CC BY
25
УДК 579.262:578.4
МОЛЕКУЛЯРНАЯ КЛАСТЕРИЗАЦИЯ БЕЛКА КАПСИДА БАКТЕРИОФАГОВ Р22-ТИПА, ИСПОЛЬЗУЮЩИХСЯ
ДЛЯ РАЗРАБОТКИ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ТЕРАПИИ МОЛОДНЯКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ MOLECULAR CLUSTERING OF CAPSID PROTEINS OF P22-TYPE BACTERIOPHAGES, USED TO DEVELOP DRUGS FOR TREATMENT OF YOUNG POULTRY
Зимин Андрей Антонович, к.б.н.,
Институт биологии и физиологии микроорганизмов
им. Г. К. Скрябина РАН, Российская Федерация, г. Пущино
Скобликов Николай Эдуардович, к. м. н.
Кононенко Сергей Иванович, д. с.-х. н.
Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства, Российская Федерация, г. Краснодар Ян. Цоунги, д. филос., Университет Тайчжоу, Тайчжоу, КНР Назипова Нафиса Наиловна, к ф.-м.,н. Институт математических проблем РАН - филиал Института Прикладной математики РАН, Российская Федерация, г. Пущино Zimin Andrej Antonovich, Cand. Biol. Sci.,
Skryabin's Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Pushchino, Russia
Skoblikow Nikolaj Jeduardovich, Cand. Med. Sci.,
Kononenko Sergey Ivanovich, Dr. Agr. Sci.,
North-Caucasus Research Institute of Animal Husbandry, Russia,
Krasnodar,
Yang Zoungi, PhD.
Taizhou University, Taizhou, China
Nazipova Nafisa Nailovna, Cand. Phis.-math. Sci.,
Institute of Mathematical Problems of Biology RAS - the Branch of
Keldysh Institute of Applied
Mathematics of Russian Academy of Sciences, Pushchino, Russia
Аннотация: методами биоинформатики изучена молекулярная кластеризация основного белка капсида бактериофагов
родственных сальмонеллезному бактериофагу Р22. Установлены основные кластеры-группы бактериофагов данного типа, характеризующиеся наиболее выраженными различиями в последовательности этого белка. На основе множественного сравнения последовательностей изучены подходы к молекулярному анализу фагов, выделяемых в лаборатории микробиологии СКНИИЖ из фекалий молодняка сельскохозяйственной птицы. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научных проектов № № 16-44-230855-р_а, 17-44-500145, 15-0705783 и 13-04-00991.
Ключевые слова: гусята; цыплята; кишечная микрофлора; E.coli; сальмонеллезы птицы, бактериофаги; возрастная динамика.
Abstarct: molecular clustering of major capsid protein of bacteriophages related to Salmonella phage P22 was studied by methods of bioinformatics. It was established the major clusters-groups of phages of this type, characterized by the most pronounced differences in the sequence of the protein. On the basis of multiple sequence comparisons were studied approaches to molecular analysis of phag-es isolated in the microbiology laboratory of NCRIAH from faeces of young poultry. The reported study was partially supported by RFBR, research projects No. No. 16-44-230855-р_а, 17-44-500145, 15-0705783 и 13-04-00991.
Key words: goslings; chicken; intestinal microflora; E.coli; salmonellosis in poultry, bacteriophages; age dynamics.
Для современной пишевой промышленности необходим поиск альтернативных подходов к инактививации патогенных бактерий. В последние годы большой интерес для этой цели вызывают бактериофаги, которые способны контролировать рост бактерий [1]. Бактериофаги были признаны в качестве возможной альтернативой антибиотикам в терапии животных, а также средством биоконсервации и, наконец, в качестве инструмента для обнаружения патогенных бактерий [2, 3]. Они являются вирусами, которые заражают и убивают бактериальные клетки. Их круг хозяев очень разнообразен, и некоторые из них специфичны для узкого спектра бактериальных штаммов, в то время как другие имеют широкий круг хозяев. Их применение может по-
мочь предотвратить инфекции пищевого происхождения, вызванные такими микроорганизмами, как сальмонелла, кампило-бактерии, кишечная палочка, листерии и другие [4, 5]. Бактериофаг Р22, хотя и не применим на практике, так как является эффективным трансдюсером генетической информации, но подходит в качестве модели для исследования. Ранее было показано, что обработка с помощью Р22 мокрых куриных яиц, зараженных сальмонеллами 104 КОЕ / мл, приводит к их обеззараживанию за счет фаголизиса. Эффективно и сочетание обработки фагом вместе с другими природными противомикробными агентами (например, бактериоцинами) [6]. Для более точных экспериментов, конечно необходимо снизить уровень загрязнения сальмонеллами (например, до 102 КОЕ / мл). Такие условия более реалистичны. Необходимо опробовать и другие родственные Р22 фаги. Для этого необходим выбор гена маркера. В данной работе начато изучение основного белка капсида этих фагов для последующего применения его гена в качестве маркера ПЦР. Мы провели множественное выравнивание мажорных компонентов капсида, кодируемых опубликованными геномами бактериофагов, родственными Р22, для оценки вариабельности этих белков в природе и выбора гена-маркера для анализа выделяемых из фекалий птицы фагов.
Методика. Кладистический анализ был поведен с помощью метода Neighbor-Joining [7]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с помощью программы JSpecies v.1.2.1 [8]. Построение дерева было проведено с помощью пакетов программ MEGA, MEGA4 и MEGA6 [9].
Результаты исследований и их обсуждение. С помощью программы BLAST был проведен сравнительный анализ белка капсида бактериофага Р22 с базой данных Genbank. Из результата работы данного программного средства была сделана выборка а.к. последовательностей, имевших по результату экс-пект ниже - 30. Последовательности, имеющие между собой очень высокое сходство, были делетированы из файла, предназначавшегося для дальнейшего анализа.
Данная выборка была использована для построения множественного выравнивания и результирующего эволюционного
дерева с помощью пакетов Mega первой, четвертой и шестой версий.
Для анализа были взяты капсидные белки фагов P22, SPN9, ep34, Emek, SEI, IME10, RSK1, Sf101, PVA1, H6/1 и белок MSP. Происхождение использованных белков согласно данным из Genbank было следующее: P22 - Salmonella phage 22, SPN9 -Salmonella phage SPN9CC, ep34 - Salmonella phage epsilon34, Emek - Salmonella phage vB_SemP_Emek, SE1 - Salmonella enterica bacteriophage SE1, IME10 - Enterobacteria phage IME10, RSK1 - Ralstonia phage RSK1, MSP - MULTISPECIES: coat protein [Escherichia], Sf101 - Enterobacteria phage Sf101, PVA1 -Vibrio phage PVA1, H6/1 - Pseudoalteromonas phage vB_PspS-H6/1. Полученное дерево содержало две основные ветви. Это была ветвь фагов близких к Р22 и ветвь фага H6/1. Наиболее родственными к Р22 оказались фаги SPN9, ep34, Emek, SE1, далее была удалена от Р22 пара MSP и Sf101, а также PVA1, фаг RSK1 образовал отдельную подветвь.
Выводы. В результате исследования получена картина естественной молекулярной кластеризации этих белков. Учитывая большую близость друг к другу белков бактериофагов, родственных Р22 с высокой уверенностью можно ожидать успех в использовании этого гена в качестве маркера для ПЦР при выделении фагов, перспективных для иммуномоделирующей терапии. Сам бактериофаг Р22 нельзя применять для терапии животных. Он - супер-трансдъюсер генов.
Для применения в ветеринарии родственных фагов необходим поиск среди родственных - нетрансдуцирующих бактериофагов. Применённые в данном исследовании подходы к изучению основного белка капсида фага Р22 могут быть опробованы и на других группах родственных вирусов бактерий.
Список литературы
1. Зимин, А.А. Использование бактериофагов для борьбы с колибактериозом и кампилобактериозом в птицеводстве / А.А. Зимин, Ф.В. Кочетков, С.И. Кононенко, Д.В. Осепчук, Н.Э. Скобликов // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. 2016. № 123. С. 421-432. - http://ej.kubagro.ru/2016/09/pdf/29.pdf
2. Скобликов, Н.Э. Оптимальная схема применения не-трансдуцирующих бактериофагов E. coli для профилактики пост-отъемной диареи поросят / Н.Э. Скобликов, С.И. Кононен-ко, А.А. Зимин // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2012. - № 37. - С. 169-173.
3. Скобликов, Н.Э. Комбинированное применение нетран-сдуцирующих бактериофагов e.coli с пробиотиком в постотъёмном периоде у поросят / Н.Э. Скобликов, С.И. Кононенко, А.А. Зимин // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. 2012, № 78. - С. 599-609. -http://ej.kubagro.ru/2012/04/pdf/61.pdf
4. Скобликов, Н.Э. Эффективность различных способов применения нетрансдуцирующих бактериофагов E.coli для профилактики пост-отъёмной диареи поросят // Скобликов Н.Э., Кононенко С.И., Зимин А.А. // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. - 2012. - № 78. - С. 653-664. - Режим доступа: http://ej .kubagro.ru/2012/04/pdf/60.pdf
5. Скобликов, Н.Э. Выделение и отбор нетрансдуцирующих бактериофагов e.coli для противоколибактериозных препаратов / Н.Э. Скобликов, С.И. Кононенко, Д.В. Осепчук, Е.А. Москаленко, В.В. Авдиенко, А.А. Зимин // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. - 2016.- № 122. - С. 554-566. -http://ej.kubagro.ru/2016/08/pdf/40.pdf
6. Zinno P, Devirgiliis C, Ercolini D, Ongeng D, Mauriello G. Bacteriophage P22 to challenge Salmonella in foods. Int J Food Microbiol. 2014 Nov 17; 191:69-741.
7. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425.
8. Richter M, & Rossello-Mora R (2009) Shifting the genomic gold standard for the prokaryotic species definition. Proc Natl Acad Sci USA 106(45): 19126-31.
9. Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, and Kumar S MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. Molecular Biology and Evolution (2013) 30: 2725-2729.
