CC BY
15
УДК 579.262:578.4
СРАВНИТЕЛЬНО-МОЛЕКУЛЯРНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ ХВОСТОВЫХ ШИПИКОВ ФАГОВ
Р22-ТИПА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МОЛОДНЯКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ
ПТИЦЫ
COMPARATIVE STUDY OF MOLECULAR VARIABILITY OF P22-TYPE PHAGE TAILSPIKE PROTEINS FOR THE DEVELOPMENT OF DRUGS FOR TREATMENT OF YOUNG
POULTRY
Зимин Андрей Антонович, к.б.н.,
Институт биологии и физиологии микроорганизмов
им. Г. К. Скрябина РАН, Российская Федерация, г. Пущино
Кононенко Сергей Иванович, д.с.-х.н.,
Скобликов Николай Эдуардович, к.м.н.,
Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства, Российская Федерация, г. Краснодар Назипова Нафиса Наиловна, к.ф.-м.н. Институт математических проблем РАН - филиал Института Прикладной математики РАН, Россия, г. Пущино Zimin Andrej Antonovich, Cand. Biol. Sci., Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Pushchino, Russia Kononenko Sergey Ivanovich, Dr. Agr. Sci., Skoblikow Nikolaj Jeduardovich, Cand. Med. Sci., North-Caucasus Research Institute of Animal Husbandry, Krasnodar, Russia
Nazipova Nafisa Nailovna, Cand. Phis.-math. Sci.,
Institute of Mathematical Problems of Biology RAS - the Branch of
Keldysh Institute of Applied
Mathematics of Russian Academy of Sciences, Pushchino, Russia
Аннотация: изучена эволюция белков хвостовых шипи-ков подовирусов сходных с Р22. Показана высокая консервативность этих белков у фагов, заражающих бактерии разных таксонов. Сформирован подход к разработке терапевтических средств для борьбы с болезнями молодняка сельскохозяйственной пти-
цы. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научных проектов № № 16-44-230855-р_а, 17-44500145, 15-07-05783.
Ключевые слова: гусята; кишечная микрофлора; E.coli; бактериофаги; возрастная динамика.
Abstarct: the evolution of tail spike proteins of podoviruses similar to P22 was studied. The high conservatism of these proteins in phages that infect bacteria of different taxa was shown. It was formed the approach to the development of therapeutics to combat the disease of young poultry. The reported study was partially supported by RFBR, research projects No. No. 16-44-230855-р_а, 1744-500145, 15-07-05783 и 13-04-00991.
Key words: goslings; chicken; intestinal microflora; E.coli; bacteriophages; age dynamics
Одной из основных причин заболеваемости и смертности у человека и экономически важных животных являются бактериальные инфекции желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [1]. Появление трудно поддающихся лечению инфекций, в первую очередь, вызванных устойчивыми к антибиотикам бактериями, требует альтернативы антибиотикотерапии.
В настоящее время одним из основных терапевтических альтернатив является применение литических бактериофагов [2]. Однако не только сами бактериофаги, но и фаговые белки могут являться терапевтическими агентами. Недавно было исследовано применение белкового шипика хвоста бактериофага Р22 (Р22ШХ), как антибактериального средства [3]. Шипик хвоста бактериофага Р22, идентичен липополисахаридам Salmonella enterica serovar Typhimurium. В качестве антибактериального средства был использован укороченный вариант Р22ШХ. Белок Р22ШХ был исследован при пероральном введении курам. Р22ШХ приводил к агглютинации S. typhimurium. Р22ШХ был устойчив к трипсину и частично химотрипсину, но чувствителен к пепсину. Тем не менее, в сформулированной форме для перо-рального введения, Р22ШХ был устойчив ко всем трем проте-азам. При пероральном введении цыплятам, Р22ШХ значительно снижал колонизацию в кишечника сальмонеллами и их дальнейшее проникновение во внутренние органы. Выделение новых
бактериофагов, родственных Р2 может дать в руки исследователей новые варианты Р22ШХ, обладающих новыми прогрессивными свойствами для их использования в качестве терапевтических агентов против сальмонеллезов, как кур, так и других животных и человека.
В этой работе мы провели сравнение белков Р22ШХ, кодируемых опубликованными геномами бактериофагов, родственными Р22, для оценки вариабельности этих белков в природе и выбора новых агентов для антибактериальной терапии.
Методика. Кладистический анализ поведен с помощью метода Neighbor-Joining [4]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с помощью программы MEGA6. Построение дерева было проведено с помощью пакетов программ MEGA, MEGA4 и MEGA6 [5].
Результаты исследований и их обсуждение. С помощью программы BLAST был проведен сравнительный анализ белка хвостового шипика бактериофага Р22 с базой данных Genbank (даты обращения 03 - 05 03.2016).
Из результата работы данной программы была сделана выборка а.к. последовательностей, имевших по результату экс-пект ниже - 20. Последовательности, имеющие высокое сходство были удалены из файла, предназначавшегося для дальнейшего анализа. Данная выборка была использована для последующего множественного выравнивания и построения на его основе эволюционного дерева с помощью пакета Mega шестой версий. Полученное дерево содержало две основные ветви. Это была ветвь фагов очень близких к Р22 и ветвь фага CVT22.
Наиболее родственными белку хвостового шипика фага Р22 оказались белки фагов SPN9CC, ep34, Emek, SE1, PHI20 CUS-3, далее были удалены от Р22 три белка фагов SU552A, BcepC6B и Eldri, фаг Arya энтеробактера образовал отдельную подветвь. Обращает на себя внимание различие в таксономической принадлежности хозяев фагов. Это, вероятно говорит об исключительной консервативности данного белка в эволюции. Наличие близких по последовательности белков у фагов разных бактерий, в том числе сходных шипиков фагов грам-отрицательных и грам-положительных бактерий позволяет предположить горизонтальный перенос генов.
Выводы. В результате исследования была выявлена высокая консервативность белка хвостового шипика подовирусов Р22-типа.
Можно предположить, что его ген транслоцировался в достаточно удаленные геномы фагов. Это новые данные, полезные для общего понимания становления фагового разнообразия и применения белка шипиков хвостового отростка подовирусов в терапии. Клонирование генов шипиков, получение супер-подуцентов данных белков, испытание этого агента на циплятах может обеспечить получение нового таксоно-специфичного антибактериального средства.
Список литературы
1. Зимин, А.А. Использование бактериофагов для борьбы с колибактериозом и кампилобактериозом в птицеводстве / А.А. Зимин, Ф.В. Кочетков, С.И. Кононенко, Д.В. Осепчук, Н.Э. Скобликов // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. 2016, № 123. - С. 421-432. - http://ej.kubagro.ru/2016/09/pdf/29.pdf
2. Скобликов, Н.Э. Оптимальная схема применения не-трансдуцирующих бактериофагов e. coli для профилактики постотъемной диареи поросят / Н.Э. Скобликов, С.И. Кононенко, А.А. Зимин // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2012. - № 37. - С. 169-173.
3. Waseh, S, Hanifi-Moghaddam P, Coleman R, Masotti M, Ryan S, Foss M, MacKenzie R, Henry M, Szymanski CM, Tanha J. Orally administered P22 phage tailspike protein reduces salmonella colonization in chickens: prospects of a novel therapy against bacterial infections. PLoS One. 2010 Nov 22; 5(11):e13904.
4. Saitou, N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425.
5. Tamura, K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, and Kumar S MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Molecular Biology and Evolution (2013) 30: 2725-2729.
