CC BY
87
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН ___________________________________2007, том 50, №2_____________________________
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.1.581.143
Г.О.Мирзохонова, член-корреспондент АН Республики Таджикистан К.А.Алиев СИНТЕЗ БЕЛКОВ В РАСТЕНИЯХ-РЕГЕНЕРАНТАХ КАРТОФЕЛЯ В ПРОЦЕССЕ РОСТА И КЛУБНЕОБРАЗОВАНИЯ in vitro
Нами ранее было показано, что при снятии действия водного дефицита на растения картофеля рибосомы ассоциируются с мРНК. Было выдвинуто предположение, что ассоциация и диссоциация полисом носят адаптивный и генотипический характер. При создании водного дефицита у одних генотипов происходило разрушение полисом, у других полисомы мигрировали в область низких концентраций градиента сахарозы [1]. В этих условиях были получены качественные и количественные характеристики белков растений-регенерантов картофеля, мигрирующих при центрифугировании в градиенте концентрации сахарозы [2].
Нами на регенерантах картофеля изучается влияние гормонов на трансляционную и транскрипционную активность, синтез белков при воздействии кинетина и а-нафтилуксусной кислоты (а-НУК) при культивировании регенерантов картофеля в условиях in vitro. Предполагается, что в зависимости от воздействия гормонов и в поцессе развития может активироваться экспрессия различных групп генов, ответственных за инициацию столоно-клубнеобразования in vitro.
Целью настоящей работы является исследование электрофоретической подвижности белков и транскрипционной активности в зависимости от добавки кинетина, а-НУК в процессе развития растений-регенерантов картофеля in vitro.
Методика
Объектом исследования служили температуроустойчивые растения-регенеранты картофеля (Solarium tuberosum L.), полученные на основе сорта Жуковский ранний [3]. В качестве контрольного варианта использовали исходный сорт Жуковский ранний и температуроустойчивые растения-регенеранты (ТУ-растения-регенеранты), полученные нами ранее [3].
Растения обоих вариантов размножали клонированием in vitro на среде Мурасиге и Скуга (МС), содержащей витамины, агар, сахарозу [4]. Растения культивировали при +20.. ,+22°С и 16-часовом освещении люминесцентными лампами белого цвета (60 Вт/м).
Меристемные растения выращивали на питательной среде МС в течение 20-25 дней при 16-часовом фотопериоде и освещении 6000 люкс. Для опытов брали растения, достигшие высоты 5-7 см.
В опытах анализировали по 50 растений в 3-кратной повторности. На рисунках и таблицах приведены усредненные значения всех опытов.
Выделение белков. Суммарные белки выделяли из побегов пробирочных растений картофеля, выращенных in vitro. Белки выделяли с использованием буфера, содержащего 50 мМ Трис рН 8.2, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ дитриотола, 3% сахарозы. Материал быстро растирали в фарфоровой ступке с добавлением (1мл) буфера на холоде и центрифугировали при 14 000
об./мин в течение 10 мин в микроцентрифуге-320а.Супернатант нагревали 3 мин в водяной бане, затем быстро охлаждали и центрифугировали для отделения осадка. Супернатант использовали для электрофореза.
Концентрацию белков определяли по Бредфорду [5] с использованием красителя ку-масси G-250 (Serva). В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин. Спектрометрические измерения проводили на приборе LKB Ultrospek-II (Швеция) при 595 нм. При электрофорезе наносили одинаковое количество белка (50 мкг).
Электрофорез белков. Суммарный электрофорез белков пробирочных растений проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии 0.1% додецильсульфата натрия (ДДС-Na) по методу Лэммли [6] на приборе для электрофореза (США) модели 4027, с охлаждением Мультитемп II (Швеция), источник питания модели 2197 LKB (Швеция). Электрофорез проводили в вертикальном приборе при напряжении 200 В, постоянной силе тока 50 мА. Перед нанесением образцы белков нагревали 2-3 мин в кипящей водяной бане и центрифугировали при 14000 об./мин в течение 5 мин. Гель фиксировали в 10% трихлоруксусной кислоте (ТХУ) и окрашивали 0.05% кумасси R250 («Sigma») в 40% этаноле, содержащем 10% уксусной кислоты. Гель отмывали 7% уксусной кислотой 2-3 раза. В качестве маркеров использовали: РНК-азу (12.1 кД), карбоангидразу (29 кД), овальбумин (45 кД), альбумин (67 кД). Все реактивы от фирмы «Sigma», США.
Выделение РНК. 0.5 г образца пробирочных растений растирали в стерильной фарфоровой ступке с 2 мл экстрагирующего буфера (3 М NaCl, 0.3 М дигидрат цитрата натрия) и переносили в микропробирку Eppendorf (1.5 мл), нагревали 5 мин и быстро охлаждали на льду (0°. -1°С). Сразу же добавляли У объема насыщенного фенола и У объема хлороформа. Тщательно перемешивали на «Вортексе» и помещали в холодильник на 3-4 ч, далее центрифугировали 5 мин при 14000 об./мин и отбирали водную фазу. Фенол-хлороформовую очистку повторяли еще один раз с добавлением У объема изоамилового спирта и центрифугировали для отделения водной фазы. Водную фазу отделяли и РНК осаждали тремя объемами холодного этилового спирта. Суммарную РНК отделяли центрифугированием в течение 10 мин при 14000 об./мин. Осадок промывали чистым холодным ацетоном, высушивали и РНК растворяли в стерильной дистиллированной воде.
Поли (А)-содержащие мРНК определяли в ходе двухстадийной аффинной хроматографии на поли (и)-Сефарозе. Содержание РНК определяли исходя из пропорции 22.0 Е2540 5=1мг.
Р е з у л ь т а т ы и и х о б с у ж д е н и е
Белки на ПААГ-е распределялись в диапазоне от 10 до 90 кД, что соответствует результатам работы [7], проведенной на микроклубнях картофеля. Анализ белков позволил выявить некоторые различия в вариантах с использованием кинетина и НУК. Эти различия между вариантами обнаружились в отношении белков с молекулярной массой 22, 27, 53, 70, 90 кД, интенсивность которых менялась в зависимости от наличия в культуральной среде ки-нетина или НУК.
В этих условиях было выявлено 3 группы белков, состоящих из 2-3 компонентов с молекулярной массой 22 кД, 27 кД, 50 кД и 70 кД (табл. 1).
Таблица 1
Белки, синтезируемые растениями-регенерантами in vitro
Rf М.м., кД Сорт, линии
ТУ-растения- регенеранты Жуковский ранний Пикассо Кардинал
l 2 l 2 l 2 l 2
0.l3 l00 - - - - + + + +
0.l5 90 + + + + + + + + + + + + + +
O.l6 84 - + - + - + - +
O.l7 80 - + - + - + - +
O.l9 78 + + + + + + + + + -
0.24 70 + + + + + - + + + + + + + +
0.22 67 + - + - + - + -
0.25 58 + + + + + + + +
0.30 50
0.32 48 + + + + + + + + + + + + +
0.35 44 + + + + + + + +
0.40 34
0.58 27 + + + + + + + + + + + + + + +
0.56 23
0.55 22 + + + + + + - + +
0.63 l7
0.70 l2 + + + + + + + +
0.72 l0 + + + + + + + +
1. НУК; 2.
инетин
На электрофореграмме (рис.) отчетливо видны белковые компоненты с молекулярной массой 53, 70, 78, 27, 22 кД. Интенсивность окраски этих белковых зон неодинакова в разных фазах развития растений. Эти белковые зоны более интенсивны в фазе столоно-клубнеобразования по сравнению с фазой роста растений. В фазе столоно-
клубнеобразования появились ряд других белковых компонентов, которые были не заметны в фазе роста растений. К ним относятся белки с молекулярной массой 45 и 29 кД и белки с молекулярной массой 57кД. Эти данные указывают на то, что набор белковых компонентов в фазе роста растений существенно отличается от набора белков в фазе столоно-клубнеобразования, на которой появляются дополнительные белковые компоненты, характерные только для фазы столоно-клубнеобразования (табл. 1).
Для всех этапов развития растений in vitro характерен стабильный синтез двух белковых компонентов, относящихся к 53 кД и 27 кД. Белок с молекулярной массой 53 кД, видимо, относится к большой субъединице ключевого фермента фотосинтеза - рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/ оксигеназы (Рубиско), а белок с молекулярной массой 27 кД - характерный для картофеля белок-потатин.
Таблица 2
Содержание РНК в зависимости от наличия в культуральной среде фитогормонов и фазы
развития растений картофеля сорта Жуковский ранний in vitro (мкг/г сырой массы)
Условия опыта Суммарная РНК Поли (А) РНК % мРНК
Контроль 10.7 ± 1.1 0.076 ± 0.05 0.7
Кинетин: фаза роста 22.4 ± 1.7 0.82± 0.07 3.6
фаза столоно-клубнеобразования 22.9 ± 2.2 0.95 ± 0.09 4.2
НУК: фаза роста 20.7 ± 1.8 0.86 ± 0.07 3.8
фаза столоно-клубнеобразования 20.9 ± 1.8 0.95 ± 0.08 4.5
Изменения белковых компонентов при электрофорезе в условиях денатурации, видимо, обусловлены изменениями на уровне синтеза РНК, особенно фракций поли (А)-содержащих РНК.
Как видно из данных табл. 2, содержания суммарной РНК растений картофеля резко возрастают при добавлении в культуральную среду фитогормонов цитокинина и ауксина. В этих условиях содержания суммарной РНК возрастают примерно в 2 раза. Общее содержание РНК в условиях фитогормонального воздействия в фазе роста и фазе столоно-клубнеобразования было практически одинаковым.
Вместе с тем, следует отметить, что увеличение содержания фракций поли (А)-содержащих РНК наблюдается в фазе столоно-клубнеобразования. Это, очевидно, указывает на то, что в фазе столоно-клубнеобразования происходит инициация активности новых групп генов и, следовательно, синтез белков, регулирующих процесс столоно-клубнеобразования.
Таким образом, изменения в наборе белковых компонентов обусловлены изменением активации транскрипционной системы клетки и зависят от фазы развития растений-регенерантов. Содержание мРНК колеблется от 0.5% в контрольном варианте до 4.5% в присутствии фитогормонов цитокинина (кинетин) и ауксина (а-НУК).
Имеются сведения, что длина поли (А)-последовательностей мРНК обуславливает в определенной мере морфогенетическую потенцию растений [8]. Длина поли (А)-последовательностей играет важную роль в стабилизации мРНК и трансляционной активности: чем длиннее последовательность поли (А), тем устойчивее мРНК и тем выше трансляционная активность [9], что является регулятором трансляции.
Таким образом, в данной работе впервые исследована белоксинтезирующая способность регене-рантов картофеля in vitro при гормональном воздействии и в процессе микроклубнеобразования. Полученные результаты свидетельствуют о том, что у рас-тений-регенерантов картофеля проявляется способность интенсифицировать активность трансляционной и транскрипционной системы при добавке в культуральную среду фитогормонов. Состав белков и интенсивность их синтеза в регенерантах в условиях in vitro существенно меняются и зависят от транскрипционной активности. Содержание мРНК колеблется от 0.7 до 4.5% от общей РНК клетки в зависимости от условий культивирования.
Работа поддержана Президентским фондом фундаментальных исследований
Институт физиологии растений и генетики Поступило 14.09.2006 г.
АН Республики Таджикистан
ЛИТЕРАТУРА
1. Мирзохонова Г.О., Давлятназарова З.Б., Назарова Н.Н., Алиев К.А. - ДАН РТ, 2004, т.XLVII, № 11-12, с.70-79.
Рис. Разделение суммарных белков растений-регенерантов в ПААГ-е в денатурирующих условиях.
1, 4 - фаза роста микроклубней,
2, 3 - фаза столоноклубнеобразования
2. Мирзохонова Г.О., Назарова Н.Н., Алиев К.А. - ДАН РТ, 2006, т.49, № 1, с.84-91.
3. Давлятназарова З. Б., Алиев К.А., Бабаджанова М.П., Авганова Х.Х. - ДАН РТ, 2003, № 5-6, с.61-69.
4. Методические рекоменднации - Под редакцией А.Г. Шаповал ВНИИ ПМБиГ. М., 1985, 16 с.
5. Bradford M.M. - Anal. Biochem, 1976, v.72, p.248-254.
6. Laemmli U.K. - Nature, 1970, v.227, p.680-685.
7. Rajapakse D.P., Imal T., Ishige T. - Potato Research, 1991, v.34, p. 285-293.
8. Плотников В.К., Бакалдина Н.Б., Сметанин Д.В. - Физиология растений, 2000, т. 47, с.203-209.
9. Morelli Z.K., Shewmaker Ch.K., Vayda M.E. - Plant Physiology, 1994, v.106, p.897-903.
Г.О.Мирзохонова, ^.А. Алиев СИНТЕЗИ САФЕДАХО ДАР РЕГЕНЕРАНТИ КАРТОШКА ДАР ^АРАЕНИ САБЗИШ ВА ЛУНДААНДОЗИИ in vitro
Синтези сафедах,ои вазни молекулавии гуногун дошта дар шароити сабзиши регенерантх,о гуногун мебошанд. Фаъолияти цараени трансляционй аз микдори фитох,ормонх,о зич вобаста буда, аз шароити сабзиш дигаргун мешавад. Муайян гардид, ки микдори мКРН дар растаних,о аз 0.7 то 4.5% -ро ташкил медихдд.
G.O.Mirzokhonova, K.A.Aliev SYNTHESIS PROTEINS OF PLANTS-REGENERANTS OF POTATOES IN PROCESS TUBERATION in vitro
In the given work for the first time is investigated protein-synthesis ability regenerants of potatoes in vitro in conditions hormonal of influence and microtuberation. The received results speak that the plants - regenerates of potatoes have ability intensification translation and transcription system at the additive in cultural medium hormones. Synthesis protein, which are capable to carry out regenerates in conditions in vitro quantity and quality essentially varies and depends from transcription activity. The contents mRNA changes from 0.7 up to 4.5% from general RNA of a crate depending on conditions cultivation.
