CC BY
49
УДК 616.12-008.9-085-092.9:615.222.07 ББК 54.101+52.81 Б-74
Богус Саида Казбековна, кандидат медицинских наук, врач-кардиолог Муниципального бюджетного учреждения здравоохранения городская больница №2 Краснодарского муниципального лечебно-диагностического объединения, т.: 79184686026, е-mail:
Sayda_777@mail. ru;
Галенко-Ярошевский Павел Александрович, член-кор. РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Кубанский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации, т.: (861)2623499, т. 79284292122, е-mail: kybfarma@rambler.ru;
Духанин Александр Сергеевич, доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Национальный исследовательский медицинский университет" им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России, т.:
89161117929, е-mail: das03@rambler.ru;
Шимановский Николай Львович, член-кор. РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой молекулярной фармакологии и радиобиологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Национальный исследовательский медицинский университет" им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России, т.: 89166503149, е-mail: shiman@rsmu.ru.
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРОИЗВОДНОГО ИНДОЛА SS-68, АМИОДАРОНА И ДРОНЕДАРОНА НА ИОННЫЙ ГОМЕОСТАЗ В КАРДИОМИЦИТАХ КРЫСЫ
(рецензирована)
Проведено сравнительное изучение влияния нового производного индола SS-68, амиодарона и дронедарона на ионный гомеостаз покоящихся и стимулированных кардиомиоцитов крысы.
Установлено, что соединение SS-68 подавляет входящий Na+- и Ca2+ ионные токи, оказывает наиболее значимое действие на К+-ответ кардиомиоцитов; обладает преимущественно свойствами антиаритмических препаратов III класса:
Ключевые слова: кардиомиоциты, Na+-, Са2+- и К+ ионные токи, производное индола соединение SS-68, амиодарон, дронедарон.
Bogus Saida Kazbekovna, Candidate of Medicine, a cardiologist of Municipal budget health care institution city hospital № 2 of the Krasnodar Municipal Medical Diagnostic Association, tel.: 79184686026, email: Sayda 777@,mail.ru;
Galenko-Yaroshevsky Pavel Alexandrovich, corresponding member of RAMS, Doctor of Medicine, professor, head of the Department of Pharmacology of the SBEIHPE "Kuban State Medical University” of the Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation, tel.: (861) 2623499, e-mail: kybfarma @ rambler.ru;
Dukhanin Alexander Sergeevich, Doctor of Medicine, professor, professor of the Department of Molecular Pharmacology and Radiobiology of the SBEI HPE "National Research Medical University" named after N.I. Pirogov of the Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation, tel: 89161117929, e-mail: das03@rambler.ru;
Shimanovsky Nicholai Lvovich, corresponding member of RAMS, MD, professor, head of the Department of Molecular Pharmacology and Radiobiology of the SBEI HPE "National Research Medical University" named after N.I. Pirogov of the Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation, tel: 89166503149, e-mail: shiman@rsmu.ru.
COMPARATIVE STUDY OF THE INFLUENCE OF INDOLE DERIVATIVE SS-68, AMIODARONE AND DRONEDARONE ON ION HOMEOSTASIS IN CARDIOMYOCYTES OF RATS
(Reviewed)
A comparative study of the effects of a new derivative of indole SS-68, amiodarone and dronedarone on the ionic homeostasis of resting and stimulated rat cardiomyocytes has been conducted. It has been found that the compound SS-68 inhibits the incoming Na + - and Ca2 + ion currents, has the most significant effect on K +-response of cardiomyocytes, has the advantageous properties of class III antiarrhythmic drugs:
Keywords: cardiac myocytes, Na + -, Ca2 + - and K + ion currents, indole derivative compound SS-68, amiodarone, dronedarone.
К основным причинам развития аритмий относится ишемия миокарда. Индуцируемые гипоксией сдвиги внутриклеточного энергетического метаболизма вызывают изменения трансмембранных ионных потоков Na+, K+, Са2+, приводящие к различным нарушениям автоматизма и проводимости кардиальных клеток. К числу важных аритмогенных факторов относятся: повышение диастолической концентрации свободных ионов Na+ и Са2+ в цитоплазме кардиомиоцитов, снижение потенциала покоя плазматической мембраны клеток. В основе молекулярного механизма действия антиаритмических препаратов, как правило, лежит специфическое ингибирования активности ионных каналов для Na+, K+, Са2+.
Ранее нами было показано, что новое производное индола с лабораторным шифром SS-68, синтезированное в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета (г. Ростов-на-Дону), в условиях нарушений ритма сердца (НРС) периферического [на аконитиновой, хлоридкальциевой, хлоридбариевой, хлоридцезиевой, строфантиновой и адреналиновой моделях аритмий, а также при предсердных (вызванных разрушением синусового узла) и желудочковых (индуцированных инфарктом миокарда) формах НРС] происхождения в экспериментах на нелинейных крысах, кроликах, морских свинках, кошках и собаках проявляет выраженную антиаритмическую активность, превосходящую таковую (в зависимости от модели аритмии) референтные препараты - лидокаин, аймалин, этацизин и амиодарон [1]. Соединение SS-68 проявляло в основном свойства антиаримтика III, а также I, II и IV классов согласно классификации Вогана-Вильямса [2].
Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение влияния соединения SS-68, амиодарона и дронедарона на ионный гомеостаз, покоящихся и стимулированных кардиомиоцитов крысы.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использованы вещества и препараты: CdCl2, NiCl2 ("Fluka"); HEPES, NaCl, KCl, CaCl2, NaH2PO4, MgSO4, ЭГТА, тапсигаргин ("Sigma-Aldrich"); Fura-2/AM ("Calbiochem"); MnCl2, дигитонин ("Serva"); HCl, NaOH (отечественного производства марки хч); амиодарон (Медицинские технологии НПФ, Россия), дронедарон (Sanofi-Aventis). Все растворы готовили на воде, очищенной с помощью установки "Millipore" (США).
Выделение кардиомиоцитов из левого желудочка сердца, процедуру нагружения клеток зондами Fura-2/AM и SBFI, регистрацию флюоресценции проводили по методам, описанным A.I. Khankoeva et al. [3, 4].
Концентрацию ионов натрия в саркоплазме рассчитывали по формуле:
[Na+]4HT = Kd * k * (R - Rmin)/(Rmax - R), где R - отношение флуоресцеции при длинах возбуждающего света 340 нм (F340) и 380 нм (F380); R min и Rmax - то же при нулевой и насыщающей концентрации [Na+]qm (150 mM); k -отношение интенсивности флуоресценции при 380 нм для свободного и связанного зонда (2,1±0,1); Kd - равновесная константа диссоциации комплекса зонд-Na, равная 20,8±1,4 мМ.
Для расчета внутриклеточной концентрации кальция пользовались формулой:
[Ca2+U = K (R - Rmin)/(Rmax - R), где Rmin и Rmax представляют из себя отношения интенсивности флуоресценции при длине волны возбуждения 340 и 380 нм (F340/F380) соответственно при нулевой и насыщающей концентрациях Ca2+, а коэффициент К определяется как K^^Fo/Fs); Fs - флуоресценция при 380 нм Fura-2, свободной от кальция, Fo - флуоресценция при 380 нм комплекса зонда с кальцием. Значение Кдисс
- равновесной константы диссоциации Fura-2 с Ca2+ - определяли в модельных опытах, используя раствор Fura-2. Рассчитанная с помощью анализа Скетчарда величина Кдисс составила 140 нМ.
Оценку изменений внутриклеточной концентрации ионов калия в кардиомиоцитах с помощью флуоресцентного зонда PBFI проводили по методике, описанной Ru-Chi Shieh et al. [5].
Для моделирования условий гипоксии клетки инкубировали в течение 30 мин. при 37 С в среде, содержащей 0,5 мМ KCN и 10 мМ 2-дезоксиглюкозу.
Электрическую стимуляцию кардиомиоцитов осуществляли с помощью установки MacLab system (Австралия).
Расчет доверительных интервалов экспериментальных значений и оценку достоверности различий между ними проводили с помощью параметрического t-критерия Стьюденга при уровне значимости, равном 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Влияние на Na+-каналы. Na-каналы могут существовать в одном из трех возможных функциональных состояний: открытом, закрытом или инактивированном (рефрактерном). Лекарственные средства, относящиеся к I классу антиаритмиков, способны связываться с Na+-каналами, находящимися только в открытом и рефрактерном состояниях. Вследствие этого представители класса антиаритмических веществ блокируют только функционирующие Na+-каналы, причем, чем выше ЧСС, тем более выражен их фармакологический эффект.
В условиях наших экспериментов величина диастолической концентрации [Na+]4m. в покоящихся кардиомиоцитах составила 7,9±0,5 мМ (n = 4). Подъем внутриклеточной концентрации Na+ индуцировали путем внесения в суспензию кардиомиоцитов KCN и 2-дезоксиглюкозы и через 30 мин. регистрировали выраженное повышение интенсивности флуоресценции при 340 нм, сопровождающееся снижением F380. Исследование влияния SS-68, амиодарона и дронедарона на индуцированный [№+]цит проводили в двух сериях экспериментов с использованием нестимулированных (1) и стимулированных (2) [электрическими импульсами (0,2-1,0 Гц, 10 мс, 60 мВ)] кардиомиоцитов.
1. В условиях экспериментальной гипоксии, вызванной KCN и 2-дезоксиглюкозой, новый повышенный уровень [Na+]4m равнялся 16,3±1,5 мМ (n = 6). Таким образом, разница между базальным уровнем Na+ в интактных и неоксигенированных кардиомиоцитах (ANa) составила в среднем 8,4 мМ. Предварительное внесение SS-68, амиодарона и дронедарона до конечной концентрации 10, 25 и 50 мкМ вызывает дозозависимое снижение ANa. При этом выраженность Na-блокирующего эффекта примерно равна: SS-68, амиодарона и дронедарона, взятые в концентрации 10 мкМ, достоверно (р < 0,05) ингибируют подъем натрия на 29, 35 и 27% соответственно.
2. Дифференцировать действие SS-68, амиодарона и дронедарона удалось в экспериментах на стимулированных кардиомиоцитах.
Электрическая стимуляция клеток в течение всего периода "химической" гипоксии приводила к достоверному изменению [Na ]цит как по отношению к контрольным образцам (ANa = 15,9±2,3 мМ), так и в сравнении с нестимулированными миоцитами (ANa = 7,5±1,8 мМ). Подъем [Na+]4H1. не зависел от выбранной частоты электрических разрядов: стимуляция клеток током с частотой 0,2 или 1,0 Гц вызывала сходное по величине повышение уровня Na+.
Ингибирующее действие амиодарона на увеличение [Na+]4H1. зависело не только от дозы, но и от частоты электрической стимуляции кардиомиоцитов (рис. 1А). Следует отметить, что глубина Na-блокирующего эффекта амиодарона на стимулированных клетках была существенно больше, чем на нестимулированных во всем диапазоне концентраций.
Дронедарон в меньшей степени ингибировал индуцированный [Na+]4№ также были выявлены отличия между активностью этого препарата при стимуляции током различной частоты (рис. 1Б).
Из представленных на рисунке С данных видно, что для SS-68, характерно амиодарон-подобное влияние на [Na+]qm. В зависимости от навязанной частоты стимуляции степень ингибирования соединением SS-68 натриевого тока достоверно отличалась.
Влияние на Са2+-каналы. В нормооксигенированных кардиомиоцитах диастолическая концентрация свободных ионов Са2+ в саркоплазме поддерживается на уровне 12-145 нМ. В основном это определяется работой Na/Ca-обменника, локализованного в сарколемме. Ингибирование его активности специфическим блокатором амилоридом (40 мкМ) приводило к достоверному повышению базального [Са2+]цит в среднем до величины 210 нМ. В состоянии покоя небольшое количество Са2+ поступает в клетку через К+-каналы, выброс Са2+ из миоплазмы обеспечивается Na/Ca-антипортом. Потенциал зависимые Na+- и Са2+-каналы закрыты. Об этом свидетельствуют следующие данные: 1) входу Са2+ в кардиомиоциты препятствовали селективные блокаторы К+-каналов 4-аминопиридин (10 мМ) и тетраэтиламмоний (5 мМ); 2) "фоновый" входящий ток Са2+ не чувствителен к избирательным антагонистам Са2+-каналов кардиомиоцитов
- верапамилу, двухвалентным металлам (1 мМ NiCl2, 0,2 мМ CdCl2).
Исследование влияния SS-68, амиодарона и дронедарона на содержание Са2+ в покоящихся кардиомиоцитах не выявило достоверного изменения Са2+-ответа клеток в диапазоне концентраций 10-100 мкМ.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что исследуемые вещества не изменяют компартментализацию внутриклеточного Са2+ в нестимулированных интактных кардиомиоцитах.
При экспериментальной гипоксии, вызванной инкубацией клеток с D-глюкозой и KCN в течение 20 мин., наблюдали значительные сдвиги Са2+-обмена кардиомиоцитов. В условиях "химической гипоксии" определенный диастолический уровень Са2+ был выше, чем в интактных клетках (АСа = 62 нМ). В гипооксигенированных клетках накапливаются кислые метаболиты,
снижается внутриклеточный рН и наблюдается ацидоз, активирующий Ка/Н-обмен. В наших исследованиях с целью ингибирования Ка/Н-обмена применялся этилизопропиламилорид (ЕІРА), который в концентрации 10 мкМ подавляет его активность примерно на 80%. Стимуляция работы Ка/И-антипорта вызывает увеличение [Ка+]цит, которое регистрировалось с использованием флуоресцентного индикатора Казонда SBFI-АМ. Разница между базальным уровнем [Ка+]цит в интактных и гипоксигенированных клетках (АКа) равнялась в среднем 15 мМ, что соответствует превышению контрольных значений [Ка]цит на 105-107%. Повышение внутриклеточного уровня Ка+ даже на 10% вызывает резкую активацию №/Са-обмена, при котором транспорт ионов меняет направление: 3 иона Ка+ из клетки выбрасываются наружу, один ион Са2поступает в клетку извне. Следствием этого является увеличение [Са2]цит. Рост внутриклеточного содержания ионизированного Са2+ - не только является аритмогенным фактором, но и запускает каскад сложных биохимических процессов, приводящих к структурным повреждениям и гибели кардиомиоцитов по некротическому пути.
В то же время в условиях гипооксигенации инкубация кардиомиоцитов с амиодароном или дронедароном (10-100 мкМ) приводила к дозозависимому уменьшению [Са2]цит.
Действие 88-68 на Са2-гомеостаз имеет непрямой (опосредованный) характер, поскольку определяется ингибированием транспорта ионов Ка в клетку. Об этом свидетельствовали данные следующих экспериментов: а) замена внеклеточного №+ на эквивалентное количество Li+ отменяла Са2-блокирующий эффект 88-68, но не амиодарона; б) предварительное повышение [Ка]цит за счет ингибирования активности Ка/К-АТФазы строфантином G (5 мкМ) потенцировало Са2-блокирующий эффект SS-68. В этих условиях действие амиодарона на Са2- обмен практически не изменялось. Таким образом, в отличие от 88-68, эффект амиодарона и дронедарона на [Са2 ]цит в кардиомиоцитах складывается из их прямого влияния на Са2 -обмен и непрямого действия, реализуемого через механизм ингибирования Ка-зависимого подъема [Са2]цит.
Увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ в кардиомиоцитах может быть опосредовано как активацией потенциал зависимых Са2-каналов, так и открытием рецептор управляемых Са2-каналов наружной плазматической мембраны и мембран саркоплазматического ретикулума. Вход внеклеточного Са2+ через потенциал чувствительные каналы блокируют антиаритмические препараты IV класса - антагонисты Са2-каналов (верапамил, дилтиазем и др.). Регулирующее влияние на Са2-гомеостаз кардиомиоцитов антиаритмических препаратов II класса
- блокаторов р-адренорецепторов определяется их способностью препятствовать активации лиганд зависимых Са2-каналов.
Влияние на К+-каналы. Ограничения при регистрации К+ тока с использованием флуоресцентного индикатора ионов К+ PBFI позволили нам оценить только качественные изменения внутриклеточного содержания [К]цит.
Электрическая стимуляция кардиомиоцитов сопровождалась заметным снижением интенсивности флуоресценции зонда, регистрируемым в течение 2 мин. (рис. 2).
Соединение 88-68, амиодарон и дронедарон влияли как на абсолютные величины флуоресценции, так и динамику изменения флуоресценции PBFI (рис. 3). В зависимости от выраженности К-блокирующих свойств исследуемые вещества можно расположить в следующий ряд: 88-68 > дронедарон > амиодарон.
Таким образом, производное индола SS-68 и взятые в качестве референтных препаратов амиодарон и дронедарон в условиях нестимулированных кардиомиоцитов (как интактных, так и ишемизированных) вызывают практически равнозначное дозозависимое снижение в них концентрации [Ка]цит.
В случаях стимулированных кардиомиоцитов (интактных и ишемизированных) SS-68, амиодарон и дронедарон оказывают ингибирующее действие на увеличение [Ка ]цит как в зависимости от дозы, так и от частоты их электрической стимуляции, причем глубина Ка -блокирующего действия амиодарона на стимулированных клетках была существенно большей, чем на нестимулированных; 88-68 проявляло амиодаронподобное действие; дронедарон в меньшей степени ингибировал [Ка ]цит и так же, как амиодарон и 88-68, проявлял большую активность на стимулированных кардиомиоцитах.
В отличие от соединения SS-68, эффект амиодарона и дронедарона на [Са2 ]цит в кардиомиоцитах складывается из его прямого влияния на Са-обмен и непрямого действия, реализуемого через механизм ингибирования Ка-зависимого подъема [Са2]цит.
По способности оказывать К-блокирующее действие 88-68 превосходит дронедарон и амиодарон соответственно.
100 т
80
Я 60 ■■
з 40
Ж 20
Соединение SS-68
10 25 50
Концентрация вещества, мкМ
0
□ 1,0 Гц ]^0,2 Гц
Концентрация препарата, мкМ
Концентрация препарата, мкМ
Рис. 1. Сравнительная эффективность Ыс+-блокирующего действия соединения ББ-бв, амиодарона и дронедарона в условиях экспериментальной гипоксии
Условия: кардиомиоциты стимулировали током с частотой 1,0 Гц и 0,2 Гц. По оси ординат
- % ингибирования подъема [Ка]цит, вычисленный по формуле:
{1 - (АКа0/АКак)Н00%,
где АКао и АКак - изменение внутриклеточной концентрации Ка+ за время 30-минутной инкубации в опытных (в присутствии блокатора Ка -каналов) и в контрольных образцах (в отсутствие исследованных веществ).
Время, мин
Рис. 2. Флуоресценция (510 нм) покоящихся (1) и стимулированных (2) (электрическими импульсами 1,0 Гц) кардиомиоцитов
Время, мин Время, мин
Рис. 3. Динамика изменений флуоресценции зонда PBFI при электрической стимуляции кардиомиоцитов в отсутствие (1) и в присутствии SS-68 (2), дронедарона (3) и амиодарона (4), взятых в концентрации 50 мкМ
Литература:
1. Антиаритмическая активность новых производных индола / С.К. Богус [и др.] // IV съезд фармакологов России "Инновации в современной фармакологии": материалы съезда, Казань, 18-21 сентября 2012 г. М.: Фолиум, 2012. С. 23.
2. Vaughan-Williams Е.М. Classification of antiarrhythmic drugs // J. Cardiovasc. Pharmacol. 1992. Suppl. 2. P. SI-S7.
3. Khankoeva A.I., Dukhanin A.S., Galenko-Iaroshevskii P.A. Determination of cardiomyocyte transmembrane potential with potential-sensitive fluorescent probes // Biull. Eksp. Biol. Med. 1998. Nov. Vol. 126, №11. P. 594-597.
4. Evaluation of Na-blocking properties of rinocaine and its combinations with low molecular weight polymers in the isolated cardiomyocytes of rats / Khankoeva A.I. [etc.] // Biull Eksp Biol Med. 1997. Dec. Vol. 124, №12. P. 649-651.
5. Lactate Transport in Mammalian Ventricle General Properties and Relation to K' Fluxes / Ru-Chi Shieh [etc.] // Circulation Research. 1994. Vol. 74, №5. P. 829-838.
References:
1. Antiarrhythmic activity of new indole derivatives / Bogus S.K // IV Congress of Pharmacologists of Russia "Innovations in modern pharmacology : materials of the Congress, Kazan, 18 - 21 September 2012. M. : Folium, 2012. P. 23.
2. Vaughan-Williams Е.М. Classification of antiarrhythmic drugs//J. Cardiovasc. Pharmacol. 1992. Suppl.
2.P. SI-S7.
3. Khankoeva A.I., Dukhanin A.S., Galenko-Iaroshevskii P.A. Determination of cardiomyocyte transmembrane potential with potential-sensitive fluorescent probes // Biull. Eksp. Biol. Med. 1998. Nov. Vol. 126, № 11. P. 594 - 597.
4. Evaluation of Na-blocking properties of rinocaine and its combinations with low molecular weight polymers in the isolated cardiomyocytes of rats / Khankoeva A.I. [etc.] // Biull Eksp Biol Med. 1997. Dec. Vol. 124, №12. P. 649-651.
5. Lactate Transport in Mammalian Ventricle General Properties and Relation to K' Fluxes / Ru-Chi Shieh [etc.] // Circulation Research. 1994. Vol. 74, № 5. P. 829 - 838.
