Механизм действия препарата ｫкардосｻ при моделировании сердечной недостаточности у крыс Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.12 - 008.46 - 092.4-092.9

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТА «КАРДОС» ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ У КРЫС

Владимир Иванович Петров', Наталья Геннадьевна Чепурина', Николай Львович Шимановский2

' Кафедра клинической фармакологии и интенсивной терапии (зав. — акад. РАМН, проф В.И. Петров),

Волгоградского государственного медицинского университета, e-mail: [email protected], 2кафедра молекулярной фармакологии и радиобиологии (зав. — чл.-корр. РАМН, проф. Н.Л. Шимановский) Российского государственного медицинского университета, г. Москва

Реферат

Определен механизм действия препарата «Кардос» (антитела к С-концевому фрагменту АТ1-рецептора ан-гиотензина II аффинно очищенные) при экспериментальной сердечной недостаточности у крыс и установлено его влияние на соотношение АТ1- и АТ2-подтипов рецепторов ангиотензина II и активность МЮ-синтета-зы в кардиомиоцитах.

Ключевые слова: экспериментальная модель, сердечная недостаточность, препарат «Кардос», рецепторы, ангиотензин II, кардиомиоцит.

Важным элементом патогенеза хронической сердечной недостаточности (ХСН) являются периферический ангиоспазм и увеличение циркулирующего объёма крови, направленные на поддержание адекватной перфузии жизненно важных органов в условиях снижающегося сердечного выброса. Длительно существующая повышенная пост-, затем и преднагрузка на сердце (артериовенозная вазоконстрикция) со временем сами становятся причиной дальнейшего повреждения сердечной мышцы и прогрессирования ХСН [4]. Внимание исследователей в настоящее время направлено на изучение нейрогуморальных систем, ответственных за системную вазо-констрикцию и, особенно, ренин-ангио-тензин-альдостероновой системы (РААС). Синтезирован новый класс лекарственных препаратов, модулирующих активность РААС, — ингибиторы ангиотензин-превра-щающего фермента (АПФ) и блокаторы рецепторов к ангиотензину II [3, 5]. На современном этапе исследуются селективные антитела к рецепторам ангиотензина II первого типа — действующее вещество препарата «Кардос» (ООО «НПФ «Мате-риа Медика Холдинг»).

Целью исследования являлось изучение механизмов действия препарата «Кардос» 472

на миокард в условиях экспериментальной модели сердечной недостаточности, индуцированной изопротеренолом.

Была использована изадриновая модель сердечной недостаточности у крыс: белым крысам-самцам массой 250—300 г подкожно вводили изопротеренол в дозе 80 мг/кг дважды с интервалом 24 часа. По данным литературы, изопротеренол вследствие прямого кардиотоксического действия вызывает сердечную недостаточность по гипертрофически-дилатационному типу. Сроки развития сердечной недостаточности — 5—7 дней после введения второй дозы изадрина (изопротеренола) [1].

Крысы с индуцированной сердечной недостаточностью были подразделены на 2 группы по 8 особей в каждой: в первой группе (I) получали плацебо (дистиллированная вода — 0,25 мл/100 г); во второй (II) — препарат «Кардос» (антитела к С-концевому фрагменту АТ^рецептора ангиотензина II аффинно очищенные) в дозе 0,25 мл/100 г массы животного начиная со следующего дня после второго введения изопротеренола. Исследуемый препарат вводили внутрижелудочно через зонд. Через 2 недели после начала эксперимента спустя 24 часа после последнего введения препаратов часть животных де-капитировали и брали образцы миокарда для исследования показателей активности МЮ-синтетазы. Изолированные кардио-миоциты из левого желудочка сердца крыс выделяли по методике I. Т)^а1 (1994) [8]. Радиолигандный анализ связывания 125!-ангиотензина II (А II) плазматическими мембранами миокарда проводили по описанной ранее в научной литературе методике [6]. Внутриклеточную концентрацию ионов кальция в кардиомиоцитах

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

-9 -8 -7 -6 -5

1д[ингибитор], моль/л

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

-8 -7 -6

1д[ингибитор], моль/л

Рис. 1. Кривые вытеснения связанного с мембранами кардиомиоцитов крыс 125I-AII в присутствии PD-123319. Обозначения: 1 — плацебо, 2 — кардос.

определяли с помощью флуоресцентного зонда FURA-2. Флуоресценцию (500 нм) регистрировали на спектрофлуориметре MPF-3 «Hitachi» при длине возбуждающего света 340 нм и 380 нм, что соответствует максимуму поглощения связанной с ионами и свободной формы зонда FURA-2. Внутриклеточную концентрацию кальция рассчитывали на основании измерений при двух длинах волн возбуждения (F340 и F380). Активность NO-синтетазы (NOS) определяли радиолигандным мето-

Рис. 2. Кривые вытеснения связанного с мембранами кардиомиоцитов крыс 1251-АП в присутствии ирбесар-тана. Обозначения такие же, как на рис. 1.

личается незначительно. Установленное (рис. 2) существенное различие в числе мест связывания ирбесартана (АТ^под-тип рецепторов) объясняется, по-видимому, компенсаторным ответом на блокаду АТ^рецепторов препаратом «Кардос».

Рассчитаны значения константы ин-гибирования (К.) и коэффициента Хил-ла (пн), приведенные в табл. 1. Введение кардоса изменяло соотношение АТХ/АТ2 рецепторов в кардиомиоцитах при экспериментальной сердечной недостаточ-

Таблица 1

Анализ связывания 125Г-ангиотензина II плазматической мембраной кардиомиоцитов крыс, получавших плацебо

или кардос (M±mt)

Соединение Группа I (n=8) Группа II (n=8)

Кл,нмоль/л Пн Кл,нмоль/л Пн

Ангиотензин II 5,1 1,9±0,4 6,3 2,0±0,5

PD-123319 2,7 1,1±0,3 3,2 0,9±0,3

Ирбесартан 26 0,9±0,2 22 0,8±0,3

Обозначения: K — константа ингибирования; nH — коэффициент Хилла.

дом, описанным Bredt и Snyder (1990) [2].

Для исследования распределения рецепторов ангиотензина II был применен так называемый ингибиторный анализ, основанный на использовании селективных лигандов ирбесартана и PD-123319 к рецепторам АТХ- и АТ2 соответственно. Типичные кривые вытеснения связанного с АТ2-рецепторами 125I-AII в двух группах животных представлены на рис. 1. Видно, что число мест связывания PD-123319 от-

ности (рис.3). Наблюдалось достоверное увеличение экспрессии АТ1-рецепторов, при этом уровень АТ2-подтипа рецепторов статистически значимо не менялся.

Оценка функциональной активности АТ^подтипа рецепторов А11 включала флуоресцентное определение свободных ионов Са2+ в цитоплазме клеток в норме и при экспериментальной патологии. В интактных кардиомиоцитах базальная концентрация свободных ионов кальция

450

400

350

300

S

н 250

V

200

о

150

100

50

Кб-

2 3

время, мин

Рис. 3. Распределение АТ1- и АТ2-подтипов рецепторов AII на плазматической мембране кардиомиоцитов крыс при экспериментальной модели сердечной недостаточности и сочетании этой модели с введением препарата «Кардос».

колебалась на уровне 125—145 нМ, в поддержании этих значений [Са2+]цит основная роль принадлежит Na+/Ca2+-обмену. Сравнение показателей базального (диа-столического) уровня [Са2+]цит в кардио-миоцитах в группе животных, получавших кардос (группа II), и в контрольной группе (группа I) не выявило достоверного различия: 192±13 и 212±19 нМ (n=8) соответственно.

В следующей серии экспериментов оценивали влияние 2-недельного введения гардоса на индуцированный уровень [Са2+]цит в кардиомиоцитах. Повышение уровня [Са2+]цит вызывали с помощью увеличения внеклеточной концентрации ионов К+ (I) или добавления в суспензию клеток кофеина (II). Повышение уровня Са2+ начиналось через 5—10 секунд после добавления KCl (конечная концентрация — 40 мМ) и быстро возрастала в течение 1—2 минут до 510±20 нМ. В последующие 2— 2,5 мин [Са2+]цит уменьшался до исходного уровня.

Верапамил начиная с концентрации 0,5 мкМ дозозависимо ингибировал повышение [Са2+] . Рассчитанное значение

L ■'цит

IC50 составляло 2,8±0,3 мкМ. Действие ве-рапамила определяется его способностью блокировать L-тип Са2+-каналов, имеющих участок связывания для 1,4-дигидропири-динов. На данной экспериментальной модели не было выявлено отличие в Са2+-ответах кардиомиоцитов, полученных из 474

Рис. 4. Динамика [Са2+]цит в интактных кардиомиоцитах при действии 10 мМ кофеина (а), сочетания кофеина и 40 мкМ амилорида (б).

миокарда крыс обеих групп.

Важным источником поступления ионов кальция служат цистерны сарко-плазматического ретикулума (СПР); в физиологических условиях выброс Са2+ из СПР индуцируется инозитолтрифос-фатом (IP3) и повышением концентрации в цитозоле самих ионов Са2+ — так называемым механизмом кальций-индуциру-емого высвобождения кальция (CICR — calcium-induced calcium release). Добавление к суспензии клеток кофеина (10 мМ) вызывало быстрый подъем [Са2+]цит, в среднем на 20% ниже максимального уровня Са2+, регистрируемого при К+-деполяриза-ции (рис. 4, кривая а). Развивающееся в дальнейшем уменьшение концентрации кальция при действии кофеина заметно пролонгировано по времени. Последнее объясняется тем, что в присутствии кофеина нарушаются захват и депонирование Са2+ в СПР, кальций главным образом удаляется через №+/Са2+-насосы. Ингибитор трансмембранного №+/Са2+-транспор-та — амилорид (40 мкМ) способствует сохранению [Са2+]цит, т.е. потенцирует вторую фазу действия кофеина (рис. 4, кривая б). На кофеиновой модели в кардиомиоцитах крыс контрольной группы (1) отмечалось уменьшение скорости выведения Са2+, наподобие амилорид-обработанных клеток (рис. 5). Динамика [Са2+]цит в кардиомиоцитах группы II достоверно отличалась: наблюдались ускорение снижения

а

СН

0

Таблица 2

Обмен NO в миокарде крыс (M±mt)

Группы крыс Активность iNOS, пмоль L-цитруллина/ мин/мг белка Активность eNOS, пмоль L-цитруллина/ мин/мг белка NOx, нмоль/мг белка

I (n=8) 1,19±0,29 0,39±0,03 13,7±1,6

II n=8 0,67±0,14* 0,41±0,04 9,0±0,9*

" р<0,05 — в отличие от контроля.

450

400

350

300

S 250

200

50

2

00

50

время, мин

Рис. 5. Динамика [Са2+]пит в кардиомиоцитах контрольной группы (1) и на фоне введения кардоса (2).

[Са2+] и уменьшение его конечной кон-

-"цит ^

центрации (161±20 нМ против 205±25 нМ в контрольной группе). Т.е. кардиотроп-ное действие кардоса может быть связано с его нормализующим влиянием на Са2+-обмен в кардиомиоцитах, выраженное в ускоренном снижении индуцированного подъема [Са2+]цит.

Для оценки функциональной активности АТ2-подтипа рецепторов АТ II проводилось сравнительное исследование влияния кардоса на активность МЮ-син-тетазы в миокарде при экспериментальной сердечной недостаточности. Влияние кардоса на активность индуцибельной (1МЮБ), конститутивной (еМЮБ) форм МЮ-синтетазы, суммарный уровень метаболитов оксида азота МЮх в миокарде подопытных животных представлено в табл. 2. Выявлены статистически значимые различия в двух случаях: кардос снижал активность и суммарный

уровень метаболитов оксида азота МОх. Достоверного влияния препарата на активность еМЮБ не отмечено.

Длительная ишемия, обусловленная введением высоких доз Р-адреномиметика изопротеренола приводит к нарушению барьерной функции плазматической мембраны миоцитов, повышению проницаемости для различных ионов, в частности в цитоплазме. Накопление Са2+ вызывает ишемическую контрактуру, ухудшение коронарного кровотока, дефицит АТФ,

активацию так называемых Са2+-зависи-мых фосфолипаз (А2 и С). Возможно развитие Са2+-обусловленной ишемической или реперфузионной желудочковой тахикардии или аритмии [7]. Повышение концентрации свободного цитозольного кальция может способствовать апоптозу кардиомиоцитов. В связи с отмеченными фактами определенные перспективы лечения сердечной недостаточности могут быть связаны с дальнейшим клиническим исследованием кардоса.

Усиленное образование оксида азота — один из адаптивных процессов, позволяющих поддерживать тонус гладкой мускулатуры и коронарный кровоток в условиях кардиотоксического действия изопротеренола. В то же время избыточная продукция оксида азота может быть ответственна за нарастание апоптотичес-кой гибели кардиомиоцитов и декомпенсацию сердечной деятельности [9].

Влияние фармакотерапии препаратом «Кардос», проявившееся при максимальных отклонениях показателей МЮ-обме-на, индуцированных в эксперименте, может указывать на регулирующий (модулирующий) характер воздействия кар-доса на состояние МО-обмена в миокарде. Возможна оценка изменений МО-обмена на фоне приема кардоса как фармакологического действия, направленного на восстановление баланса между компенсаторными и повреждающими механизмами, индуцированными МО в миокарде при экспериментальной патологии.

Таким образом, к точкам приложения действия кардоса на патогенез развития экспериментальной сердечной недостаточности можно отнести изменение ре-цепторного профиля кардиомиоцитов к ангиотензину II, влияние на кальциевый

475

гомеостаз кардиомиоцитов и NO-обмен в миокарде.

ЛИТЕРАТУРА

1. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2005. - С. 207.

2. Bredt D.S, Snyder S.H. Isolation of nitric oxide synthetase, a calmodulin-requiring enzyme //Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 1990. - Vol. 87. - P. 682-685.

3. Brunner-La Rocca H. P., Vaddadi G., and Esler M. D. Recent insight into therapy of congestive heart failure: focus on ACE inhibition and angiotensin-II antagonism// J. Am. Coll. Cardiol. -1999. - №33(5). - Р. 1163-1173.

4. De Mello W. C. and Danser A. H. J. Angiotensin II and the Heart: On the Intracrine Renin-Angiotensin System//Hypertension. - 2000. - №35(6). - Р. 1183-1188.

5. Lim P. O., Nys M., Struthers A. D., at al. Irbesartan Reduces QT Dispersion in Hypertensive Individuals // Hypertension. - 1999. - № 33(2). - Р. 713-718.

6. Lopez J., Lorell B., Ingelfinger J. et al. Distribution and function of cardiac angiotensin AT1- and AT2-receptor subtypes in hypertrophied rat hearts // Am. J. Physiol. -1994. -№ 267 (2 Pt 2). - P.844—852.

7. Ripley T. L. Valsartan in Chronic Heart Failure // Ann. Pharmacother. - 2005. - № 39(3). - Р. 460-469.

8. Tytgat J. How to isolate cardiac myocytes // Cardiovasc-Res. - 1994. - № 28(2). - Р. 280-283.

9. Watanabe T., Barker T. A., and Berk B. C. Angioten-sin II and the Endothelium: Diverse Signals and Effects// Hypertension. - 2005. - № 45(2). - Р. 163-169.

Поступила 16.01.10.

THE MECHANISM OF ACTION OF THE DRUG "CARDOS" ON HEART FAILURE MODEL IN RATS

V.I. Petrov, N.G. Chepurina, N.L. Shimanovsky

Summary

Determined was the mechanism of action of the drug "Cardos" (antibodies to the C-terminal fragment of AT1 receptor of angiotensin II) in experimental heart failure in rats and determined was its effect on the ratio of AT1 and AT2-angiotensin II receptor subtypes and NO-synthase activity in cardiomyocytes. It is suggested that "Cardos" possesses modulating action on nitric oxide II metabolism in the myocardium.

Key words: heart failure experimental model, Cardos, angiotensin II receptors, cardiomyocytes.

УДК 616.127-00 5.8-037-036.8

РЕТРОСПЕКТИВНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ РАННЕГО ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ИНФАРКТОМ МИОКАРДА

Айгуль Илгизовна Шайдуллина ', Альберт Сарварович Галявич ', Рашит Шамилович Миннетдинов 2, Искандер Файрузович Якупов 2, Рустем Альбертович Галяви1

'Кафедра факультетской терапии (зав. — проф. А.С. Галявич) Казанского государственного медицинского университета, 2Межрегиональный клинико-диагностический центр, г. Казань,

e-mail: [email protected]

Реферат

Изучены ближайшие и отдаленные результаты различных режимов терапии инфаркта миокарда в острой стадии у 90 больных в возрасте до 70 лет. Динамика снижения уровня одного из наиболее важных предикторов неблагоприятного исхода после инфаркта миокарда была примерно одинаковой во всех группах, т.е. не зависела от вида вмешательства в острой стадии инфаркта миокарда.

Ключевые слова: реперфузия, коронарная ангиография, тромболизис, баллонная дилатация, стентиро-вание коронарных артерий.

Основными методами лечения больных инфарктом миокарда (ИМ) с подъёмом сегмента БТ (ПСБТ) в ишемической стадии является реперфузия с помощью медикаментозного (тромболизис) или 476

механического (баллонная дилатация и стентирование коронарных артерий) методов. По данным анализа результатов лечения больных инфарктом миокарда, в 30 странах Европы механическая реперфузия проводится в 5—92% случаев, тромболизис — в 0—55%, реперфузия в целом — в 37—93%. Госпитальная смертность в этих странах находится в пределах 4,2—13,5% в зависимости от вида реперфузии [1]. Влияние вида лечения (тромболизис, механическая реперфузия или консервативное лечение) на отдалённый прогноз больных инфарктом миокарда изучено недостаточно.

Целью настоящей работы была оценка влияния метода лечения на прогноз у