CC BY
44
УДК 579.262:578.4
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОМОВ БАКТЕРИОФАГОВ Р22-ТИПА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ПРЕПАРАТОВ, МОДИФИЦИРУЮЩИХ ИММУННУЮ СИСТЕМУ, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МОЛОДНЯКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ COMPARATIVE STUDY OF THE GENOMES OF P22 TYPE BACTERIOPHAGES FOR DRUG DEVELOPMENT THAT MODIFY THE IMMUNE SYSTEM, FOR THE TREATMENT OF YOUNG POULTRY
Зимин Андрей Антонович, к.б.н.,
Василенко Олег Викторович, к.б.н.,
Институт биологии и физиологии микроорганизмов
им. Г. К. Скрябина РАН, Российская Федерация, г. Пущино
Кононенко Сергей Иванович, д.с.-х.н.,
Скобликов Николай Эдуардович, к.м.н.,
Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства, Российская Федерация, г. Краснодар Назипова Нафиса Наиловна, к.ф.-м.,н. Институт математических проблем РАН - филиал Института Прикладной математики РАН, Российская Федерация, г. Пущино
Zimin Andrej Antonovich, Cand. Biol. Sci., Vasilenko Oleg Viktorovich, Cand. Biol. Sci., Skryabins Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Pushchino, Russia Kononenko Sergey Ivanovich, Dr. Agr. Sci., Skoblikow Nikolaj Jeduardovich, Cand. Med. Sci., North-Caucasus Research Institute of Animal Husbandry, Krasnodar, Russia
Nazipova Nafisa Nailovna, Cand. Phis.-math. Sci., Institute of Mathematical Problems of Biology RAS - the Branch of Keldysh Institute of Applied Mathematics of Russian Academy of Sciences Pushchino, Russia
Аннотация: изучено биоразнообразие геномов фагов Р22-типа. Установлены пределы вариабельности геномов этой груп-
пы. На основе этого сделан задел для определения планов выделения новых бактериофагов этого типа для их использования в иммуномоделирующей фаговой терапии. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научных проектов № № 16-44-230855-р_а, 17-44-500145, 15-07-05783.
Ключевые слова: цыплята; гусята; кишечная микрофлора; E.coli; сальмонеллезы; бактериофаги; возрастная динамика.
Abstarct: the biodiversity of the P22-type phage genomes was studied. The limits of variability of genomes of this group were defined. We have made a reserve on the basis of this for plans of P22-type phage isolation for use in immuno-modeling phage therapy of young poultry. The reported study was partially supported by RFBR, research projects No. No. 16-44-230855-р_а, 17-44-500145, 15-0705783.
Key words: goslings; chicken; intestinal microflora; E.coli; salmonellosis in poultry; bacteriophages; age dynamics.
Сальмонельные инфекции являются одной из наиболее распространенных причин болезней пищевого происхождения в России, а ряд штаммов могут колонизировать кишечный тракт сельскохозяйственной птицы. Контроль сальмонелл у птицы имеет решающее значение для снижения заболеваемости саль-монеллезом у людей. Иммунный ответ у куриц можно модифицировать применением фагов Р22-типа. Ранее было показано влияние фага Р22 на иммунную систему с участием макрофагов HD-11 при ответе куриной иммунной системы, как на внутриклеточное, так и на межклеточное развитие бактерий S.typhimurium LT2. В данном исследовании оценивали ответ куриных макрофагов (HD-11) и влияние фага P22 на вне- и внутриклеточное развитие штамма LT2. Было проведено 4 опыта по экспериментальному заражению птицы LT2. (1) HD-11 клетки в качестве контроля, (2) HD-11 клетки с LT2, (3) HD-11 клетки с LT2 и Р22, а также (4) HD-11 клетки с Р22. Уровень интерлейки-на 8 измеряли с помощью ELISA. Кроме того, с помощью QRT-PCR были определены уровни экспрессии генов четырех цито-кинов (ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, и гамма-интерферона) в присутствии LT2 и / или Р22 . Оказалось, что фаг P22 лизировал как вне-, так и внутриклеточные LT2, которые были сорбированы макро-
фагами HD-11. С помощью ELISA было выявлено, что макрофаги HD-11 производят значительно больше интерлейкина 8 в присутствии Р22. Эти результаты коррелировали с измерением уровня транскрипции соответствующего гена с помощью QRT-PCR [1]. Было бы интересным использовать другие, родственные Р22 бактериофаги для модификации и усиления иммунного ответа сельскохозяйственной птицы. В этой работе проведено сравнение опубликованных геномов фагов, родственных Р22 для оценки вариабельности этих вирусов в природе и выбора новых фагов для усиления иммунного ответа на сальмонеллы у сельскохозяйственной птицы.
Методика. Кладистический анализ поведен с помощью метода Neighbor-Joining [2]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с помощью программы JSpecies v.1.2.1 [3]. Построение дерева было проведено с помощью пакета программ MEGA6 [4]. Было проведено сравнение генома бактериофага Р22 с таксономической группой геномов хвостатых бактериофагов из базы данных Genbank.
Для дальнейшего анализа нами были отобраны из результатов работы программного средства BLASTp 15 геномов. (P22 -TPA: Enterobacteria phage P22, Sp25 - Salmonella phage 25, Sp34 -Salmonella phage 34, Phi20 - Enterobacteria phage UAB_Phi, sal5 -Salmonella Phage 103203_sal5, sal4 - Salmonella phage 103203_sal4, Phi75 - Enterobacteria phage Phi75, SPN9CC - Salmonella phage SPN9CC, SEN22 - Salmonella phage SEN22, ep34 -Salmonella phage epsilon34, g341c - Salmonella phage g341c, Emek - Salmonella phage vB_SemP_Emek, ST160 - Salmonella phage ST160, ST104 - Enterobacteria phage ST104 DNA, SE1 - Salmonella phage SE1.)
Полногеномный филогенетический анализ вирусов был выполнен на основе дистантного подхода через вычисление средней идентичности нуклеотидов (ANI), как мы это делали ранее [5]. Первоначально этот метод был описан для сравнения геномов прокариот, но не содержит фундаментальных ограничений применения, поэтому мы с успехом используем его в сравнительной геномике вирусов.
Кратко, cреднюю идентичность нуклеотидов для каждой пары фаговых геномов вычисляли с применением бласт-
алгоритма (ANIb, в процентах) программой JSpeciesv.1.2.1 [3]. Матрицу значений ANIb преобразовывали в таблицу межгеномных дистанций, по которой строили филогеномное дерево статистическим методом "присоединения соседа" [2] при помощи пакета программ MEGA 6 [4].
Результаты исследований и их обсуждение. Результаты сравнения геномов представлены в виде таблицы 1 межгеномных дистанций, дерево не представлено. Очевидно, что вирусы группируются в ряд кластеров с близкородственными геномами. Полученное дерево содержало две основные ветви. Это была ветвь фагов близких к Р22 и ветвь фагов близких к бактериофагу epsilon34.
Наиболее родственными к Р22 оказались две пары практически идентичных фагов Phi20-Phi75 и Sp25-Sp34, далее была удалена от Р22 пара sal4-sal5 и ветвь трех фагов ST104,ST160 и SE1, фаг SPN9CC образовал отдельную подветвь.
Близкородственные фаги g341c и epsilon34 вместе с фагами Emek и SEN22 образовали другую ветвь, удаленную от Р22-ветви.
Таблица 1 - Таблица эволюционных расстояний основных кластеров геномов бактериофагов_
P22 ST104 SE1 sal5 Emek ep34 Phi75
ST104 93,41
SE1 92,71 97,68
sal5 98,55 95,56 93,06
Emek 91,4 92,72 93,83 89,09
ep34 89,99 92,49 91,92 87,31 94,85
Phi75 98,94 94,29 93,87 97,4 90,85 89,75
SPN9 92,12 95,16 94,72 96,13 92,16 91,44 92,3
В таблице 1 цифрами обозначен процент сходства. Названия бактериофагов сокращены. А именно: P22 - сальмонеллез-ный фаг Р22, ST104 - бактериофаг энтеробактерий ST104, SE1 -сальмонеллезный фаг SE1, sal5 - сальмонеллезный фаг 103203_sal5, Emek - сальмонеллезный фаг vB_SemP_Emek, ep34
- сальмонеллезный фаг epsilon34, Phi75 - бактериофаг энте-робактерий Phi75, SPN9 сальмонеллезный фаг SPN9CC.
Выводы. Для терапевтических исследований однозначно можно считать перспективными фаги: Phi20, Phi75, Sp25, Sp34, sal4, sal5, ST104, ST160 и SE1.
Учитывая близость всех геномов этих фагов друг к другу с высокой уверенностью можно ожидать выделение перспективных для иммуномоделирующей терапии бактериофагов при исследовании экологии ЖКТ молодняка сельскохозяйственной птицы. Хотя сам бактериофаг Р22 нельзя применять на практике. Р22 с высокой эффективностью трансдуцирует гены, включая гены патогенности болезнетворных бактерий, но поиск среди родственных нетрансдуцирующих бактериофагов может принести интересный, перспективный для применения в терапии результат.
Списоклитературы
1. Ahn J, Biswas D. Influence of bacteriophage P22 on the inflammatory mediator gene expression in chicken macrophage HD11 cells infected with Salmonella Typhimurium. FEMS Microbiol Lett. 2014 Mar; 352 (1): 11-7.
2. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic 1. trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425.
3. Richter M, & Rossello-Mora R (2009) Shifting the genomic gold standard for the prokaryotic species definition. Proc Natl Acad Sci USA 106(45): 19126-31.
4. Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, and Kumar S MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Molecular Biology and Evolution (2013) 30: 2725-2729.
5. Зимин, А.А., Кудрявцева, А.В., Василенко, О.В.,Салямов, В.И., Летаров, А.В. , Летарова, М.А. , Куликов, Е.Е. , Скобликов, Н.Э. Сравнительная геномикаТ4-подобных бактериофагов (Myoviridae, Caudovirales), выделенных из желудочно-кишечного тракта свиней. Материалы 2й Пущинской школы-конференции "Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов" - 2015 г. - С. 132-134.
