CC BY
88
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН _________________________________2008, том 51, №6____________________________
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 581.1.581.143
С.А.Файзиева, С.Н.Наимов, член-корреспондент АН Республики Таджикистан К.А.Алиев ПОСТТРАНСКРИПЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ КАЛЛУСОВ ПШЕНИЦЫ И ЭГИЛОПСА in vitro
Ранее нами было показано, что дифференцировка столоновых клеток начинается с накопления физиологически значимой дозы углеводов и гормонов в клетке и этот процесс можно регулировать на уровне питательных веществ в культуре in vitro картофеля [1]. При увеличении концентрации углеводов в культуральной среде наблюдается уменьшение содержания в клетке поли(А)-последовательностей РНК и диссоциация полирибосом [2]. Было показано, что частоту транскрипции генов определяет количество мРНК в клетке [3]. Период полужизни мРНК в клетках растений зависит от интенсивности полиаденилирования и варьирует от нескольких минут до нескольких часов, и это является характеристикой вторичной структуры и стабильности мРНК [4]. В других работах показано, что стабильность и функционирование мРНК значительно меняется под влиянием абиотических факторов у проростков пшеницы [5]. Вышеперечисленные работы указывают на то, что модуляция стабильности вторичных структур посредством варьирования поли(А)-последовательностей мРНК может являться одним из факторов адаптации растений и, возможно, играет важную роль в процессе регенерации в культуре in vitro.
Особое место в исследовании механизмов каллусогенеза и органогенеза занимает изучение экспрессии РНК, посттранскрипционной активности генов, поскольку эти вопросы практически не изучены у дикорастущих злаковых растений и пшеницы, что явилось задачей настоящей работы.
Методы исследования
Для эксперимента были использованы пшеница сорта Стекловидная-24 и эгилопс (Aegilops cylindrica Host).
Для культуры каллуса из незрелых зародышей использовали общепринятую методику. Для этого культуру каллусной ткани получали из незрелых зародышей пшеницы и эги-лопса на среде Мурасиге и Скуга (МС), содержащей 7 г/л агара, 20 г/л сахарозы, 0.2-2.0 мг/л 2.4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2.4-Д) и 0.2 мг/л кинетина. Для индукции морфогенеза каллусную ткань переносили на среду МС, содержащую 0.5 мг/л НУК и/или 1 мг/л кинетина. В некоторых экспериментах кинетин заменяли на 6-БАП (1.0 мг/л). Среда для морфогенеза
не содержала 2.4-Д. Формирование каллусогенеза происходило через 20-30 дней, органообразование через 3-4 месяца у пшеницы, а у эгилопса через 5-6 месяцев культивирования.
Среда для каллусогенеза: 0.1 мг/л НУК; 0.5 мг/л кинетин или 6-БАП; 0.2 мг/л 2.4-Д.
Среда для регенерации: 0.5 мг/л НУК; 0.1 мг/л кинетин или 6-БАП; 10 мг/л глютамин;
0.5 фолиевая кислота.
Выделение РНК проводили следующим образом: 0.5 г образца (регенерантов) растирали в стерильной фарфоровой ступке с 2 мл экстрагирующего буфера (3 М NaCl, 0.3 М дегидрат цитрата натрия) и переносили в микропробирку Eppendorf (1.5 мл). Содержимое пробирки перемешивали на “Вортексе” в течение 30 сек, нагревали в течение 5-10 мин в термостате при 60°С и быстро охлаждали на льду (0°...-1° С). Сразу же добавляли / объема насыщенного фенола и / объема хлороформа. Тщательно перемешивали на “Вортексе” в течение 30 сек и помещали в холодильник на 5 мин, далее центрифугировали 15 мин при 12000 об./мин на центрифуге Eppendorf и осторожно отбирали верхнюю водную фазу (450-500 мкл). Фенол-хлороформовую очистку повторяли еще один раз с добавлением / объема изо-амилового спирта, тщательно перемешивали, 5 мин выдерживали во льду и центрифугировали 5 мин при 12000 об./мин на центрифуге для отделения водной фазы. Водную фазу отделяли и РНК осаждали тремя объемами холодного 70% этилового спирта. Суммарную РНК отделяли центрифугированием в течение 5 мин при 12000 об./мин. Осадок промывали чистым холодным ацетоном, тщательно перемешивали на “Вортексе”, центрифугировали 5 мин, супернатант удаляли. Пробирку помещали в термостат при 60° на 5 мин для испарения ацетона. Осадок (РНК) растворяли в стерильной дистиллированной воде. Для лучшего растворения осадка пробирку выдерживали 3-5 мин при 60°С. Осторожно перемешивали на “Вортексе”. Раствор РНК хранили при -30°С (набор препаратов для выделения РНК из растительных тканей RNA-ExtraPhen).
Поли(А)-содержащие мРНК определяли в ходе двухстадийной аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе. Поли(А)++ мРНК элюировали при 600С от поли(А)+ мРНК (однократная очистка) - элюированием при 30°С буфером (0.1м трис-HCl, рН 7.8, 0.012 М MgCl2). Соотношение молекул мРНК с короткими и длинными поли(А)- последовательностями на 3'-конце определяли в ходе термального ступенчатого элюирования с колонки по-ли(У)-сефарозы при температуре 30°С и 60°С соответственно. Содержание РНК определяли исходя из пропорции 22.0 Е2540'5 = 1 мг РНК.
Результаты и их обсуждение
Как видно из данных табл. 1, содержание стабильной РНК в каллусах эгилопса примерно в два раза ниже, чем у пшеницы. У пшеницы (контрольный вариант) содержание РНК и поли(А)-фракции было выше, чем у эгилопса.
Следует отметить, что содержание общей фракции РНК и фракции поли(А) заметно варьировало у эгилопса и пшеницы в зависимости от соотношения ауксинов и цитокининов. Культура каллуса эгилопса больше реагирует на содержание ауксинов, чем на присутствие в культуральной среде цитокинина. Если при добавлении в культуральную среду каллусогенеза НУК содержание общей фракции РНК составляло 12.3 мкг/мг каллуса, то при добавлении кинетина ее содержание несколько уменьшалось. Аналогичная зависимость также имела место при определении содержания поли(А)-фракции РНК у эгилопса в процессе органогенеза. Так, содержание поли(А)-РНК при добавлении в среду каллусогенеза НУК составляло примерно 0.67% от общей фракции РНК, а при добавлении в среду культивирования цитокинина ее содержание было несколько ниже и составляло примерно 0.47%. Таким образом, эти результаты дают основание говорить об ауксиновой экспрессии РНК у диких форм злаковых растений.
Несколько другая зависимость обнаружена у пшеницы. Более высокий уровень содержания РНК в каллусах пшеницы обнаружен при культивировании каллусов в среде, содержащей кинетин. Содержание поли(А)-фракции РНК при добавлении в среду культивирования цитокинина составляло 5.5 мкг/мг каллуса или 1.05%, а при добавлении ауксина содержание поли(А)-РНК было несколько ниже и составляло 4.1 мкг/мг каллусов или 0.82%, то есть культурные формы злаковых растений (пшеница) являются более зависимыми от цито-кинина, чем от ауксина.
Таким образом, на уровне каллусогенеза эгилопса и культурных форм (пшеница) выявлена разная зависимость от фитогормонов: каллусогенез эгилопса является более зависимым от ауксина, а пшеницы - от цитокинина.
Следует отметить, что добавление 2.4-Д как агента, индуцирующего каллусогенез, вызывает ингибирование экспрессии разных фракций РНК как у дикорастущих злаковых растений, так и у пшеницы. Добавление в питательную среду 2.4-Д направляет, по-видимому, экспрессию определенных генов, вызывающих только лишь образование однотипных клеток, то есть каллусов. Переход каллусных клеток к дифференцировке требует участия новых инициирующих компонентов, таких как изменение соотношения ауксинов и цитокининов, добавление в среду культивирования органических кислот, амидов и, главное, - исключение из среды гормона ауксинового типа - 2.4-Д.
Следует отметить, что образование эмбриоидных структур и формирование нормальных растений требует наличия как цитокинина, так и ауксина. Но эти гормоны по-разному действуют на содержание как стабильной РНК, так и поли^)-фракции РНК, так же, как в варианте с каллусогенезом эгилопса - при дифференцировке каллусных клеток с образованием физиологических органов, более зависимым от наличия в культуральной среде ауксина (табл. 1, 2). При добавлении в среду органогенеза ауксина содержание общей РНК и ее по-ли^)-фракции гораздо выше, чем в варианте с цитокинином. Если фракция поли^^РНК при добавлении ауксина в среду органогенеза эгилопса соответствует примерно 0.6% от общего содержания РНК клеток, то при наличии в среде цитокинина ее содержание несколько ниже и составляет 0.4%. Таким образом, при дифференцировке каллусных клеток у эгилопса наблюдалась ауксин-зависимая экспрессия компонентов РНК, но несколько слабее выраженная, чем при каллусогенезе (табл. 2).
Несколько иная картина наблюдалась при дифференцировке каллусных клеток у пшеницы. Дифференцировка каллусных клеток с образованием различных органов и ростовые процессы больше зависят от наличия цитокинина и меньше от ауксина. Высокая степень зависимости органогенеза от ауксина и/или цитокинина не наблюдалась, но содержание различных фракций РНК при органогенезе было в 2.З-3 раза выше, чем при каллусогенезе. Вместе с тем, если при каллусогенезе у пшеницы имела место большая зависимость от цитоки-нина, то в процессе органогенеза такой четкой зависимости от использованных в эксперименте гормонов (НУК и кинетин) не наблюдалось. Содержание активной формы РНК (информационной) - поли^)-содержащей РНК составляло от 8.0 до 10.0 мкг/мг в зависимости от наличия фитогормонов в культуральной среде. Общее содержание поли^)-содержащей РНК при наличии кинетина и НУК в культуральной среде составляло 10.2 мкг/мг сырой массы ростков. При добавлении в среду только ауксина содержание поли^^РНК составляло 7.9 мкг/мг, а при добавлении только кинетина - 8.1 мкг/мг сырой массы ростков, то есть кинетин и НУК примерно одинаково вызывали экспрессию поли^)-содержащих РНК в процессе органогенеза пшеницы (1.4%).
Различие в действии ауксинов и цитокининов на экспрессию разных фракций РНК в каллусогенезе и органогенезе может свидетельствовать о независимом влиянии этих двух гормонов на экспрессию различных фракций РНК в процессе каллусогенеза и органогенеза у представителей дикорастущих злаковых растений.
Следует также отметить, что в процессе органогенеза у пшеницы наблюдалась аукси-но-цитокининовая зависимость экспрессии разных фракций РНК, в том числе
Таблица 1
Содержание различных фракций РНК в каллусах эгилопса и пшеницы в зависимости
от наличия в культуральной среде фитогормонов (стадия каллусообразования)
Общая РНК, мкг/мг сыр. массы Поли (А)-РНК, мкг/мг сыр. массы Поли(А)-РНК, %
Эгилопс
А-К- + 2.4-Д (контроль) 7.3±1.7 0.22±0.03 0.30
А+К+ 14.5±1.8 0.67±0.05 0.46
А+К- 12.3±1.2 0.83±0.04 0.67
А-К+ 10.1±1.1 0.42±0.04 0.47
Пшеница
А-К- + 2.4-Д (контроль) 16.4±2.3 0.93±0.05 0.58
А+К+ 34.4±4.7 6.52±0.2 1.20
А+К- 50.3±2.4 4.12±0.3 0.82
А-К+ 54.7±4.2 5.50±0.3 1.05
Примечание: А-К- - среда МС без фитогормонов, с 2.4 -Д,
А+К+ - среда МС с ауксином, с кинетином,
А"К+ - среда МС с кинетином, без ауксина (НУК),
А+К" - среда МС с ауксином, без кинетина (цитонинин).
Таблица 2
Содержание различных фракций РНК в каллусах эгилопса и пшеницы в зависимости
от наличия в культуральной среде фитогормонов (стадия органообразования)
Общая РНК, мкг/мг сыр. массы Поли(А)-РНК, мкг/мг сыр. массы ^5 К, Н Р - < и( л о По
Эгилопс
А-К- + 2.4-Д (контроль) 12.3±2.2 0.45±0.08 0.36
А+К+ 27.2±2.7 1.28±0.02 0.72
А+К- 25.9±2.3 1.08±0.05 0.56
А-К+ 20.6±2.2 0.88±0.07 0.42
Пшеница
А-К- + 2.4-Д (контроль) 32.4±2.3 1.83±0.05 1.1
А+К+ 64.5±5.4 10.2± 1.4 1.6
А+К- 56.9±5.2 7.9±1.4 1.4
А-К+ 59.3±5.5 8.1±0.3 1.4
фракции поли(А)-содержащих РНК. Поли(А)-фракции РНК при образовании генеративных органов у пшеницы почти одинаково экспрессировалась при добавлении в культуральную среду как ауксина (НУК), так и цитокинина (кинетин или 6-БАП) и составляла примерно 1.4% от общего содержания РНК в клетке. Вместе с тем, общее содержание поли (А)-фракций РНК было примерно в два раза больше у пшеницы, чем у эгилопса в фазе образования вегетативных органов, а также при каллусогенезе (табл. 3).
Таблица 3
Содержание суммарной РНК и поли(А)-содержащих РНК у эгилопса и пшеницы
Генотип Суммарная РНК, мкг/г сыр. массы каллуса Поли(А)-РНК, мкг/г сыр. массы каллуса Поли(А)-РНК, %
Каллусогенез
Эгилопс 20.2±2.5 0.092±0.3 0.02
Пшеница 32.3±5.4 0.5±0.3 0.06
Органогенез
Эгилопс 36.2±5.1 1.42±0.3 3.9
Пшеница 64.5±5.5 4.2±1.1 6.2
Как видно из данных табл. 3, по содержанию поли(А)-содержащих РНК эгилопс и пшеница существенно отличаются. Причем в органогенезе содержание РНК гораздо выше, чем на стадии каллусогенеза. Анализ этих данных указывает на то, что образование поли(А)-содержащих РНК является одним из факторов морфогенетической активности каллусной культуры in vitro, который зависит от наличия ауксинов и цитокининов в среде культивирования эксплантов растений (табл. 3).
Можно предположить, что в среде, содержащей ауксин и цитокинин (0.5 мг/л НУК и 1 мг/л кинетина), активность генома связана с транс-факторами, связывающимися с регуляторными последовательностями ДНК.
Возможно, гормоны, взаимодействуя с транс-факторами, вызывают подавление экспрессии одних генов и активацию других на участке промотора, находящегося в регуляторной области ДНК. Необходимо проведение дальнейших специальных исследований гормонозависимой экспрессии генов у злаковых растений.
Институт физиологии растений и генетики Поступило 30.04.2008 г.
АН Республики Таджикистан
ЛИТЕРАТУРА
1. Мирзохонова Г.О., Давлятназарова З.Б., Назарова Н.Н., Алиев К.А. - ДАН РТ, 2004, т. XLVII , №11-12, с. 70-79.
2. Мирзохонова Г.О., Назарова Н.Н., Алиев К.А. - ДАН РТ, 2004, т. 49, № 1, с. 84-91.
3. Плотников В.К. - Успехи соврем. биологии, 1992, т. 112, с.186-199.
4. Толкачева Т.В., Карпычев Н.В., Эльдаров М.А., Скрябин К.Г. - Молекулярная биология, 1996, т.30, с. 1002-1014.
5. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Сметанин Д.В. - Физиология растений, 2000, т. 47, с. 203-209.
С.А.Файзиева, С.Н.Наимов, ^.А.Алиев ФАЪОЛИЯТИ ПОСТТРАНСКРИПТСИОНИИ КАЛЛУСХ,ОИ ГАНДУМ ВА ЭГИЛОПС in vitro
Яке аз сабабхои каллусогенез ва морфогенези растанихои галладонагй (гандум ва эгилопс) аз пайдо шудани намудхои гуногуни РНК вобастагй дорад. Нишон дода шудааст, ки микдори намуди РНК-и информатсионй - поли(А)-РНК дар хучайрахои каллусй, эмбриоидй ва регенерантхо гуногун буда, аз хормонхои дар махлули сабзиш истифодабурда шуда вобаста аст. Дар хучайрахои каллусй поли(А)-РНК - 0.8%, дар хучайрахои эмбриоидй - 1.4%, дар хучайрахои регенерантй - то 3%-ро ташкил мекунад.
S.A.Fayzieva, S.N.Naimov, K.A.Aliev POSTTRANSCRIPNIONAL ACTIVITY OF CALLUS CULTURE OF WHEAT AND AEGILOPS
Initiation of callusogenesis and morphogenesis in the cereals (wheat and aegilops) depends on type of RNA. Is shown then value of m-RNA - poly (A)-RNA in the calluses cell of emryoides and regenerates are different on depends of plants hormones has been used.
