CC BY
41
УДК: 618.14.006-6:615.371
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РАБОТЫ ПО ЭКСТРАКЦИИ ДНК ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА И ГЕНИТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ ИЗ ЖИДКОСТНОЙ ЦИТОЛОГИЧЕСКОЙ ТРАНСПОРТНОЙ СРЕДЫ CELLSCAN
О.В. ЗАВАЛЕННАЯ1, С.К. БАЛМАГАМБЕТОВА1, Б.К. КАРИМСАКОВА1, О.Н. УРАЗАЕВ1, С.К. САХАНОВА1, С.И. КОКТОВА2, Л.М. ЯКУПОВА3, К.К. САРКУЛОВА4, Е.В. ЖОЛДЫБАЕВА5, Ж.Ж. БАЛМАГАМБЕТОВА1
'Западно-Казахстанский государственный медицинский университет имени Марата Оспанова,
Актобе, Казахстан
2Консультативно-диагностическое отделение Актюбинского областного перинатального центра,
Актобе, Казахстан
3Цитологическая лаборатория Западно-Казахстанского областного онкологического диспансера,
Уральск, Казахстан 4Актюбинское Областное патологоанатомическое бюро, Актобе, Казахстан Национальный научный центр биотехнологий Комитета науки Министерства образования и науки РК,
Астана, Казахстан
Заваленная О.В. Балмагамбетова С.К.
Каримсакова Б.К. Уразаев О.Н.
Саханова С.К. Коктова С.И. Якупова Л.М. Саркулова К.К. Жолдыбаева Е.В. Балмагамбетова Ж.Ж.
- Зав. лабораторией ПЦР НПЦ, ст. научный сотрудник проекта;
- РШ-докторант, СНС научного проекта, координатор НТП, e-mail:sau-balmagambetova@yandex.ru;
- к.м.н., доцент, руководитель кафедры ВОП №1, консультант НТП;
- МЭ,РШ, и.о. ассоциированного профессора кафедры онкологии и визуальной диагностики;
- д.м.н., ассоциированный профессор, руководитель НПЦ;
- врач, МНС научного проекта;
- МНС научного проекта, зав. цитологической лабораторией;
- МНС научного проекта, зав. цитологической лабораторией;
- к.м.н., зав. генетической лабораторией;
- интерн-хирург, МНС научного проекта.
Аннотация. В статье описываются итоги эксперимента по выделению ДНК ВПЧ и влагалищной микробиоты из жидкостной транспортной среды CeИScan с использованием российских тест-систем «ВПЧ Квант-21» и «Фемофлор-скрин» на российском оборудовании (производитель «ДНК-технология», РФ), методом ПЦР. Краткие результаты: в целом, в 17 образцах первой партии биоматериала в контрольном заборе было зафиксировано 26 генотипов ВПЧ, из них в экспериментальном биоматериале, полученном из жидкостной транспортной среды CeИScan от тех же женщин, выявлено только 16, или 61,5%. Вирусная нагрузка в экспериментальном биоматериале практически ни в одном образце не соответствовала контрольной. При экстракции ДНК влагалищной микробиоты во всех 13 образцах наблюдаются значительные расхождения результатов подсчета общей бакмассы: в контрольных образцах ОБМ практически вдвое выше, чем в опытных, что свидетельствует о потенциальном разрушении ДНК микроорганизмов, находящихся во взвеси клеток из CellScan. Вывод: результаты этого эксперимента в целом оценены как неудовлетворительные - наблюдаются большие различия между опытными и контрольными образцами, не позволяющие реализовать методику экстракции ДНК ВПЧ и влагалищной микробиоты из жидкостной транспортной среды CeИScan даже на уровне качественного анализа (в режиме да/нет)..
Ключевые слова: ДНК, ВПЧ, ПЦР, влагалищная микробиота, технология Се1Шсап.
Согласно данным казахстанской статистики, уже к 2012 году рак шейки матки (РШМ) достиг значительной пропорции среди наиболее распространенных в республике раков, заняв 5-ое
место с удельным весом в 4,8% в консолидированной структуре злокачественных опухолей [1]. Ситуация с заболеваемостью РШМ в стране за минувшие годы не улучшилась. Барселонская рабочая группа
из Информационного центра по ВПЧ и раку шейки матки (ICO) в своем ежегодном Отчете 23.12.2015 г. доложила, что цервикальный рак в Казахстане является вторым по распространенности среди женщин и занимает первое место по частоте в возрастной категории женщин репродуктивного возраста от 15 до 44 лет, с уточненным стандартизованным по возрасту показателем инциденса на 100000 женского населения -32,8[2].
По данным пилотного проекта нашего университета от 2014 г., превален с ВПЧ группы высококарциногенного риска (ВКР-ВПЧ), этиологического фактора реализации рака шейки матки, в Западном регионе Казахстана составил 26,04 % и был расценен как высокий. Лидирующими генотипами являлись 16 (10,68%), 39 (5,83%), 51 (5,27%), 31 (4,85%) и 56 (4,58%) [3].
Хорошо известно, что ВПЧ широко представлен даже в нормальной цитологии, будучи ранним маркером потенциального онкологического процесса. По результатам мета-анализа, проведенного Bernardetal., обнаружение только типа 16 ВПЧ в нормальной цитологии во всем мире колеблется в среднем от 16% и до 50% [4].
В последние годы клинически доказано, что для выявления тяжелой патологии шейки матки обязательно необходимо проведение ВПЧ-типирования, так как чувствительность ДНК-теста составляет 75-95% против 70 - 90% PAP-теста, а предсказательная ценность отрицательного ВПЧ ДНК-теста составляет 99% [5]. Проведенное в Мексике масштабное исследование женщин в возрасте от 30 до 80 лет на предмет затратной стоимости изолированного PAP-теста против комбинированного обследования PAP+ВПЧ ДНК-тест показало, что в конечном итоге комбинированное исследование всегда более экономически эффективно, чем использование только PAP, так как предотвращает многие негативные исходы, ложащиеся бременем на государство [6]. Рабочая группа IARC (Международного агентства по исследованию рака) выполнила крупномасштабные популяционные исследования по цервикальным скрининговым технологиям, на основе которых в 2007 г. были разработаны 10 Ключевых рекомендаций. Одна из них заключается в переходе к ВПЧ-тестам в качестве основного скринингового инструментав борьбе с РШМ [7]. Молекулярно-биологические тесты для выявления ВПЧ (независимо от методов - ПЦР, гибридного захвата (HC, HC-II) и т.д.) также рекомендованы Всемирной Организацией Здравоохранения для проведения сортировки незначительных цитологических нарушений и последующего ведения женщин после лечения
поражений шейки матки высокой степени тяжести [8, 9].
К этому времени в общемировом масштабе уже был собран большой объем доказательств лучшей эффективности ВПЧ-тестирования в диагностике тяжелых цервикальных поражений, что в конечном итоге привело к радикальным изменениям в концепции методов скрининга. В настоящее время цервикальный скрининг на основе ДНК ВПЧ клинически подтвержден в качестве первичного скринингового инструмента и, обеспеченный соответствующим протоколом, является более эффективным, чем скрининг, основанный только на цитологии, в предотвращении инвазивного рака шейки матки. Доказано, что скрининг с ВПЧ-тестированием может уменьшить на 60-70% количество случаев инвазивного рака шейки матки по сравнению со скринингом, основанным на применении только PAP-тестов [10].
Как известно, одобренные FDA (Федеральным Агентством по контролю за заболеваемостью, США) еще в 90-ых годах транспортные среды для жидкостной цитологии, такие как SurePath, ThinPrep, EasyPrep, позволяют осуществить выделение ДНК ВПЧ и ДНК влагалищной микробиоты из остаточной жидкости после выполнения цитологического теста [11, 12, 13, 14, 15]. Жидкостные транспортные среды, одобренные FDA и повсеместно применяющиеся в странах Америки и Европы для рутинных цервикальных скрининговых процедур, называют «универсальными», так как они позволяют произвести забор биологического материала у пациентки однократно - на выявление цитологического статуса, статуса ВПЧ-инфицированности и, при необходимости, по показаниям - для определения состава влагалищной микробиоты. Такой подход обеспечивает огромное преимущество для пациенток, однократно сдающих все необходимые для адекватной диагностики анализы, а также характеризуется относительно низкой экономической затратностью - нет необходимости в дополнительных расходных материалах - транспортных средах и урогенитальных зондах для забора тестов на выявление ДНК ВПЧ и генитальных инфекций.
Казахстан, который ранее (в 2013 году) перенял технологию BD (SurePath®, BDdiagnostics, Tripath, Берлингтон, штат Северная Каролина, США), позволяющую извлекать ДНК ВПЧ из жидкостной транспортной среды для цитологических исследований, затем перешел к CellScan технологии (LTD "TechBioCo.", South Korea), относительно которой экспертная оценка в мировой научной периодике не была проведена до сих пор (имеются в виду публикации уровня «Core Collection»). Кроме
того, наша страна до сих пор не приняла рекомендации ВОЗ, касающиеся первичного ВПЧ - тестирования.
Отсутствие первичного тестирования на ВПЧ и упомянутый высокий инциденс рака шейки матки в республике (32,8 на 100000 женского населения) связаны между собой и убедительно демонстрируют настоятельную необходимость введения молекулярно-биологических тестов для обнаружения ДНК ВПЧ в существующую систему цервикального скрининга в нашей стране. Это позволит своевременно выявлять женщин из группы риска по реализации РШМ и существенно сократить массовые трудоемкие цитологические исследования у женщин с отрицательным ВПЧ-тестом.
Цель настоящего исследования. Проведение эксперимента по выделению ДНК ВПЧ и влагалищной микробиоты из жидкостной транспортной среды CeИScan с использованием российских тест-систем «ВПЧ Квант-21» и «Фемофлор-скрин» (производитель «ДНК-технология», РФ), применяющихся в ряде ПЦР-лабораторий на пространстве СНГ и значительно уступающих в стоимости зарубежным аналогам.
Работа была запланирована врамках проводимого университетского НТП «Эпидемиологический анализ вируса папилломы человека в контексте вирус-ассоциированной патологии шейки матки в регионе Западного Казахстана - социальные, клинические и генетические аспекты» (грант 2230/ ГФ4, № государственной регистрации 0115РК01224, Договор с КН МОН РК № 179 от 12.02.2015 и № 103 от 25.04.2016) по исследованию цитологической жидкостной технологии CellScan, применяющейся в качестве основного скринингового инструмента в РК. В случае успешного осуществления данного эксперимента с получением убедительных результатов открывался ряд перспектив по широкому использованию CellScan технологии в скрининговой и общей гинекологической практике в стране. Эксперимент не входил в число приоритетных задач упомянутого научного Проекта.
Экспериментальная работа была призвана решить следующие задачи:
1) определить, возможно ли в принципе выделение ДНК ВПЧ и ДНК влагалищной микробиоты из клеточного носителя - жидкостной транспортной среды CeИScan с использованием метода ПЦР на российском оборудовании;
2) уточнить степень конкордантности результатов путем сопоставления с контрольным забором биоматериала на транспортные среды российского производства («ДНК-технология»);
3) в случае высокой конкордантности полученных результатов запатентовать методику и рассмотреть возможность ее повсеместного внедрения в
Западномрегионе Казахстана с разработкой соответствующего пилотного научного проекта.
Материалы и методы. Объектом исследования являлся биоматериал, полученный у женщин из общей популяции, проживающих в регионе Западного Казахстана - в городах областного значения, малых городах, пригородах и ближайших районах и отобранных в научный проект по эпидемиологическому анализу ВПЧ в Западном регионе.
Критерии включения: возраст 18-60 лет; наличие фоновой патологии шейки матки, включая понятие «завершенная зона трансформации», т.е. без видимых активных признаков патологии; резидент Западного Казахстана любой этничности; отсутствие вакцинации в анамнезе.
Критерии исключения: приезжие (не резиденты РК); вакцинированные против РШМ.
ВИЧ, беременность до 10 недель не являлись критериями исключения.
Исследование в рамках научного проекта было одобрено Биоэтической комиссией университета (Протокол заседания БЭК № 3 от 09.10.2014) и проводилось по утвержденному Протоколу. Все обследуемые подписали бланк Информированного согласия, оформленный в соответствии с требованиями ВОЗ [16].
Забор биоматериала с шейки матки производился специальным цитобрашем на транспортные среды «CellScan», широко применяющиеся в Республике Казахстан с 2013 г. для проведения скрининга РШМ. Произведены по технологии IMSTAR (Франция) и, по данным производителя, испытаны на репрезентативной выборке в 25000 женщин. Специфичность теста составляет > 85 % и чувствительность > 90 %. Данные взяты с сайта (www.imstar.fr). Промышленное внедрение и выпуск осуществляются компанией LTD "TechBioCo.", South Korea.
Для осуществления эксперимента отбирались виалы с остаточной жидкостью после цитологического теста у женщин, у которых уже были идентифицированы различные типы ВПЧ путем ПЦР-типирования на тест-системах «ВПЧ Квант-21», служившие контролем.
По инструкции Производителя транспортной среды SurePath®, а также большинства аналогичных сред, одобренных FDA, допускается хранение виал с биоматериалом на срок до шести месяцев при охлажденных температурах (от +2°С до +10°С) или до 4 недель (ThinPrep, Hologic, USA - до 6 недель) при комнатной температуре (+15° до +30°C), а также их можно хранить и транспортировать в течение 30 суток до производства анализа при температуре от
+2° до +30°C [17, 18]. Как прежде упоминалось, поиск работ в мировой научной периодике, посвященных исследованиям транспортной среды CellScan, включая методики экстракции ДНК ВПЧ из этой среды, ее химический состав и сроки хранения виал с биоматериалом, не привел к результатам. Поэтому в нашем эксперименте виалы хранились при температуре +2+8 по Цельсию различные сроки, от 4-х до максимум 12 недель, как указано в работе TaokaH. еМ. [14].
Качественное и количественное определение генотипов ВПЧ производилось на тест-системах Квант-21 (производство «ДНК-технология», Россия) с использованием детектирующего амплификатора ДТ-прайм (того же производства). Продукция компании «ДНК-технология» сертифицирована (ISO 13485:2012).
Характеристика амплификатора: 96-луночный, 4х-канальный, позволяющий производить мультиплексный анализ, зарегистрирован в РК (РК-МТ-7-№013267 от 23.07.2014).
Характеристика тест-систем ВПЧ-Квант-21 позволяет детектировать следующие генотипы:
• 6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 44, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82 (всего 21, из них - 13 ВКР;
• 5 - возможно/вероятно карциногенных (26, 53, 66, 73, 82);
• 3 - низкокарциногенных (6, 11, 44). Аналитическая чувствительность - более 95%, данные о специфичности не приведены.
Для выделения ДНК вируса использовались комплекты реагентов ПРОБА-НК-ПЛЮС, того же производства. Тип анализа - абсолютный, т.е., определенное количество копий вируса на образец, измеряемое в геномных эквивалентах (ГЭ) с логарифмическим исчислением. Вирусная нагрузка до 103 ГЭ ВПЧ, приходящихся на 1000 клеток человека, расценивалась как «малая», от 103 до 105 ГЭ расценивалась как «средняя», а 105 ГЭ и выше -как «высокая».
ПЦР осуществлялась по общепринятой методике амплификации ПЦР-продукта с использованием стандартных праймеров: повторяющимися циклами температурной денатурации ДНК, отжига праймеров комплементарными последовательностями и последующей достройкой полинуклеотидных цепей с этих праймеровTaq-полимеразой.
Для выделения ДНК микробиоты влагалища из остаточной жидкости CellScan отбирался материал, полученный у женщин с выраженными клиническими проявлениями инфекции, которым производился контрольный забор мазка на ПЦР, исследовавшийся с помощью комплекта реагентов «Фемофлор-скрин».
Сроки и режим хранения клеточной взвеси на среде CellScan: +2+8С, от 1 до 4 недель.
Характеристика набора реагентов для скринингового исследования микрофлоры урогенитального тракта у женщин методом ПЦР-РВ «Фемофлор-скрин» (регистрационное удостоверение № РК-ИМН-5№014150, производитель НПО «ДНК-Технология» ООО, РФ), разрешено к применению на территории РК 04.02.2015.:
диагностическая чувствительность исследования с «Фемофлор-скрин» для выявления дисбиотических состояний составляет 88,7%, специфичность -89,6%; для бактериального вагиноза достигает 95%. Специфичность данного набора реагентов подтверждена сиквенсом 16s РНК.
Аналитические характеристики: в случае исследования биоценозов урогенитального тракта у женщин определяется количество микроорганизмов в транспортной среде, пропорциональное общей обсемененности соответствующего биотопа. Линейный диапазон составляет:
• для уреаплазм 0-109 ГЭ/образец;
• для общей бакмассы (ОБМ) 104-1010 ГЭ/образец;
• для остальных микроорганизмов 103-1010 ГЭ/ образец.
Характеристика нормобиоты женской репродуктивной сферы (нормоценоза):
• Общая бактериальная масса (ОБМ) - абсолютный показатель 105-107 для уретры и цервикального канала;
• Нормобиота (Lactobacillusspp) - абсолютный показатель 105-107 для уретры и цервикального канала;
• Аэробные и анаэробные условно-патогенные микроорганизмы (УПМ) - абсолютный показатель <104;
• Mycoplasmahominis, Ureaplasma (urealyticum+parvum) - отсутствуют или их абсолютный показатель<104;
• Грибы рода Candida - отсутствуют или их абсолютный показатель<104 [19, 20].
К анаэробным микроорганизмам, наиболее часто обсеменяющим женскую репродуктивную сферу, относится ассоциация Gardnerellavaginalis, Prevotellabivia и Porphyromonasspp.[21, 22, 23].
Таким образом, набор реагентов «Фемофлор-скрин» позволяет провести качественную и количественную оценку биоты влагалища: нормобиоты, аэробной (факультативно-анаэробной) и анаэробной условно-патогенной биоты, мико- и уреаплазм и грибов рода Candida в абсолютных и логарифмических показателях.
Статистическая обработка полученных результатов предполагалась в программе Statistica,10
(Dell Software Inc., USA). Расчет объема выборки было решено провести после получения пробных результатов. В случае удовлетворительной конкордантности (сопоставимости) первой партии результатов предполагалось использование каппа-статистики и проведение ROC-анализа при установленном уровне p>0.05, CI 95%.
Результаты и обсуждение. Результаты определения ДНК ВПЧ из жидкостной среды указаны в таблице 1.
Как следует из сводной таблицы, конкордантность (совпадаемость результатов)
оказалась неудовлетворительной. В целом, в 17 образцах первой партии биоматериала в контрольном заборе было зафиксировано 26 генотипов ВПЧ, из них в экспериментальном биоматериале, полученном из жидкостной транспортной среды Се1^сап от тех же женщин, выявлено только 16, или 61,5%. Вирусная нагрузка в экспериментальном биоматериале практически ни в одном образце не соответствовала контрольной. Предположение, что качество амплификации ПЦР-продукта, полученного из взвеси клеток из жидкостной среды Се1^сап, зависит от температурного режима и сроков хранения
Таблица 1.
Результаты ПЦР-типирования клеточной взвеси из транспортной среды Се!^сап для обнаружения ВПЧ
№ Код/ шифр Сроки и режим хранения клеточной взвеси на среде Се1^сап Результат ПЦР с комплектом реагентов Квант-21: контроль (ГЭ/образец) Результат ПЦР взвеси клеток из жидкостной среды CellScan: эксперимент (ГЭ/образец)
1 4/1/31 ~9 недель при 1° +2+8 52* - 5,4** Отриц.
2 4/1/32 ~8 недель при 1° +2+8 31 - 4,2 Отриц.
3 4/1/34 ~7 недель при t0 +2+8 16 - 4,5 18 - 4,6 31 - 3,0 39 - 5,1 59 - 3,6 16 - 2,6 18 - abs 31 - abs 39 - 3,1 59 - abs
4 4/1/35 ~5 недель при° +2+8 16 - 4,7 16 - 2,8
5 4/1/37 ~5 недель при t° +2+8 16 - 4,4 51 - 4,5 Отриц.
6 2/3/71 ~4 недели при 1° +2+8 31 - 5,3 52 - 3,7 Отриц.
7 2/3/82 ~4 недели при 1° +2+8 6 - 3,6 Отриц.
8 2а/3/2 ~12 недель при 1° +2+8 45 - 2,7 73 - 5,2 45 - 1,3 73 - 3,5
9 2а/1/17 ~4 недели при 1° +2+8 16 - 5,3 16 - 4,4
10 2а/1/25 ~5 недель при 1° +2+8 16 - 6,4 16 - 4,4
11 2а/1/26 ~5 недель при 1° +2+8 6 - 2,8; 59 - 3,8 6 - abs 59 - 3,0
12 2/3/128 ~7 недель при 1° +2+8 52 - 4,8 52 - 3,5
13 2/3/132 ~7 недель при 1° +2+8 6 - 7,2 16 - 4,4 6 - abs 16 - 4,7
14 2/3/161 ~6 недель при 1° +2+8 16 - 3,0 16 - 3,3
15 2/3/165 ~6 недель при 1° +2+8 68 - 2,9 68 - 2,5
16 2/3/167 ~6 недель при 1° +2+8 31 - 4,3 31 - 4,0
17 2/3/180 ~6 недель при 1° +2+8 45 - 6,0 Отриц.
Примечание: * - генотип ВПЧ
** - результат вирусной нагрузки указан в абсолютных цифрах, т.е. вирусная нагрузка для генотипа 52 соответствует 105,4 геномных эквивалентов на образец.
образцов, также не подтверждается. Образцы № 6 и № 7 хранились не более 4 недель при температуре +2+8, тогда как образец № 8 хранился до 12 недель. Тем не менее, амплификация ПЦР-продукта из экспериментального биоматериала в образцах 6 и 7 не удалась вовсе, а в образце 8 - частично. В образцах 13 и 14 вирусная нагрузка ДНК ВПЧ во взвеси клеток из Се1^сап даже превышает контрольную, что свидетельствует о недостоверности результатов амплификации ПЦР-продукта из среды Се1^сап, так как по протоколу ПЦР результаты проверяются путем контроля взятия материала (КВМ). Теоретически, вирусная нагрузка в экспериментальном образце не может превышать таковую в контроле.
Одной из возможных причин практически полного отсутствия конкорданса между результатами в опытной и контрольной партиях может быть
разность химического состава транспортных сред. Химический состав упоминавшихся универсальных сред, одобренных FDA, в большинстве однотипен и включает водный раствор денатурированного этанола с небольшим количеством метанола и изопропанола, и не является агрессивным для ДНК микроорганизмов [24, 25], тогда как состав CellScan неизвестен. Другое важное отличие между CellScan и жидкостными средами, одобренными FDA, заключается в разности технологий приготовления препаратов: в технологии CellScan виалы с биоматериалом помещаются в шейкер для лучшей сепарации клеток, а в одобренных FDA технологиях для этой же цели практикуется центрифугирование [26].
Результаты эксперимента по исследованию состава микробиоты влагалища из клеточной взвеси из CellScan продемонстрированы в таблице 2.
Таблица 2. Результаты исследования состава микробиоты влагалища с помощью набора Фемофлор-скрин из клеточной взвеси, выделенной из транспортной среды Се!^сап
№ Код / шифр Результат исследования биоценоза комплектом реагентов Фемофлор-скрин (контроль) Результат исследования биоценоза из взвеси клеток из среды CellScan (эксперимент)
1 2/4/89 Контроль взятия материала - 104,5 Общая бакмасса - 1052 Лактобациллы - 103,7 Облигатные анаэробы: GardnereПavaginaИs+PrevoteПaЫvia+PoIphyш-monasspp. - 1051 Контроль взятия материала - abs Общая бакмасса - 1031 Лактобациллы - не выявлено Облигатные анаэробы: не выявлено
2 2/4/90 Контроль взятия материала - 1060 Общая бакмасса - 1083 Лактобациллы - 1082 Облигатныеанаэробы: GardnereПavaginaИs+PrevoteПaЫvia+Poфhyш-monasspp. - 1040 Контроль взятия материала - abs Общая бакмасса - 1032 Лактобациллы - не выявлено Облигатные анаэробы: не выявлено
3 2/4/91 Контроль взятия материала - 104,7 Общая бакмасса - 1067 Лактобациллы - 106,6 Облигатныеанаэробы: GardnereПavaginaИs+PrevoteПaЫvia+PoIphyш-monasspp. - 1031 Ureaplasmaspp. - 103,5 Контроль взятия материала - abs Общая бакмасса - 103,6 Лактобациллы - 103,2 Облигатные анаэробы: не выявлено не выявлено
4 2/4/92 Контроль взятия материала - 105,5 Общая бакмасса - 1077 Лактобациллы - 107,7 Облигатныеанаэробы: GardnereПavaginaИs+PrevoteПaЫvia+PoIphyш-monasspp. - 1057 Ureaplasmaspp. - 1038 Контроль взятия материала - abs Общая бакмасса - 103,6 Лактобациллы - 103,3 Облигатные анаэробы: не выявлено не выявлено
5 2/4/93 Контроль взятия материала - 104,6 Общая бакмасса - 106,5 Лактобациллы - 104,5 Контроль взятия материала - abs Общая бакмасса - 103,5 Лактобациллы - не выявлено
Облигатныеанаэробы: Gardnerellavaginalis+Prevotellabivia+Porphyro-monasspp. - 1054 Ureaplasmaspp. - 103,7 Облигатные анаэробы: не выявлено не выявлено
6 2/4/95 Контроль взятия материала - 104,9 Общая бакмасса - 10м Лактобациллы - 106,4 Облигатныеанаэробы: Gardnerellavaginalis+Prevotellabivia+Porphyro-monasspp. - 1054 Ureaplasma spp. - 103,7 Mycoplasma hominis - 104,0 CMV - обнаружено Контроль взятия материала - abs Общая бакмасса - 103,3 Лактобациллы - не выявлено Облигатные анаэробы: не выявлено не выявлено не выявлено CMV - не обнаружено ШУ-2 обнаружено
7 2/4/98 Контроль взятия материала - 104,8 Общая бакмасса - 1068 Лактобациллы - 106,7 Облигатныеанаэробы: Gardnerellavaginalis+Prevotellabivia+Porphyro-monasspp. - 1035 Ureaplasma spp. - 1043 Mycoplasma hominis - 104,4 CMV - обнаружено Контроль взятия материала - abs Общая бакмасса - 1040 Лактобациллы - 103,7 Облигатные анаэробы: не выявлено Ureaplasmaspp. - 1023 Mycoplasmahominis - 102,7 CMV - необнаружено
8 2/4/99 Контроль взятия материала - 104,6 Общая бакмасса - 1051 Лактобациллы - 105,0 Ureaplasmaspp. - 1043 Контроль взятия материала - abs Общая бакмасса - 103,2 Лактобациллы - не выявлено Ureaplasmaspp. - не выявлено
9 2/4/100 Контроль взятия материала - 1057 Общая бакмасса - 1075 Лактобациллы - 103,4 Облигатныеанаэробы: Gardnerellavaginalis+Prevotellabivia+Porphyro-monasspp. - 1061 Candida spp. - 1040 Ureaplasma spp. - 1046 Mycoplasma hominis - 105,3 Chlamydia trachomatis - обнаружено Mycoplasma genitalium - обнаружено Контроль взятия материала - abs Общая бакмасса - 103,6 Лактобациллы - не выявлено Облигатные анаэробы: не выявлено Candidaspp. - не выявлено Ureaplasmaspp. - 1021 Mycoplasmahominis - 102,4 Chlamydiatrachomatis - обнаружено Mycoplasmagenitalium - необнаружено
10 2/4/102 Контроль взятия материала - 105,9 Общая бакмасса - 1081 Лактобациллы - 108,1 Облигатныеанаэробы: Gardnerellavaginalis+Prevotellabivia+Porphyro-monasspp. - 1035 Candida spp. - 1048 Ureaplasma spp. - 1051 CMV - обнаружено Chlamydiatrachomatis - обнаружено Контроль взятия материала - abs Общая бакмасса - 1033 Лактобациллы - не выявлено Облигатные анаэробы: не выявлено Candidaspp. - не выявлено Ureaplasmaspp. - не выявлено CMV - не обнаружено Chlamydiatrachomatis - не обнаружено
11 4/1/42 Контроль взятия материала - 104,3 Общая бакмасса - 105,7 Лактобациллы - 105,5 Облигатные анаэробы: Gardnerellavaginalis+Prevotellabivia+Porphyro-monasspp. - 1036 Candida spp. - 1031 Контроль взятия материала - abs Общая бакмасса - 1033 Лактобациллы - 103,2 Облигатные анаэробы: не выявлено Candidaspp. - не выявлено
12 2/1/44 Контроль взятия материала - 104,7 Общая бакмасса - 104,6 Лактобациллы - 104,5 Облигатные анаэробы: не выявлено Контроль взятия материала - 103,9 Общая бакмасса - 1031 Лактобациллы - не выявлено Облигатные анаэробы: не выявлено
13 4/1/211 Контроль взятия материала - 1049 Общая бакмасса - 1053 Лактобациллы - 104,9 Облигатные анаэробы: Gardnerellavaginalis+Prevotellabivia+Porphyro-monasspp. - 1051 Candida spp. - невыявлено Ureaplasma spp. - 1041 Контроль взятия материала - 1042 Общая бакмасса - 104,5 Лактобациллы - 104,2 Облигатные анаэробы: Gardnerellavaginalis+Prevotellabivia+Porphyro-monasspp. - 1044 Candida spp. - 1037 Ureaplasma spp. - 1034
Как следует из сводной таблицы, во всех 13 образцах КВМ в контрольном заборе соответствует требованиям, т.е. находится в пределах 104 - 106, что свидетельствует о качественном заборе материала и достоверности результатов контрольного забора. В экспериментальных образцах, полученных из взвеси клеток из CellScan, КВМ в пределах требуемого представлен только в одном образце, № 13. Как и в предыдущем эксперименте по экстракции ДНК ВПЧ, обнаружены расхождения в интерпретации между опытным и контрольными образцами: в образце № 6 в контроле выявлен CMV (качественный анализ), а в опытном образце - HSV-2, что свидетельствует о неверной идентификации вируса, т.е. некачественной амплификации ПЦР-продукта. Аналогичная ситуация в образце № 13: Candidaspp. в количестве 103,7 выявлена в опытном образце, тогда как контрольный забор материала не подтверждает ее присутствие. Во всех 13 образцах наблюдаются значительные расхождения результатов подсчета общей бакмассы: в контрольных образцах ОБМ практически вдвое выше, чем в опытных, что свидетельствует о потенциальном разрушении ДНК микроорганизмов, находящихся во взвеси клеток из CellScan.
Статистическая обработка полученных данных не представляется оправданной.
Заключение. В силу низкой эффективности экстракции ДНК ВПЧ и влагалищной микробиоты из транспортной среды CellScan и очевидного отсутствия перспектив внедрения данной
методики, решено прекратить сбор материала. Результаты этого эксперимента в целом оценены как неудовлетворительные - наблюдаются большие различия между опытными и контрольными образцами, не позволяющие реализовать методику экстракции ДНК ВПЧ и влагалищной микробиоты из жидкостной транспортной среды CellScan даже на уровне качественного анализа (в режиме да/нет). К сожалению, из-за отсутствия публикаций в мировой научной периодике по CellScan технологии провести адекватный анализ причин неудачи не представляется возможным.
Предполагаемые причины неудачи эксперимента:
1) возможно, транспортная среда CellScan для жидкостной цитологии южнокорейского производства не адаптирована к выделению ДНК ВПЧ и ДНК микробиоты влагалища;
2) особенности CellScan технологии как таковой, в частности, сбор всех присутствующих в образце клеток без центрифугирования и возможные дефекты мембранных фильтров, также могли сыграть определенную роль;
3) тот факт, что в контрольных образцах общая бакмасса практически вдвое выше, чем в опытных, свидетельствует о потенциальном разрушении ДНК микроорганизмов, вызванном, возможно, неблагоприятным для ДНК вирусов и микроорганизмов химическим составом CellScan;
4) возможно, тест-системы Фемофлор-скрин («ДНК-Технология», РФ) с заявленной аналитической
чувствительностью до 90%, выбранные для эксперимента в силу приемлемой цены и достаточной распространенности российского оборудования, не адаптированы для работы с иными клеточными носителями, кроме транспортных сред собственного производства. Во всяком случае, в мировой литературе не встречалось публикаций, описывающих применение российских тест-систем для экстракции ДНК микроорганизмов из взвеси клеток, полученных из универсальных жидкостных транспортных сред, одобренных FDA.
Список литературы:
1. Здоровье населения Республики Казахстан и деятельность организаций здравоохранения в 2015 г. - Статистический сборник Республики Казахстан. Астана, 2016: [http://www.mzsr.gov.kz]
2. Brum L, Barrionuevo-Rosas L, Albero G, Aldea M, Serrano B, Valencia S, Brotons M, Mena M, Cosano R, Munoz J, Bosch FX, de Sanjose S, Castellsague X. (ICO Information Centre on HPV and Cancer (HPV Information Centre))/ Human Papillomavirus and Related Diseases in Kazakhstan. Summary Report 2015-12-23//:[www.hpvcentre.net/statistics/reports/ KAZ.pdf.DataAccessed 23.12.2015]
3. Bekmukhambetov Y.Z., Balmagambetova S.K., Jarkenov T.A., Nurtayeva S.M., Mukashev T.Z., Koyshybaev A.K./Distribution of High Risk Human Papillomavirus Types in Western Kazakhstan -Retrospective Analysis of PCR Data//Asian Pacific Journal Cancer Prevention, - 2016 - vol. 17, no. 5. - P. 2667-72.
4. Bernard E., Pons-Salort M., Favre M., Heard I., Delarocque-Astagneau E., Guillemot D., Thiebaut A.C.M./Comparing human papillomavirus prevalences in women with normal cytology or invasive cervical cancer to rank genotypes according to their oncogenic potential: a meta-analysis of observational studies // BMC Infect Dis., - 2013 -vol. 13, no. 373. doi: 10.1186/1471- 2 3 3 4- 1 3 -373.
5. Dilip Kumar Dutta. Recent Advances in Gyne-Oncology. - 2011 - Jaipee Bros. Med. Publishers. [on-lineversion].
6. 6. Flores Y.N., Bishai D.M., Lorincz A., Shah K.V. et al./HPV testing for cervical cancer screening appears more cost-effective than Papanicolau cytology in Mexico //Cancer Causes & Control, - 2011 - vol. 22, no. 2. - P. 261-72.
7. IARCScreeningGroup/Fact-sheets/Cervix cancer/10KeyFindingsand Recommendations forEffective Cervical Cancer Screening and Treatment Programs:[http://screening.iarc.fr.fact-sheets.php.ACCP_recs_2007_factsheet_final (1). pdf. Assessed 23 May 2008].
8. WHO guidelines for screening and treatment of precancerous lesions for cervical cancer prevention. 2013: [http://apps.who.int/iris/bitstre am/10665/94830/1/9789241548694_eng.pdf.ua=1]
9. Basu P., Joshi S., Sankaranarayanan R./Human Papillomavirus (HPV) Testing for Secondary Prevention of Cervical Cancer//Cur ObstetGynecol Rep., - 2015 - vol. 4, no. 4. - P. 201-12.
10. Ronco G., Biggeri A., Confortini M., Naldoni C., Segnan N., Sideri M., Zappa M., Zorzi M., Calvia M., Accetta G., Giordano L., Cogo C., Carozzi F., Gillio T.A., Arbyn M., Mejier C.J., Snijders P.J., Cuzick J., Giorgi Rossi P./Health technology assessment report: HPV DNA based primary screening for cervical cancer precursors//Epidemiol Prev., - 2012
- vol. 36. - P. 61-72.
11. Bishop JW, Bigner SH, Colgan TJ, Husain M, Howell LP, Mcintosh KM, Taylor DA, Sadeghi M: Multicenter masked evaluation of AutoCyte PREP thin layers with matched conventional smears: Including initial biopsy results. ActaCytol 1998; 42:189-197.
12. Kjsr S.K., Munk C., Junge J., Iftner T./Carcinogenic HPV prevalence and age-specific type distribution in 40,382 women with normal cervical cytology, ASCUS/LSIL, HSIL, or cervical cancer: what is the potential for prevention?//Cancer Causes & Control, An International Journal of Studies of Cancer in Human Populations, - 2013 - vol. 25, no. 320. doi: 10.1007/s10552-013-0320-z.
13. Armstrong C./Practice Guidelines. ACOG updates guidelines on cervical cytology screening//AmerFam Physician, - 2012 - vol. 81, no. 11. - P. 1380 - 85.
14. Taoka H., Yamamoto Y., Sakurai N., Fukuda M. et al./Comparison of conventional and liquid-based cytology, and human papillomavirus testing using SurePath preparation in Japan//Human Cell, - 2010
- vol. 23. - P. 126-133.
15. Jung Eun Lee, Sunghee Lee, Heetae Lee, Yun-Mi Song, Kayoung Lee, Min Ji Han, Joohon Sung, and GwangPyoKo./Association of the Vaginal Microbiota with Human Papillomavirus Infection in a Korean Twin Cohort//PLoS One, - 2013 - vol. 8, no. 5.doi: 10.1371/journal.pone.0063514. PMCID: PMC3661536.
16. WHOInformedConsentForm:http://www.who.int/ rpc/research_ethics/informed_consent/en/
17. Papanicolaou techniques: Approved guidelines. General Laboratory Practice 15A. NCCLS, 1994.
18. Bigras G., et al. Keeping collecting device in liquid medium is mandatory to ensure optimized liquid-based cervical cytologic sampling. JournalofLowerG enitalTractDisease, Vol. 7(3), 2003:168-174.
19. Болдырева, М.Н. Особенности биоты урогенитального тракта здоровых женщин репродуктивного возраста при исследовании методом ПЦР в режиме реального времени / М.Н. Болдырева, Е.В. Липова, Д.Ю. Трофимов [и др.] // Вестник дерматологии и венерологии. - 2010. -№1.- С. 80-84.
20. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т.2: Пер. с англ./Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уильямса. -М.: Мир. 1997. - 368 с., сил.
21. David N. Fredrics, M.D., Tina L. Fiedler, B.S., and Jeanne M. Marazzo, M.D. Molecular Identification of Bacteria Associated with Bacterial Vaginosis. The NEJM, 2005, Volume 353:1899-1911, November 3, Number 18.
22. Donder G.G, Vereecken A., Bosmans E., Dekeersmaecker A., Salembier G., Spitz B. Definition of a type of abnormal vaginal flora that
is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. BJOG, 2002 Jan; 109(1):34-43.
23. Ferris M.J., Masztal A., Aldridge K.E., Fortenbeny J.D., Fidel P.L., Martin D.H. Association of Atopobiumvaginae, a recently described metronidazole resistant anaerobe, with bacrerial vaginosis. BMCInfectDis 2004; 4:5.
24. Geyer J.W., Hancock F., Carrico C., Kirkpatrick M: Preliminary Evaluation of CytoRich®: An improved automated cytology preparation. DiagnCytopathol. -1993; 9:417-422.
25. Grohs H.K., Zahniser D.J., Geyer J.W.: Standarization of specimen preparation through mono/thin-layer technology in Automated Cervical Cancer Screening. Edited by HK Grohs, OAN Husain. New York, Igaku-Shoin, 1994, pp. 176- 185.
26. Howell L.P., Davis R.L., Belk T.I., Agdigos R., Lowe J.: The AutoCyte preparation system for gynecologic cytology. ActaCytol 1998; 42:171-177.
ТУИ1Н
CELLSCAN ЦИТОЛОГИЯЛЫЩ ТАСЫМАЛ С¥ИЫК;ТЫГЫНАН АПВ ЖЭНЕ ЖЫНЫСТЫК; ИНФЕКЦИЯЛАРДЫЦ ДНК Б0Л1П ШЫГАРУ БОИЫНША ТЭЖ1РИБЕЛ1К Ж¥МЫСТЫЦ НЭТИЖЕЛЕР1
О.В. ЗАВАЛЕННАЯ1, С.К. БАЛМАГАМБЕТОВА1, Б.К. КАРИМСАКОВА1, О.Н. УРАЗАЕВ1, С.К. САХАНОВА1, С.И. КОКТОВА2, Л.М. ЯКУПОВА3, К.К. САРКУЛОВА4, Е.В. ЖОЛДЫБАЕВА5, Ж.Ж. БАЛМАГАМБЕТОВА1
'Марат Оспанов атындагы Батыс Казакстан мемлекетпк медицина университетi, Актебе, Казакстан 2Актебе аймактык перинатальдык орталыгыныц клиника-диагностикалык белiмi, Актебе, Казакстан 3Батыс Казакстан аймактык онкологиялык диспансерiнiн цитологиялык лабораториясы, Орал, Казахстан 4Актебе облыстык патология-анатомия бюросы, Актебе, Казакстан 5КР БFМ FbrnbM Комитетiнiн ¥лтгык гылыми биотехнологиялык орталыгы, Астана, Казакстан
Заваленная О.В. - FTO ПТР зертханасынын менгерушiсi, жобаньщ ага гылыми кызметкерi; Балмагамбетова С.К. - PhD докторант, гылыми жобаныц АТК^ТЖ Yйлестiрушiсi, e-mail:sau-balmagambetova@yandex.ru; Каримсакова Б.К. - м.г.к., доцент, №1 ЖТД кафедрасыныц жетекшiсi, FТЖ кенесшiсi; Уразаев О.Н. - MD,PhD, онкология жэне визуалды диагностика кафедрасыныц кауымдастырылган профессоры м.а.; Саханова С.К. - м.г.д., кауымдастырылган профессор, FTO жетекшiсi; Коктова С.И. - дэрiгер, гылыми жобаныц КГК;
Якупова Л.М. - гылыми жобаныц КРК, цитологиялык зертхана мецгерушюц Саркулова К.К. - гылыми жобаныц КРК, цитологиялык зертхана мецгерушюц Жолдыбаева Е.В. - м.г.к., генетикалык зертхана мецгерушюц Балмагамбетова Ж.Ж. - интерн-хирург, гылыми жобаныц КГК.
Макалада ПТР эдiсiмен Ресейдiц жабдыктауымен жэне тест-жYЙелерi «ВПЧ Квант-21», «Фемофлор-скрин» (вндiрушi «ДНК-технология», РФ) колдану аркылы CellScan тасымал суйыктыгынан АПВ жэне жыныстык инфекциялардыц ДНК бвлiп шыгару бойынша тэж1рибе жумысы мазмундалды. Кыскаша нэтижелерi: тексерю биоматериалыныц бiрiншi топтамасында барлык 17 улпсшде толыктай 26 АПВ генотиптерi аныкталды, бiрак сол эйелдерден алынган CellScan тасымал суйыктыгыныц тэжiрибелiк топтамасында тек кана 16 генотип табылды - 61,5%. Тэжiрибелiк биоматериалдыц улгшерш девирустык жYктеме кврсеткiшi тексерiс улгшерше мулдем сэйкессiз болып шыкты. Кынаптык микробиота ДНК бвлiп шыгару кезiнде жалпы бактериалдык масса есептеу нэтижелершщ барлык 13 Yлгiсiнде айтарлыктай дэрежеде кайшылык табылды: ОБМ тексерiс Yлгiлерiнде екi есе жогары болып кврсеплдг Ол жагдай CellScan тасымал суйыктыктагы микроагзалардыц ДНК ыктимал бYлiнуi процесш бэлк1м дэлелдеуi мYмкiн. Корытындысы: тутас алганда, осы тэжiрибе нэтижелерi канагаттанарлыксыз болып багаланды - табылган тексерю жэне тэжiрибелiк Yлгiлердiц арасында Yлкен айырмашылыктар CellScan цитологиялык тасымалы суйыктыктан АПВ жэне кынаптык микробиота ДНК бвлш шыгару эдiстемесiн сапалык талдау децгейiнде болса да (ия/жок тэртштемесшде) мумкшдшп бермейдi.
Heeisei свздер: ДНК, АПВ, ПТР, цынаптыц микробиота, CellScan технологиясы.
SUMMARY
RESULTS OF EXPERIMENTAL WORK ON HUMAN PAPILLOMAVIRUS AND GENITAL INFECTIONS DNA EXTRACTION FROM CELLSCAN CYTOLOGICAL LIQUID TRANSPORTATION MEDIUM
O.V. ZAVALENNAYA1, S.K. BALMAGAMBETOVA1, B.K. KARIMSAKOVA1, O.N. URAZAYEV1, S.K SAKHANOVA1, S.I. ^^OVA2, L.M. YAKUPOVA3, К.К. SARKULOVA4, E.V. ZHOLDYBAYEVA5, Zh.Zh. BALMAGAMBETOVA1
'West Kazakhstan Marat Ospanov State Medical University, Aktobe, Kazakhstan;
2Clinical-diagnostic department of Aktobe Regional perinatal center, Aktobe, Kazakhstan; 3Cytological lab of West Kazakhstan Regional Oncology Center, Uralsk, Kazakhstan;
"Aktobe Regional pathoanatomical bureau; 5National Center for Biotechnologies of Committee of MES RK, Astana, Kazakhstan
O.V. Zavalennaya - head of PCR SPC laboratory, senior research associate;
S.K. Balmagambetova - PhD student, senior research associate of research project, RTP coordinator;
B.K. Karimsakova - c.m.s., head of GP №1 department, advisor of RTP;
O.N. Urazayev - MD, PhD, acting associate professor of "Oncology and visual diagnosis" department;
S.K. Sahanova - d.m.s., associate professor, head of SPC; S.I. Koktova - doctor, junior research associate of research project;
L.M. Yakupova - junior research associate of research project, head of cytology laboratory;
K.K. Sarkulova - junior research associate of research project, head of cytology laboratory;
E.V. Zholdybayeva - c.m.s., head of genetic laboratory;
Zh.Zh. Balmagambetova - intern- surgeon, junior research associate of research project.
The HPV and vaginal microbiota DNA extraction from the "CellScan" liquid transportation medium, by PCR method with using «HPV Quant-21» and «Femoflor-screen» test-systems on the Russian equipment (manufacturer «DNA Technology», Russia) experiment was described in the article. Brief results: overall, in17 control samples of the first batch total 26 HPV genotypes were identified, of them in the experimental biological material obtained from the "CellScan" liquid transportation medium of the same women, only 16 were found, or 61.5%.Viral load in the experimental biomaterial did not match the control in almost none of the samples. Results of vaginal microbiota DNA extraction were the following. Significant discrepancies in the results of total bacterial masscounting were found in all 13 samples: in control samples total bacterial mass was almost twice higher than in the test ones, which indicated the potential destruction of the microorganisms'DNApresented in the cell suspension from the "CellScan". Conclusion: the results of this experiment should be considered not satisfactory - due to large differences between the experimental and control samples that did not allow to implement HPV and vaginal microbiota DNA extraction from liquid transportation medium "CellScan" even at the level of qualitative analysis (mode yes/no).
Key words: DNA, HPV, PCR, vaginal microbiota, CellScan technology.
