]. Это подтверждают и результаты российских исследований [8]. Таким образом, ВПЧ-тесты, в которых в качестве мишени для амплификации выбраны E6-E7 гены, имеют важное преимущество, которое позволяет использовать их на первом этапе скрининга в качестве самостоятельного первичного теста без риска пропустить онкологическую патологию.

Результаты, полученные при тестировании 136 образцов ДНК параллельно с помощью наборов для скрининга «АмплиСенс» и «АмплиПрайм», представлены в табл. 4.

При тестировании набором «АмплиПрайм» было получено 4 (2,9%) невалидных образца (количество клеток < 500), а с набором «АмплиСенс» -17 (12,5%), из них 13 образцов были положительными, но рассчитать концентрацию не представлялось возможным. Клинически значимая концентрация ВПЧ определена в 101 образце набором «АмплиПрайм» и в 92 - «АмплиСенс», при этом в одном образце ВПЧ 31-го типа не выявлен вследствие интеграции, 8 об-

Таблица 4. Сравнение результатов параллельного тестирования образцов с помощью наборов для скрининга «АмплиСенс» и «АмплиПрайм»

разцов были невалидными. Из 27 ВПЧ-негативных образцов, по результатам «АмплиПрайм», 11 были также негативны в «АмплиСенс», в 10 концентрация была ниже пороговой (незначимая), 6 были невалидными. Таким образом, адекватный результат получен в 132 (101 + 4 + 27) случаях на НР «АмплиПрайм» и в 118 (1 + 92 + 4 + 11 + 10) случаях на «АмплиСенс», с учетом одного пропущенного случая интеграции 31-го типа ВПЧ (Н-81Е). Эффективность экстракции ДНК из жидкостных образцов выше при работе с НР «МагноПрайм ВПЧ» по сравнению с «АмплиСенс ДНК-сорб-Д» - среднее количество геномов на реакцию - 24 500 (3,9 и 11 000 (3,2 копий соответственно.

Время выделения 48 проб вручную с момента добавления депротеинизированной пробы в лизирую-щий раствор до получения очищенной ДНК составляет в среднем 60 минут для «ДНК-сорб-Д» и 35 минут для «МагноПрайм ВПЧ». Это связано с большим количеством и сложностью манипуляций в первом случае -центрифугирование, вортексирование и высушивание сорбента, отсутствие которых во втором случае приводит к значительному сокращению времени экстракции. Выделение ДНК из 94 образцов с помощью «Магно-Прайм ВПЧ» на магнитном процессоре занимает 40 минут (15 минут - аликвотирование, 25 минут - процес-сирование). Таким образом, пропускная способность лаборатории увеличивается при использовании наборов линейки «АмплиПрайм» с применением автоматов для экстракции ДНК.

Результаты, полученные при сопоставлении концентраций отдельно для 16-го типа (52 образца), 18-го типа (10 образцов) и остальных типов ВПЧ (23 образца), представлены в табл. 5. Определяли среднее значение концентраций в 1§/105 клеток, среднюю разницу концентраций и коэффициент корреляции Пирсона (г). Образцы с микст-инфекцией были исключены из расчетов.

Среднее значение концентраций было выше для «АмплиСенс» на 0,3 для 16-го и 18-го типов и на 0,5 - для 31-68-го типов ВПЧ ВКР. Коэффициенты корреляции были высокими для всех типов ВПЧ, что свидетельствует о достаточно высокой точности измерения концентрации ДНК ВПЧ.

Для сравнения наборов для генотипирова-ния проанализировали результаты ВПЧ-тестиро-вания, выполненного на наборах «АмплиСенс».

Таблица 5. Результаты измерения средних значений концентраций ВПЧ 16, 18 и 31-68-го типов с помощью наборов «АмплиПрайм» и «АмплиСенс»

Результат ВПЧ-теста «АмплиПрайм» «АмплиСенс»

Среднее количество клеток в образце (lg/реакцию) 3,9 3,2

Невалидный (< 500 клеток) 4 (все ВПЧ-) 3

1 (> 500 клеток, ВПЧ-)

ВПЧ ВКР > 3 lg 101 92

1 (ВПЧ-, 31-й тип интеграция)

8 (невалидные ВПЧ+)

ВПЧ ВКР < 3 lg 4 3

1 (ВПЧ 16 - 3,1 lg)

ДНК ВПЧ не выявлена 27 11

10 (ВПЧ < 2 lg)

6 (невалидные, 3 - ВПЧ+)

Исследуемые параметры 16-й тип ВПЧ 18-й тип ВПЧ 31-68-й типы ВПЧ

Средняя концентрация, «АмплиПрайм» 5,4 4,5 5,0

Средняя концентрация, «АмплиСенс» 5,7 4,8 5,5

Д lg 0,3 0,3 0,5

г 0,92 0,99 0,94

• •

АмплиПрайм /

ВПЧВКР-

САМЫЙ РАННИЙ И КЛЮЧЕВОЙ МАРКЕР ВОЗМОЖНОГО РАЗВИТИЯ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ

ПЦР-тесты линейки АмплиПрайм® для выявления ВПЧ вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска (ВПЧ-ВКР]

• Соответствуют международным стандартам и рекомендациям ВОЗ;

• Обладают высокой чувствительностью и специфичностью для точной идентификации ВПЧ-инфекции;

• Определяют все, в том числе самые опасные - интегрированные формы ВПЧ;

• Определяют вирусную нагрузку (концентрацию ДНК ВПЧ-ВКР) - важный показатель прогрессии вирусной инфекции.

V -

V -

V -

АмплиПрайм®ВПЧ- ВКР-14

V -

V -

V -

этапа скрининга.

АмплиПрайм®ВПЧ-ВКР-14-генотип

Выявляет ДНК ВПЧ-ВКР с идентификацией 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 типов.

Тест предназначен для второго этапа скрининга, когда требуется идентификация типов ВПЧ-ВКР, не относящихся к 16 и 18 типам и случаях ко-инфекции.

Выявляет ДНК 14 основных типов ВПЧ-ВКР и отдельной идентификацией самых онкогенных - 16 и 18 типов. Тест для первого этапа скрининга.

{::} WWW.nextbi0.rU

V'/

В saLesOnexbio.ru V. +8-800-100-28-84

Ш

Не является публичной офертой РУ №РЗН 2020/11951

Затем отбирали образцы с разными типами ВПЧ для тестирования на «АмплиПрайм» и «Квант-21». Из 10 433 ВПЧ-положительных образцов (концентрация > 3 ^ ДНК ВПЧ на 105 клеток) 14 типов ВПЧ выявляли в виде моноинфекции в 67,9% случаев, 16-й тип - в 16,9%, 18-й - в 2,9%, 31-й - в 7,1%, 33-й -в 4,4%, 35-й - в 1,7%, 39-й - в 3,4%, 45-й - в 2,9%, 51-й - в 4,3%, 52-й - в 5,1%, 56-й - в 4,9%, 58-й -в 3,2%, 59-й - в 2,0%, 66-й - в 3,4%, 68-й тип - в 4,9%, в 33% случаев выявили микст-инфекцию ВПЧ. В 0,8% случаев (88 образцов, концентрация от 3,2 до 8,3 средняя - 5,2 генотип ВПЧ не определялся при использовании набора реагентов «АмплиСенс ВПЧ ВКР генотип-титр-БЬ». Эти образцы были протестированы с помощью наборов «АмплиПрайм ВПЧ ВКР 14 генотип» и «НРУ Квант-21». Во всех случаях был определен 66-й тип ВПЧ. Таким образом, НР «Ам-плиСенс ВПЧ ВКР генотип-титр-БЬ» не определял 66-й тип ВПЧ в 19,8% случаев (88 образцов из 444).

Заключение

Использование ВПЧ-теста в массовом скрининге на первом этапе позволяет повысить его эффективность, а также сократить расходы и трудозатраты. При выборе наборов реагентов для ВПЧ-тестирования важно оценивать не только аналитические и диагностические характеристики набора - чувствительность и специфичность, но и технические параметры - количество реакционных пробирок на один образец, время проведения амплификации, выделения ДНК из соскоб-ного материала, эффективность экстракции ДНК, возможность автоматизации разных этапов ПЦР-анализа. Наличие программного обеспечения, которое помогает быстро анализировать результаты и передавать их в ЛИС, позволяет снизить трудозатраты врача-лаборанта и сократить количество ошибок, связанных с человеческим фактором, при ручном вводе результатов. Алгоритм ВПЧ-тестирования, при котором сначала выполняется тест на ВПЧ ВКР «скрин», а затем проводится полное генотипирование положительных образцов ДНК, является наиболее оптимальным при массовом скрининге. Большой поток биоматериала разного типа - соскобы, самостоятельные мазки, взятые в разные контейнеры (пробирки, виалы) с разными транспортными средами (буферные солевые растворы, спиртовые фиксирующие среды), - требует хорошо продуманной логистики внутри лаборатории с автоматизацией максимального количества рабочих процессов, от регистрации образца в лаборатории до выдачи результата. Внедрение программно-аппаратных комплексов в лабораториях, выполняющих массовое тестирование, решает эту задачу.

Сравнительный анализ ВПЧ-тестов для скрининга выявил недостатки некоторых наборов реагентов: количество реакционных смесей в наборах АО «Вектор-Бест» (2) и ЗАО «ДНК-технология» (4); дизайн наборов, не позволяющий дифференцировать наибо-

лее онкогенные 16-й и 18-й типы («HPV Квант-15» и «РеалБест ДНК ВПЧ ВКР скрин»); неправильно выбранные мишени для амплификации - E1-E2 гены, которые подвергаются деградации при интеграции в геном («HPV Квант-15», «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-FL» и «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-14-FL»), что приводит к ложноотрицательным результатам ВПЧ-скрининга, в частности потере случаев H-SIL при интеграции генома ВПЧ в геном эпителиальной клетки.

На основании полученных результатов и данных анализа мы пришли к выводу, что наиболее оптимальными для ВПЧ-скрининга являются наборы линейки «АмплиПрайм», так как позволяют выявить все случаи инфицирования ВПЧ ВКР, включая интегрированные в геном.

Литература

1. Драпкина О.М., Самородская И.В. Скрининг: терминология, принципы и международный опыт. Профилактическая медицина. 2019; 1: 90-97.

2. Maver P.J., Poljak M. Primary HPV-based cervical cancer screening in Europe: implementation status, challenges, and future plans. Clin. Microbiol. Infect. 2020; 26 (5): 579-583.

3. Wright T.C., Stoler M.H., Behrens C.M. et al. Primary cervical cancer screening with human papillomavirus: end of study results from the ATHENA study using HPV as the first-line screening test. Gynecol. Oncol. 2015; 136 (2): 189-197.

4. Poljak M., Ostrbenk V.A., Gimpelj D.G. et al. Commercially available molecular tests for human papillomavirus-es: a global overview. Clin. Microbiol. Infect. 2020; 26 (9): 1144-1150.

5. Arbyn M., Simon M., Peeters E. et al. 2020 list of human papillomavirus assays suitable for primary cervical cancer screening. Clin. Microbiol. Infect. 2021; 27 (8): 1083-1095.

6. Tjalma W.A.A., Depuydt C.E. Cervical cancer screening: which HPV test should be used - L1 or E6/E7? Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2013; 170 (1): 45-46.

7. Vinokurova S., Wentzensen N., Kraus I. et al. Type-dependent integration frequency of human papillomavirus genomes in cervical lesions. Cancer Res. 2008; 68 (1): 307-313.

8. Шипулина О.Ю. Эпидемиологические особенности и меры профилактики онкогинекологической патологии шейки матки: дис. ... канд. мед. наук. М., 2013. 145 с.

9. Gultekin M., Karaca M.Z., Kucukyildiz I. et al. Initial results of population based cervical cancer screening program using HPV testing in one million Turkish women. Int. J. Cancer. 2018; 142 (9): 1952-1958.

10. Tjalma W.A., Fiander A., Reich O. et al. Differences in human papillomavirus type distribution in high-grade cervical intraepithelial neoplasia and invasive cervical cancer in Europe. Int. J. Cancer. 2013; 132 (4): 854-867.