CC BY
34
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН
2006, том 49, №1
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 581.1.581.143
Г.О.Мирзохонова, Н.Н.Назарова, член-корреспондент АН Республики Таджикистан К.А.Алиев СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ГОРМОНОВ И УГЛЕВОДОВ НА ТРАНСЛЯЦИОННУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЛИРИБОСОМ И ПОЛИ (А) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ МРНК У РЕГЕНЕРАНТОВ КАРТОФЕЛЯ
Познание молекулярно-физиологических механизмов адаптации растений в связи с изменением условий внешней среды и их способности адекватно реагировать на эти изменения требует точной и оперативной экспрессии многих генов. С изменением интенсивности синтеза белков и их качественного состава происходят адаптационные перестройки в растении в ответ на действие температурного фактора [1,2]. При этом количественное изменение мРНК в клетке напрямую зависит от частоты транскрипции генов и от их процессинга в цитоплазме [2,3].
Период полужизни индивидуальных мРНК в клетках растений в зависимости от процесса полиаделинирования может варьировать от нескольких минут до нескольких часов, поскольку нуклеотидная группа КЭП на 5'-конце и поли (А)-последовательности на З'-конце защищают мРНК (эукариотических клеток) от деградации эндонуклеазами. Наличие поли (А)-последовательностей и их количество также является элементом вторичной структуры и внутренней стабильности мРНК [5,6].
Известно, что неспецифическое увеличение трансляционной активности полисом под воздействием обезвоживания связано с увеличением доли тяжелых полисом [5]. Вместе с тем обнаружено, что увеличение трансляционной активности полисом в условиях холода и обезвоживания коррелирует с усилением экспрессии гена субъединицы а-фактора элонгации трансляции [6]. В других работах показано, что стабильность мРНК значительно меняется под влиянием света и засухи у проростков пшеницы [7].
Таким образом, можно предположить, что модуляция стабильности мРНК в стрессовых условиях является одним из главных факторов системы адаптации растений. Состояния мРНК и трансляционная активность разных классов полирибосом могут в определенной степени влиять на реализацию потенциала продуктивности растений.
Учитывая вышесказанное, мы провели работу по изучению влияния гормонов и углеводов на трансляционную активность полирибосом и поли (А)-последовательностей мРНК регенерантов картофеля в связи с их продуктивностью в системе in vitro.
Методика
Работу проводили на регенерантах картофеля (Solanum tuberosum). Растения выращивали на культуральной среде МС с различной модификацией [8].
Выделение РНК проводили следующим образом: 0,5г образца (пробирочных растений) растирали в стерильной фарфоровой ступке с 2 мл экстрагирующего буфера (3 М NaCl, 0,3 М дигидрат цитрата натрия) и переносили в микропробирку Eppendorf
(1,5 мл), нагревали 5 мин и быстро охлаждали на льду (0°...-1°С). Сразу же добавляли 1/2 объема насышенного фенола и 1/2 объема хлороформа. Тщательно перемешивали на «Вортексе» и помещали в холодильник на 3-4 часа, далее центрифугировали 5 мин при 14000 об/мин и осторожно отбирали водную фазу. Фенол-хлороформовую очистку повторяли еще один раз с добавлением 1/2 объема изоамилового спирта и центрифугировали для отделения водной фазы. Водную фазу осторожно отделяли и РНК осаждали 3 объемами холодного этилового спирта. Суммарную РНК отделяли центрифугированием в течение 10 мин при 14000 об/мин. Осадок промывали чистым холодным ацетоном, высушивали и растворяли РНК в стерильной дистиллированной воде.
Поли (А)-содержащие мРНК определяли в ходе двухстадийной аффинной хроматографии на поли (У)-Сефарозе. Поли (А)++ мРНК элюировали при 60°С от поли(А)+ мРНК (однократная очистка)-элюированием при 30°С с буфером (0,1м трис-HCl, рН 7.8, 0,012М MgCh). Соотношение молекул мРНК с короткими и длинными поли(А)-последовательностями на З'-конце определяли в ходе термального ступенчатого элюирования с колонки поли (У)-Сефарозы при температуре 30°С и 60°С соответственно. Содержание РНК определяли исходя из пропорции 22,0 Е2540’5=1мг РНК.
Полисомы выделяли из пробирочных растений, используя для гомогенизации Трис-HCl буфер рН 7,8, содержащий 150 мМТрис, 40 мМКС1, 20 мМMgCh, 5 мM дитри-этанол (ДДТ), 200 мМ сахарозы, 0,1% тритон Х-100. Для анализа брали 200 мг растений и гомогенат изолировали с двумя объемами Трис-HCl буфера при 3°С, затем сразу же центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость наносили на линейный градиент (15-30%) концентрации сахарозы и центрифугировали при 35000 об/мин в течение 180 мин в роторе SW 41 Ti (Becman). Седиментационные профили полисом получали путем измерения поглощения при 254 нм с использованием проточной кюветы на спектрофотометре (ISCO). Процент полисом и рибосом определяли по соотношению площадей соответствующих пиков, занимаемых на градиенте концентрации сахарозы.
В таблицах и на рисунках приведены средние арифметические значения из 3-х повторностей и их средние ошибки.
Результаты и обсуждение
Разделение суммарной РНК с помощью ступенчатой аффинной хроматографии на поли (У)-Сефарозе позволило оценить долю поли (А)++- и поли (А)+- последовательностей мРНК от общей суммы РНК клеток при различных условиях культивирования регенерантов в условиях in vitro. Этот показатель достаточно полно отражает уровень эффективности экспрессии той или иной группы генов в зависимости от условий культивирования и генотипа.
Как видно из данных рис.1, характер изменения поли (А)-содержащих мРНК по мере формирования клубней в условиях in vitro не одинаков. На начальных этапах инициации столонов доля поли (А)+- последовательностей мРНК выше, чем поли (А)++ мРНК. В период закладки и активного роста клубней наблюдается увеличение доли поли (А)++ мРНК. Количество поли (А)+ содержащих мРНК в эти периоды клубнеобразо-
85
вания не изменяется. Следовательно, можно сказать, что на разных этапах формирования клубней проявляют активность разные по набору группы генов. В период инициации столонов и закладки клубней активную роль играют группы генов с короткими поли (А)+- последовательностями мРНК. В фазе интенсивного роста участвуют другие гены с большим набором поли (А)++- последовательностей мРНК.
К такому выводу мы пришли на основании использования метода ступенчатой термальной элюции с колонки поли (У)-Сефарозы, поскольку при температуре 30° С элюируются молекулы мРНК с короткими поли (А)- последовательностями, а при 60°С молекулы с относительно длинными поли (А)--последовательностями. Характер изменения поли (А)-содержащих мРНК показал, что степень их вариации под действием гормонов специфична для каждого сорта.
о ,1
— п
< £ 0,08
3 “ с о_
° 2 0,06 с О =
£ I 0.04 *
о. ^ а> х
4 о_ 0,02 ° Е О
0
1. 2. 3. 4 . 1. 2. 3. 4
Фаза инициации клубней
Рис.1. Изменение поли (А)-содержащих компонентов РНК в ходе роста клубней регенерантов картофеля в условиях in vitro (сорт Жуковский ранний).
Фаза инициации клубней: 1 - 20-дневные пробирочные растения; 2 - начало образования столонов (фаза столонообразования); 3 - начало закладки клубней (фаза инициации); 4 - активный рост клубней (фаза роста). I - поли (А) +; II - поли (А) ++.
Характер изменения поли (А)-содержащих мРНК у исследованных сортов (Жуковский ранний, Пикассо, Кардинал) почти не имеет отличий, но количественное различие между этими сортами выражено более существенно. Если отношение поли (А)++ к поли (А)+ в фазе активного роста у сорта Жуковский ранний составляет 8,2, то у сортов Пикассо и Кардинал оно равняется 5,6 и 4,2 соответственно. Возможно, степень поли-аденилирования мРНК зависит от сорта и длительности вегетационного периода сорта. Сорт Жуковский ранний относится к ранним, Пикасо к среднеранним, а Кардинал к среднепоздним сортам.
Добавление гормонов и углеводов в культуральную среду приводит к увеличению содержания поли (А)-последовательностей в разной степени (табл.1).
Таблица 1
Действие гормонов на содержание РНК у регенерантов картофеля сорта Жуковский
ранний
Варианты опыта Суммарное содержание РНК (мкг/г сырого веса) Поли (А) РНК (мкг/г сыр. веса), элюции при Отношение поли (А) ++ к поли (А)+ % мРНК от общей РНК Масса клубней на растении, мг
30°С 60°С
Кон- троль (5% сахаро- зы) 11,3±1,7 0,089 0,029 0,4 - 97±21
+0,5мг/л НУК 20,4±3,8 0,068 0,560 8,2 3,6 462±43
+0,2мг/л кинетина 22,8±4,2 0,068 0,111 1,4 1,1 289±22
+0,5мг/л НУК+0,2 мг/л кинетина 25,7±5,8 0,077 0,420 5,9 2,2 471±47
Имеются сведения, что длина поли (А)-последовательностей у мРНК определяет морфогенетическую потенцию растений [7]. Кроме того, длина поли (А)-последовательностей играет важную роль в стабилизации мРНК и трансляционной активности: чем длиннее последовательность поли (А), тем устойчивее мРНК и тем выше трансляционная активность [9], т.е. является энхансером трансляции.
В некоторых работах отмечена существенная роль гормонов в трансляционной активации растений [10-12].
Мы изучали влияние гормонов (НУК, ИУК, кинетина) на степень полиаденили-рования мРНК регенерантов картофеля в системе in vitro. Гормоны, вносимые в культуральную среду, в оптимальных концентрациях с одновременным добавлением сахарозы в оптимальной концентрации (5%) не одинаково стимулируют процесс полиадени-лирования мРНК (табл.2).
Отношение поли (А)++- к поли (А)+-последовательностям мРНК у контрольного варианта составляет 0,4. Добавление кинетина в культуральную среду незначительно повышает отношение этих форм мРНК и соответствует 1,4, при добавлении НУК в культуральную среду отношение поли (А)++- к поли (А)+-последовательности составляет 8,2, а при совместном использовании кинетина и НУК в культуральной среде это значение несколько увеличивается и составляет 5,9. Следует особо отметить, что степень по-лиаденилирования мРНК под действием гормонов зависит от наличия в культуральной среде углеводов (5%). Напротив, при отсутствии или низкой концентрации углеводов (1-2%) в культуральной среде степень полиаденилирования мРНК остается низкой, т.е. доля длинных поли (А)++-последовательностей не увеличивается даже в фазе активного роста клубней. Обшее содержание поли (А) РНК колеблется от 1 до 3% в зависимости
от наличия гормонов при оптимальной концентрации сахарозы (5%), необходимой для активного клубнеобразования.
Таблица 2
Содержание полирибосом и поли (А)-содержащих РНК у различных генотипов картофеля
в зависимости от содержания углеводов и гормонов
Варианты опыта Полирибосомы, % Сумарное содержание поли (А) РНК (мг/г сыр. веса)
Сорт Жуковский ранний
+Кинетин (0,2мг/л +5% сахароза) 61,8 0,944±0,049
+Кинетин (0,2мг/л +9% сахароза) 50,4 0,084±0,013
+НУК (0,5мг/л +5% сахароза) 65,0 0,991±0,074
+НУК (0,5мг/л + 9%сахароза) 42,2 0,053±0,017
Сорт Кардинал
+ Кинетин (0,2мг/л 5% сахарозы) 66,6 0,837±0,029
+Кинетин (0,2мг/л+ 9%сахароза) 53,7 0,073±0,016
+НУК (0,5мг/л +5% сахароза) 59,9 0,897±0,049
+НУК (0,5мг/л +9% сахароза) 32,7 0,053±0,012
КМ-растения*
+Кинетин (0,2мг/л +5% саха-роз+) 60,3 0,389±0,022
+Кинетин (0,2мг/л+ 9% сахароза) 40,7 0,037±0,013
+НУК (0,5мг/л+ 5% сахароза) 57,7 0,543±0,071
+НУК (0,5мг/л+ 9%сахароза) 30,9 0,084±0,019±
* КМ-растения (клеточно-моди жцированные растения)
Одним из способов оценки состояния белоксинтезирующего аппарата в растениях является определение соотношения полирибосом и рибосом в отдельности, что характеризует соотношение скоростей инициации и элонгации при синтезе белка. Добавление в культуральную среду гормонов и углеводов в разных соотношениях может влиять на трансляционную активность посредством формирования различных по размеру полисом. В табл.2 представлены результаты по определению доли полирибосом в препаратах рибосом в различных условиях культивирования регенерантов картофеля. Можно видеть, что при изменении углеводного статуса и неизменной концентрации
гормонов (НУК, кинетин) в период активного роста клубней у регенерантов происходит сушественное изменение доли полирибосом, которая колеблется от 30% до 68% в зависимости от генотипа и концентрации сахарозы. При повышении концентрации углеводов до 9% в культуральной среде у всех генотипов картофеля происходит диссоциация большой части полирибосом. Усиление диссоциации полирибосом наблюдается во всех вариантах эксперимента при высокой концентрации углеводов, особенно при наличии в культуральной среде НУК.
Формирование полирибосом в присутствии кинетина несколько выше, чем при добавлении НУК. У всех генотипов картофеля (Жуковский ранний, Кардинал, КМ-растения) не удалось заметить существенных изменений в трансляционной активности полирибосом у различных генотипов. Общее содержание поли (А) РНК также сильно уменьшается при высокой концентрации сахарозы в культуральной среде выращивания. Между сортами таких существенных различий по содержанию поли (А) не наблюдалось.
На рис.2 представлен характерный профиль распределения в градиенте концентрации сахарозы полирибосом, выделенных из регенерантов картофеля. Можно видеть гетерогенное распределение полирибосом и характерные для рибосом пики при центрифугировании в градиенте концентрации сахарозы.
Рис.2. Распределение полирибосом в градиенте концентрации сахарозы (10-30%, центрифугирование 180 мин. при 35 тыс. об./мин, ротор SW-41ti).
Таким образом, представленные в работе данные свидетельствуют о том, что в процессе инициации и роста клубней в системе in vitro функционируют разные по длине поли (А)-последовательности мРНК. Их трансляционная активность зависит от наличия гормонов в культуральной среде выращивания регенерантов. Активация полирибо-сомной системы также зависит от наличия в среде выращивания гормонов, действие которых регулируется дозой углеводов.
Следует отметить, что действие углеводов оказалось более сложным, чем мы предполагали. При увеличении концентрации углеводов в культуральной среде происходит резкое уменьшение содержания в клетке поли(А)-последовательностей мРНК, усиливается диссоциация полирибосом. Нарушение посттранскрипционного процесса не компенсируется дозой гормонов. Возможно, нормальный ход транскрипционного и трансляционного процесса в клетке регулируется определенным соотношением гормонов и углеводов, нарушение которого приводит к изменению экспрессии генов. Кроме того, обнаруженный ранее [13] факт обратной зависимости действия гормонов и углеводов на инициацию дифференцировки стволовых клеток и полученные результаты о разной экспрессии генов в онтогенезе растений свидетельствуют о том, что активация морфогенетической потенции стволовых клеток начинается с накоплением физиологически значимой дозы гормонов и углеводов в клетке.
Работа выполнена при поддержке ФАО-ООН (грант ORSO/TAJ/401/CAN). Институт физиологии растений и генетики Поступило 22.11.2005 г.
АН Республики Таджикистан
ЛИТЕРАТУРА
1. Thomashov M.F. - Plant Physiol. 1998, v.118, p.1-7.
2. Плотников В.К. - Успехи соврем. биол. 1992, т.112, с.186-199.
3. Johnson M.A., Baker E.J., Colbert J.T., Green P.J. - Mechanisms determing mRNA Stability and Translation in Plants/Egs. Bailey-Serres J., Gallie D.R.N.Y.: Amer. Soc. Plant Physiol. 1998, р.40-53.
4. Gutierrez R.A., Gustavo C.M., Green P.J. - Trends Plant Sci. 1999, v.4, p.429-438.
5. Ryazanov A.G., Rudkin B.B., Spirin A.S. - FEBS Lett. 1991, v.285, p.170-175.
6. Толкачева Т.В. Карпычев Н.В., Эльдаров М.А., Скрябин К.Г. - Мол. биол. 1996, т.30, с.1002-1014.
7. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Сметанин Д.В. - Физиология растений, 2000, т.47, с.203-209.
8. Назарова Н.Н., Давлятназарова З.Б., Мирзохонова Г.О., Каримов Б.К., Алиев К.А. ДАН РТ. 2004, т.47, №11-12, с.92-102.
9. Morelli J.K., Shewmaker Ch.K., Vayda M.E. - Plant Physiol. 1994, v.106, p.897-903.
10. Алиев К.А. Молекулярные механизмы биогенеза фотосинтетического аппарата растений, Душанбе: Дониш, 1998, 72 с.
11. Альбертс Б., Брей Д., Пьюне ДЖ., Рэфф М.,Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. М.: Мир, 1998, т.2, с.313 (с.234).
12. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Новиков Б.Н., Алексеенко Ж.В. - Генетика, 1998, т.34, с.969-883.
13. Мирзохонова Г.О., Давлятназарова З.Б., Назарова Н.Н., Алиев К.А. - ДАН РТ. 2004, т.47, № 11-12, с.70-79.
Г.О.Мирзохонова, Н.Н.Назарова, К.А.Алиев ОМУХТАНИ ТАЬСИРИ ГОРМОННО, КАРБОГИДРАТ^О БО ФАЬОЛИЯТИ ТРАНСЛЯЦИОНИ ПОЛИРИБОСОМ^О ВА МИКДОРИ ПОЛИ (У) мРНК-и РАСТАНИИ Solanum tuberosum
Дар ин мак;ола нишондода шудааст, ки микдори мРНК ва полирибосомх,о дар зери назорати гормонно буда, фаьолияти инх,о аз микдори карбогидратх,ои дар хучайра буда вобастагии зич дорад.
G.O.Mirzochonova, N.N.Nazarova, K.A.Aliev STADY OF HORMONES IN FLUENCES ON TRANSLATION ACTIVITY OF POLYRIBOSOMES AND POLYA SUGENCES mRNA OF THE REGENERANTES OF POTATOES
Those results showed that during in vitro initiation and grow of tubers this presses are implemented by different size of poly-A sequences of the mRNA translation activity of both poly mRNA depends on presence of hormones.
