CC BY
107
Оригинальные исследования
35
Сравнительное исследование влияния дермальных фибробластов и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, заключенных в коллагеновый гель, на регенерацию десны
А.А. Бармашева 1, Н.С. Николаенко 2, И.А. Самусенко 3, ЛЮ. Орехова 1, Г.П. Пинаев 2
1 Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург
2 Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург
3 Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. А.М. Никифорова МЧС России, Санкт-Петербург
A comparative study of the influence of skin fibroblasts and bone marrow stromal cells included in collagen gel on gingiva regeneration
А.А. Barmasheva 1, N.S. Nikolaenko 2, I.А. Samusenko 3, L.Yu. Orekhova 1, G.P. Pinaev2 11.P. Pavlov Saint-Petersburg State Medical University, Saint-Petersburg
2 Institute of Cytology, Saint-Petersburg
3 A.M. Nikiforov Russian Center of Urgent and Radiation Medicine, Saint-Petersburg
Целью настоящей работы являлось сравнение эффективности применения дермальных фибробластов и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, заключенных в коллагеновый гель, при хирургическом вмешательстве по устранению дефицита прикрепленной слизистой полости рта на модели рецессии десны. Показано, что применение культивированных клеток, заключенных в коллагеновый гель, позволяет получить к 180 сут. наблюдения больший объем десны, чем применение стандартной методики устранения рецессии. Гистологическое строение восстановленной десны соответствовало норме.
Ключевые слова: дермальные фибробласты, мультипотентные мезенхимные стромальные клетки, коллаген, рецессия, десна.
Рецессия десны представляет собой смещение края десны в апикальном направлении без развития клинически видимых признаков воспаления, сопровождающееся обнажением поверхности корня зуба. Пациенты с рецессией десны чаще всего обращаются к стоматологу с жалобами на нарушение эстетики или появление гиперecтезии зубов. Имеются данные, что рецессия различной степени встречается у приблизительно половины населения планеты [1]. Распространенность этой патологии увеличивается с возрастом [2, 3], встречаясь, например, у 58—62% людей старше 30 лет [2, 4, 5]. По распространенности выделяют одиночные и множественные рецессии. Локализованная рецессия чаще всего расположена в области центральных резцов нижней челюсти [6, 7], клыков и первых премоляров верхней челюсти [8, 4].
Самой распространенной и активно применяемой в мире классификацией рецессии десны является классификация, предложенная Миллером в 1985 г. Ее основным преимуществом перед другими классификациями является возможность прогнозирования эффективности будущего
e-mail: [email protected]
The aim of this research was to compare the influence of dermal fibroblasts and multipotent mesenchymal stromal cells included in type I collagen gel on oral mucosa regeneration. It was shown that cultured cells included in collagen gel allowed receiving the greater volume of soft tissues in 180 days than a standard technique of recession management. Repaired gingiva had a normal histological morphology.
Key words: dermal fibroblasts, multipotent mesenchymal stromal cells, collagen, gingiva, recession.
хирургического лечения. Только при рецессии I и II класса возможно закрытие всей поверхности корня зуба. При рецессии III класса поверхность корня на 100% закрыть нельзя. Успешное лечение при рецессии IV класса невозможно [9].
В зависимости от клинической картины и причин возникновения для устранения рецессии применяют различные хирургические методы, в частности, ряд лоскутных операций, использование свободного десневого трансплантанта. Золотым стандартом устранения рецессии десны в настоящее время считается применение субэпителиального соединитель-но-тканного трансплантанта в сочетании с коронарно смещаемым лоскутом. Метод обеспечивает высокий процент закрытия поверхности корня, быстрое заживление, меньший послеоперационный дискомфорт, по сравнению с другими способами [10, 11]. Однако лимитирующим фактором при его применении является ширина дефекта, зависящая от снижения высоты межальвеолярных перегородок и степени потери мягких тканей [9].
Для улучшения результатов хирургического лечения пациентов с рецессией было предложено
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
36
Оригинальные исследования
использование барьерных мембран, которые фиксируют над поверхностью корня зуба (техника GTR), обеспечивая пространство для регенерации тканей [12—14]. Применение техники GTR способствует увеличению уровня клинического прикрепления, уменьшению высоты видимой коронковой части зуба, снижению кровоточивости при зондировании [15, 16]. Однако его применение также имеет определенные недостатки и противопоказания, в частности, его нельзя применять при множественных узких рецессиях [17, 18], при тонком биотипе десны [19].
До настоящего времени создание эффективных технологий устранения дефицита слизистой оболочки полости рта является актуальной проблемой стоматологии. Перспективным направлением восстановления структуры и функциональной активности поврежденных тканей является тканеинженерное. Его базовая концепция включает создание трехмерных «эквивалентов» тканей, состоящих из носителей и различных типов клеток, в частности, фибробластов [20, 21]. Для восстановления соединительной ткани десны могут быть использованы культивируемые клетки в виде суспензии или в полимерном геле [22, 23]. Положительные результаты при устранении рецессии десны или восстановлении межзубного сосочка были получены при использовании факторов роста [24] и аутогенных фибробластов совместно с техникой GTR [25]. Применение во время хирургического вмешательства сосудисто-стромальной фракции клеток жировой ткани, содержащей мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) (Mucograft®, IntelMCeM, США), позволило получить через 6 мес. после операции до 3,0 мм прироста десны [11]. Также в результате рандомини-зированного контролируемого исследования, направленного на сравнение эффективности коллагеновых мембран, заселенных аутогенными фибробластами, и техники GTR с коллагеновой мембраной при рецессии (I класса по Миллеру) было показано преимущество первого метода [26].
В настоящее время имеются данные, что культивируемые ММСК и фибробласты имеют близкий иммунофенотип и мультипотентность, то есть могут дифференцироваться по крайней мере в трех ортодоксальных направлениях: остеогенном, адипо-генном и хондрогенном [27, 28]. Однако, с другой стороны, у этих клеток есть различия в морфологии и размерах, в составе синтезируемых компонентов внеклеточного матрикса и других биологически активных веществ [29, 30]. В связи с этим возникает вопрос, какой тип клеток и какой носитель для этих клеток эффективнее использовать при решении различных задач в рамках «регенеративной медицины», в частности, в стоматологии при создании тканеинженерных эквивалентов для реконструкции десны.
Согласно литературным данным для восстановления соединительной ткани десны могут быть использованы культивируемые дермальные фибробласты или ММСК в виде суспензии или в полимерном геле [22, 23]. В то же время для ускорения заживления глубоких и обширных повреждений дермы, вызванных ожогами или другими причинами, успешно применяют дермальный эквивалент, состоящий из культивируемых дермальных аллогенных фибробластов взрослых доноров, заключенных в гель коллагена I типа [31, 32]. Этот тип тканеинженерного эквивалента позволяет восстановить большой объем со-
единительной ткани, поэтому применение при хирургическом вмешательстве аллогенных дермальных фибробластов или ММСК, заключенных в коллагеновый гель, может способствовать реконструкции достаточного объема мягких тканей полости рта.
Целью настоящей работы являлось сравнение эффективности применения дермальных фибробластов и ММСК, заключенных в коллагеновый гель, при хирургическом вмешательстве по устранению рецессии десны закрытием рецессии коронарно-смещенным лоскутом.
Материал и методы
Выделение и культивирование фибробластов. В работе использовали новорожденных кроликов породы Шиншилла. Согласно правилам работы с лабораторными животными применяли стандартные препараты для премедикации и наркоза. Фибробласты кожи новорожденного кролика (ФКНК) выделяли методом миграции из фрагментов кожи. Кожу промывали раствором PBS и нарезали на небольшие фрагменты (3—5 мм). Затем помещали в чашки Петри (Nunc, Дания), накрывали покровным стеклом и добавляли среду DMEM (ICN, США), содержащую 18% эмбриональной сыворотки коров (Gibco, США) и смесь пенициллина и стрептомицина в концентрации по 100 мкг/мл каждого (Invitrogen, Великобритания). Клетки культивировали в СО2 инкубаторе (5% СО2, 95% воздуха) при температуре 37°С. Миграция клеток из кусочков кожи начиналась через 3—5 сут., через 14—20 суток на дне чашки фибробласты образовывали монослой. Пассировали клетки с помощью раствора смеси трипсина (0,25%) и ЭДТА (0,02%) на физиологическом буфере (Invitrogen, Великобритания). В работе были использованы фибробласты 2—7 пассажа. Со 2 пассажа клетки культивировали в среде aMEM (Sigma, США), содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров (HyClone, США) и смесь пенициллина/стрептомицина в стандартной концентрации.
Выделение и культивирование ММСК. Извлекали плоские кости таза новорожденного кролика и помещали их в раствор PBS с добавлением пенициллина и стрептомицина. С костей удаляли мягкие ткани и промывали в растворе PBS. Кости рассекали скальпелем и осторожно вымывали раствором PBS костный мозг при помощи шприца с иглой 23 гош. Ядросодержащие клетки костного мозга выделяли согласно модифицированному методу [33]. Для этого костный мозг суспендировали в 2 мл раствора PBS, суспензию наслаивали на 3 мл раствора гистопака (Sigma, США) плотности 1,077 г/мл и центрифугировали в режиме (800 g, 20 мин) при комнатной температуре. Клетки, находящиеся в интерфазном слое гистопака (в основном, ядросодержащие клетки), переносили в другую пробирку и центрифугировали в десяти объемах раствора PBS при 600 g в течение 15 мин при комнатной температуре для очистки от гистопака. Промытые клетки суспендировали в культуральной среде aMEM (Sigma, США), содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров (HyClone, США) и смесь пенициллина/стрептомицина в стандартной концентрации. Подсчет ядросодержащих клеток проводили под инвертированным микроскопом, используя счетчик форменных элементов крови. Клетки высевали в чашки Петри в концентрации 1х10в кл/см2 и культивировали в СО2 инкубаторе (5% СО2, 95%
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
Оригинальные исследования
37
воздуха) при температуре 37°С. При культивировании получали популяцию ММСК, образующих монослой на дне чашки Петри. Пассировали клетки с помощью раствора смеси трипсина (0,25%) и ЭДТА (0,02%) на физиологическом буфере (Invitrogen, Великобритания). В экспериментах использовали клетки 2—7 пассажа.
Подготовка коллагенового геля с клетками. Для получения коллагенового геля использовали коллаген I типа, полученный из сухожилий крысиных хвостов по стандартной методике [34, 35]. Для достижения ионной физиологической силы в охлажденный раствор коллагена, разбавленный в уксусной кислоте, вносили в концентрированную (10х) питательную среду 199 (Sigma, США). Подводили рН раствора до нейтрального значения путем добавления стерильного 0,34 М раствора NaOH. После чего в полученный раствор быстро добавляли суспензию клеток в среде а-МЕМ с 10% эмбриональной сывороткой коров из расчета 1—1,5х10в клеток в 1 мл геля. Конечная концентрация коллагена в геле была 3 мг/мл.
Методика выполнения оперативного вмешательства на мягких тканях полости рта кролика. Оперативные вмешательства выполняли на верхней и нижней челюстях кроликов породы Шиншилла (n = 7) возрастом 6—12 мес. Выбор кролика в качестве модельного животного обусловлен его большей «практичностью», по сравнению с другими модельными животными: поскольку это животное имеет достаточно большие размеры, в его десну необходимо вносить достаточно большой объем экспериментального материала, в то же время наблюдать за процессом регенерации слизистой технически удобнее, получаются более точные данные.
Для премедикации и наркоза применяли Zoletil50 (Virbac, Франция) из расчета 1—2 мг/кг в комбинации с 2% раствором Xylazin (Bioveta, Чехия) из расчета 0,05 мг/кг. Местно выполняли инфильтраци-онную анестезию Ultracain DS-forte (Aventis Pharma Deutschland, Германия), вводя до 0,4 мл раствора. Хирургическое вмешательство на мягких тканях полости рта кролика выполняли в два этапа. На первом этапе формировали дефект слизистой оболочки в области шейки резца [36]. Как известно, заживление слизистой оболочки полости рта происходит в среднем в течение 7—14 дней, поэтому мы приступали ко второму этапу вмешательства только через 14 дней после первой операции. При этом образовывалась рецессия размерами от 2,5 до 3 мм. На втором этапе у одного резца выполняли операцию по типу методики коронарно-смещенного лоскута [37] с введением культивируемых клеток, заключенных в коллагеновый гель, а в области другого резца проводили контрольное оперативное вмешательство. В зависимости от вводимого в дефект ткани материала области вмешательства были разделены на 6 групп.
Группа № 1 — введение фибробластов, заключенных в коллагеновый гель.
Группа № 2 — введение кондиционированной фибробластами культуральной среды, смешанной с коллагеновым гелем.
Группа № 3 — введение коллагенового геля без клеток.
Группа № 4 — выполнение стандартного оперативного вмешательства по устранению рецессии десны (методика коронарно-смещаемого лоскута).
Группа № 5 — введение ММСК, заключенных в коллагеновый гель.
Группа № 6 — введение кондиционированной ММСК культуральной среды, смешанной с коллагеновым гелем.
Всего было выполнено 28 оперативных вмешательств: по 5 в группах № 1, 3, 4, 5 и по 4 в группах № 2 и № 6.
Для фиксации смещаемого лоскута использовали шовный материал Vicril 5/0 (D&D, Бельгия). При сохранности шовного материала его снимали во время осмотра на 7 сут. Для профилактики инфекционных осложнений по окончании операции кролику внутримышечно вводили антибиотик Амоксициллин 15% (Invesa, Испания) из расчета 7 мг/кг массы тела.
Контрольные осмотры после хирургического вмешательства проводили на 3, 7, 14, 60, 180-e сут. и через 1,5 года. Десну на стадиях заживления фотографировали в прямой и боковой проекции для визуального контроля результатов эксперимента. Уровень клинического прикрепления десны измеряли с помощью стандартной методики с использованием пародонтологического зонда. Толщину новообразованных тканей в области шейки зуба измеряли на расстоянии 2 мм от границы десневого края с помощью иглы и ограничителя, а затем определяли цифровое значение с помощью линейки. Величину вновь образованной ткани десны рассчитывали как разницу между высотой коронки зуба после оперативного вмешательства и ее исходным уровнем до лечения в мм. Площадь мягких тканей, получаемую при устранении рецессии, рассчитывали в см2 с помощью программы ImageJ, разработанной National Institutes of Health (USA) и применяемой для анализа и обработки изображений. Для минимизации возможной ошибки в расчетах операцию повторяли двадцать раз, а при дальнейших расчетах использовали среднее арифметическое значение двадцати измерений. Для контроля масштаба изображения использовали размер ширины коронки зуба, являющийся постоянной величиной. Сравнивали параметры, полученные до начала лечения, через 14, 60 и 180 сут. после оперативного вмешательства на мягких тканях десны.
Гистологическое и иммуногистохимическое исследование. Биоптаты десны забирали на 3-и, 180-е сут. и через 1,5 года после оперативного вмешательства. Фрагменты тканей, взятые у кроликов, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч, после чего материал проходил стандартную обработку в спиртах нарастающей концентрации (70—95%), ксилоле и парафине для изготовления гистологических и иммуногистохимических препаратов с толщиной серийных парафиновых срезов 5 мкм.
Для гистологического исследования срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование включало в себя определение экспрессии виментина (клон V9 RTU) (протеин, экспрессирующийся в фибробластах, клетках эндотелия, гладкомышечных клетках, лимфоцитах) с использованием моноклональных мышиных антител (DakoCytomation). Постановка реакции проводилась непрямым трехступенчатым иммуноферментным LSAB (Labeled streptavidin — biotin, DakoCytomation, LSAB 2 System — HRP) методом визуализации; выявление пероксидазной активности осуществляли
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
38
Оригинальные исследования
с помощью 3,3-диаминобензидина, препараты докрашивали гематоксилином Майера. Полуколичественная оценка экспрессии виментина проводилась тотально во всем срезе в областях с проявлением окрашивания от слабого до выраженного.
Исследование препаратов, окрашенных иммуногистохимическим методом, проводилось при помощи светооптического микроскопа Leica DM LS. Микрофотографирование проводили при помощи цифровой фотокамеры Leica DC320.
Статистическая обработка результатов. В зависимости от вида распределения признаков статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием непараметрических и параметрических методов. Методы описательной статистики включали в себя оценку среднего арифметического (M), стандартной ошибки среднего значения (m), а также частоты встречаемости признаков с дискретными значениями. Статистическая обработка материала выполнялась с использованием стандаpтного пакета пpогpамм пpикладного статистического анализа Statistica 6.0 (StatSoft, США). Критический уровень значимости принимали равным 0,05.
Результаты
Макроскопическая характеристика
регенерирующей десны
В течение первых суток после хирургического вмешательства макроскопические характеристики десны во всех экспериментальных группах не различались: десна была гиперемирована, прилежала к поверхности зуба за счет фиксации шовным материалом. На седьмые сутки после хирургического вмешательства десна в области вмешательства была бледно-розового цвета, определялось расширение зубодесневой борозды, в большей степени выраженное в группах контроля. При введении культивируемых клеток, заключенных в коллагеновый гель, наблюдалось утолщение десны, формирующее «муфту» вокруг зуба.
На четырнадцатые сутки после хирургического вмешательства при введении в десну фибробластов, заключенных в коллагеновый гель (группа № 1), десневой край в области вмешательства был бледный, плотный (рис. 1А). При пальпации в области
введения препарата определялся участок уплотнения мягких тканей. При визуальной оценке состояния мягких тканей в боковой проекции в области введения фибробластов, заключенных в коллагеновый гель, определялось выраженное утолщение слизистой оболочки, отсутствующее в других группах. На четырнадцатые сутки после хирургического вмешательства при введении в десну ММСК, заключенных в коллагеновый гель (группа № 5), десна была бледно-розового цвета, плотно прилежала к поверхности зуба (рис. 1Б). Визуально определялась разница между состоянием десны после применения ММСК, заключенных в коллагеновый гель, и состоянием десны в группах контроля.
Через 2 мес. после хирургического вмешательства при введении в десну фибробластов, заключенных в коллагеновый гель (группа № 1), десневой край все так же плотно прилежал к поверхности зуба, был бледно-розового цвета, но бледнее, чем цвет десны в контрольных группах (рис. 2). При пальпации десны сохранялось ощущение наличия участка уплотнения мягких тканей. При визуальной оценке состояния мягких тканей в группе № 1 в боковой проекции, по сравнению с другими группами, выявлялось утолщение слизистой оболочки в области вмешательства. При введении в десну ММСК, заключенных в коллагеновый гель (группа № 5), через 2 мес. после хирургического вмешательства десневой край плотно прилежал к поверхности зуба, был бледно-розового цвета и визуально не отличался от состояния десны в группах контроля.
Через 6 мес. после хирургического вмешательства в группах № 1 и № 5 десневой край не отличался от такового в контрольных группах за исключением объема регенерировавшей десны. В области введении в десну фибробластов исчезал участок уплотнения слизистой оболочки, восстанавливался естественный бледно-розовый цвет десневого края.
Сравнительная оценка результатов применения различных типов клеток, заключенных в коллагеновый гель, и результатов, полученных в группах контроля, представлены на рис. 3, 4. На рис. 4 видно, что наилучшие клинические результаты были достигнуты при введении в десну клеток, заключенных в коллагеновый гель (группы № 1 и № 5).
Рис. 1. Десна нижней челюсти кролика, 14-е сут. после лоскутной операции с введением клеток в коллагеновом геле в области слизистой правого резца, кондиционированной клетками среды в коллагеновом геле - в области левого (контроль): А - введение аллогенных фибробластов; Б - ММСК
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
Оригинальные исследования
39
Рис. 2.
Десна кролика через 2 мес. после введения аллогенных фибробластов, заключенных в коллагеновый гель (справа), и операции по типу коронарно-смещенного лоскута без каких-либо дополнений (слева)
6
5
4
3
2
1
0
1-я группа 2-я группа 3-я группа 4-я группа 5-я группа 6-я группа
Рис. 3. Прирост слизистой оболочки десны (мм) во всех группах на сроках 14 сут., 2 и 6 мес. *— различия с группой №1статистически значимы (р<0,05);
**— различия с группой №1статистически значимы (р<0,02);
° - различия с группой №5 статистически значимы (р<0,05).
■ 14 сут.
■ 2 мес.
■ 6 мес.
16
14
12
1-я группа 2-я группа з-я группа 4-я группа 5-я группа 6-я группа
а 14 сут. ■ 2 мес. а 6 мес.
Рис. 4. Площадь восстановившейся десны (мм2) во всех группах на сроках 14 сут., 2 и 6 мес. Морфометрическое исследование:
*,** - различия с группой № 1статистически значимы (р < 0,05 и р < 0,02, соответственно); • - различия с контрольной группой № 2 статистически значимы (р < 0,05);
°,°° - различия с группой № 5 статистически значимы (р < 0,05 и р < 0,02, соответственно)
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
40
Оригинальные исследования
Кроме того, во всех экспериментальных группах через 2 мес. после оперативного вмешательства среднее значение величины прироста новообразованной десны уменьшилось, по сравнению с первоначальными результатами, полученными через 14 сут.
Это отражает наличие процессов реорганизации соединительной ткани в ближайшие сроки после операции. Через 6 мес. полученные через 2 мес. значения сохранились только в группах № 1, № 2 и № 5, что свидетельствует о стабильности полученных результатов в течение данного срока наблюдения. Через 14 сут., 2 и 6 мес. наблюдения прирост десны при введении фибробластов, заключенных в коллагеновый гель, который был больше, чем при использовании ММСК.
Во всех группах через 2 мес. после оперативного вмешательства среднее значение площади регенерировавшей десны уменьшилось, по сравнению со значениями, полученными через 14 сут. после вмешательства (см. рис. 4). Эти данные совпадают с результатами, полученными при определении прироста регенерировавшей десны, и соответствуют изменениям объема соединительной ткани в ближайшие сроки наблюдения. Через 2 мес. после введения фибробластов в коллагеновом геле была получена большая площадь десны (S1 = 9,46±2,64 мм2), чем при введении ММСК, заключенных в коллагеновый гель (S5 = 9,02±3,12 мм2). Через 4 мес. в 1 и 5 группах площадь регенерировавшей десны была сопоставима (S1 = 8,96±2,12 мм2; S5 = 9,13±2,52 мм2) и статистически значимо больше, чем в группах контроля (S4 = 4,09±2,01 мм2, p1 4 4 5 <0,02).
Гистологическое и иммуногистохимическое
исследования
При гистологическом исследовании биоптатов десны, полученных на третьи сутки после введения фибробластов в коллагеновом геле, было обнаружено, что в десне присутствовал многослойный
плоский эпителий с проявлениями воспалительной псевдоэпителиоматозной гиперплазии, очаговой слабо выраженной внутриэпителиальной лейкоцитарной инфильтрацией, являющейся, вероятно, реакцией на оперативное вмешательство. В базальных отделах наблюдался очаговый лакунарный некроз эпителия с образованием микрокист и слабо выраженной мононуклеарной инфильтрацией в их краях. Собственная пластинка слизистой оболочки была представлена отечной соединительной тканью с вытянутыми веретеновидными фибробластами, умеренно выраженной гистиоцитарной и выраженной лейкоцитарной инфильтрацией, немногочисленными лимфоцитами. В очагах с обнаружением геля, представленного эозинофильной субстанцией, воспалительная инфильтрация снижалась, фибробласты отсутствовали (рис. 5А). При иммуногистохимическом исследовании наблюдалась выраженная экспрессия виментина в фибробластах собственной пластинки. В тоже время, в области геля выявлялась умеренно выраженная экспрессия виментина в цитоплазме гистиоцитов и отсутствие ее в фибробластах.
При гистологическом исследовании биоптатов десны, полученных на 3 сут. после введения ММСК, было обнаружено, что гистологическая картина в них сопровождалась теми же изменениями, что и в предыдущей группе, но с отсутствием в них ней-трофильных лейкоцитов. Кроме того, в собственной пластинке слизистой оболочки определялись клетки мезенхимальные клетки, окруженные гелем. Наблюдались тонкостенные капилляры, что характеризовало начало формирования грануляционной ткани (рис. 5Б). Реакции в виде гигантских многоядерных клеток типа инородных тел в случае ММСК, заключенных в коллагеновый гель, в биоптатах обнаружено не было. При иммуногистохимическом исследовании наблюдалась выраженная экспрессия виментина в фибробластах собственной пластинки и мезенхимальных клетках, окруженных гелем.
Рис. 5. Десна кролика, 14 сут. после введения клеток, заключенных в коллагеновый гель:
А - аллогенных фибробластов; Б - ММСК.
Окраска: гематоксилин, эозин. Ув. x4D0
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
Оригинальные исследования
41
При гистологическом исследовании биоптатов десны, полученных через 180 сут. и через 1,5 года после введения фибробластов (рис. 6А) и ММСК (рис. 6Б), был выявлен многослойный плоский эпителий с проявлениями очагового слабо выраженного акантоза, в собственной пластинке слизистой оболочки ткань определялось незначительное коли-
чество фибробластов, капилляров, коллагеновых волокон, а также единичные лимфоциты, что гистологически было близко к нормальному строению ткани десны. При иммуногистохимическом исследовании наблюдалась выраженная экспрессия вимен-тина в немногочисленных фибробластах собственной пластинки и перицитах капилляров.
Рис. 6. Десна кролика, 180 сут. после введения клеток, заключенных в коллагеновый гель: А - аллогенных фибробластов; Б - ММСК.
Окраска: гематоксилин, эозин. Ув. х400
Обсуждение
Результаты «клинической части» исследования свидетельствуют, что в течение 2 мес. после хирургического вмешательства во всех экспериментальных группах наблюдалась реорганизация соединительной ткани. Клинически это проявлялось постепенным уменьшением объема десны относительно значений, полученных через 14 сут. после операции. При введении в десну фибробластов (группа № 1) и ММСК (группа № 5), заключенных в коллагеновый гель, а также кондиционированных сред, смешанных с коллагеновым гелем через 6 мес. после операции клиническая картина стабилизировалась. При этом площадь регенерировавшей десны через 6 мес. наблюдения была больше в группе № 1, чем после введения ММСК, однако разница между этими значениями не была статистически значима. В контрольных группах площадь восстановившейся десны была достоверно меньше, чем в группах, в которых в десну вводились культивируемые клетки.
Сравнение результатов применения фибробластов и ММСК новорожденного кролика, заключенных в коллагеновый гель, при устранении рецессии десны указывает на незначительную большую эффективность применения первых. Учитывая такое важное преимущество фибробластов, по сравнению с ММСК, как возможность более простого и менее травматичного получения этих клеток у пациента, при проведении оперативного вмешательства по устранению рецессии десны следует отдать предпочтение фибробластам кожи, заключенным в коллагеновый гель.
Макроскопическая картина восстановления десны после введения фибробластов и ММСК, заключенных в коллагеновый гель, различалась. На ранних сроках заживления раны применение фибробластов сопровождалось изменением цвета десны и появлением области уплотнения слизистой оболочки в области введения культивированных клеток.
Через 6 мес. после операции в этой экспериментальной группе цвет и плотность десны восстанавливались. В то же время использование ММСК не сопровождалось изменением цвета или плотности десневого края. Мы предполагаем, что разница на этапах заживления операционной раны была связана с большей скоростью пролиферации фибробластов по сравнению с ММСК. Можно предположить, что подбор оптимальной концентрации фибробластов в клеточной суспензии, вводимой в состав коллагенового геля, оптимизирует процесс заживления десны.
Крайне важно, что результаты гистологического исследования указывали на восстановление ткани десны путем полной репаративной регенерации в области вмешательства с применением культивируемых клеток, заключенных в коллагеновый гель, уже через 6 мес. наблюдения.
Полученные данные указывают на большую эффективность дополнительного введения во время обычного оперативного вмешательства культивируемых клеток, заключенных в коллагеновый гель, по сравнению с проведением стандартного хирургического вмешательства по устранению рецессии. В этом случае введение культивируемых клеток, заключенных в коллагеновый гель, позволяет получить больший объем прироста десны и более стабильные результаты лечения, по сравнению с дополнительным введением под десну геля коллагена I типа или коллагенового геля, содержащего кондиционированную среду после культивирования в ней клеток. Объем регенерировавшей десны после введения культивируемых клеток, заключенных в коллагеновый гель, сохраняется в отдаленные (6 мес. и 1,5 года) сроки наблюдения. Метод введения культивируемых клеток на коллагеновом носителе прост в исполнении, что позволяет рекомендовать его применение в сочетании с методом коронарно смещаемого лоскута для устранения рецессии десны.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
42
Оригинальные исследования
Выводы
Применение фибробластов новорожденного кролика, заключенных в коллагеновый гель, в качестве дополнения к хирургическому методу устранения рецессии десны позволило уже через 14 сут. получить больший объем десны по сравнению с использованием ММСК, введением коллагенового геля или стандартной операцией без дополнений, при этом объем регенерировавшей десны сохранялся в течение 6 мес. наблюдения. Гистологическое строение тканей десны соответствовало норме.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Kassab M.M., Cohen R.E. The etiology and prevalence of gingival recession. J Am. Dent. Assoc. 2003; 134t2):220—5.
2. Albandar J.M., Kingman A. Gingival recession, gingival bleeding, and dental calculus in adults 30 years of age and older in the United States, 1988—1994. J Periodontol. 1999;70t1): 30—43.
3. Serino G., Wennstrom J.L., Lindhe J. et al. The prevalence and distribution of gingival recession in subjects with a high standard of oral hygiene. J. Clin. Periodontol. 1994; 21(1): 57—63.
4. Roman A., Louise F., M'barek R. et al. Gingival recessions: epidemiologic, etiologic and therapeutic aspects. Inter. J. Dent. Sci. 2009;7 (1).
5. Susin C., Haas A.N., Oppermann R.V. et al. Gingival recession: epidemiology and risk indicators in a representative urban Brazilian population. J. Periodontol. 2004; 75(10): 1377—86.
6. Hosanguan C., Ungchusak C., Leelasithorn S. et al. The extent and correlates of gingival recession in non-institutionalised Thai elderly. J. Int. Acad. Periodontol. 2002; 4(4): 143—8
7. Kozlowska M., Wawrzyn-Sobczak K., Karczewski J.K. et al. The oral cavity hygiene as the basic element of the gingival recession prophylaxis. Rocz. Akad. Med. Bialymst. 2005; 50(Suppl 1): 234—7.
8. Marini M.G., Greghi S.L., Passanezi E. et al. Gingival recession: prevalence, extension and severity in adults. J. Appl. Oral Sci. 2004; 12(3): 250-5.
9. Miller P.D. A classification of marginal tissue recession. Int. J. Periodontics Restor. Dent. 1985; 5: 8-13.
10. Rosetti E.P., Marcantonio R.A., Rossa C. et al. Treatment of gingival recession: comparative study between subepithelial connective tissue graft and guided tissue regeneration. J. Periodontol. 2000; 71: 1441-7.
11. Toscano N., Holtzclaw D., Victor S. A prospective pilot study on the clinical application of stromal vascular fraction stem cells in the treatment of miller class 1 and 2 recession gingival defects. J. Implant. Adv. Clin. Dent. 2011; 3(6): 23-33.
12. Cortellini P., Clauser C., Pini-Prato G.P. Histologic assessment of new attachment following the treatment of a human buccal recession by means of a guided tissue regeneration procedure. J. Periodontol. 1993;64: 387-91.
13. Parma-Benfenati S., Tinti C. Histologic evaluation of new attachment utilizing a titanium-reinforced barrier membrane in a mucogingival recession defect. A case report. J. Periodontol. 1998; 69: 834-9.
14. Trombelli L., Schincaglia G.P., Scapoli C. et al. Healing response of buccal gingival recessions treated with expanded polytetrafluoroethylene membranes. A retrospective report. J. Periodontol. 1995; 66: 14-22.
15. Nickels K., Ratka-Kruger P., Neukranz E. et al. Ten-year results after connective tissue grafts and guided tissue regeneration for root coverage. J. Periodontol. 2010; 81: 827-36.
16. Pini Prato G.P., Tinti C., Vincenzi G. et el. Guided tissue regeneration versus mucogingival surgery in the treatment of human buccal recession. J. Periodontol. 1992; 63: 919-28.
17. Muller H.P., Stahl M., Eger T. Failure of root coverage of shallow gingival recessions employing GTR and a bioresorbable membrane. Int. J. Periodontics Restorative Dent. 2001; 21: 171-81.
18. Wang H-L., Bunyaratavej P., Labadie M. et al. Comparison of 2 techniques for treatment of gingival recession. J. Periodontol. 2001; 72: 1301-11.
19. Harris R.J. A comparative study of root coverage obtained with guided tissue regeneration utilizing a bioabsorbable membrane versus the connective tissue with partial-thickness double pedicle graft. J. Periodontol. 1997; 68: 779-90.
Разработан способ введения культивируемых клеток, заключенных в коллагеновый гель, при оперативном вмешательстве по устранению рецессии десны.
Благодарности
Авторский коллектив выражает искреннюю благодарность за помощь при проведении исследования к.б.н. М.И. Блиновой, к.б.н. Н.М. Плескач, к.м.н. Д.М. Нейзбергу.
20. Sommar P., Pettersson S., Ness C. et al. Engineering three-dimensional cartilage- and bone-like tissues using human dermal fibroblasts and macroporous gelatine microcarriers. J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 2010; 63(6): 1036-46.
21. Rosa A.L., de Oliveira P.T., Beloti M.M. Macroporous scaffolds associated with cells to construct a hybrid biomaterial for bone tissue engineering. Expert. Rev. Med. Devices. 2008; 5(6): 719-28.
22. McGuire M.K., Nunn M.E. Evaluation of the safety and efficacy of periodontal applications of a living tissue-engineered human fibroblast-derived dermal substitute. I. Comparison to the gingival autograft: a randomized controlled pilot study. J. Periodontol. 2005; 76(6): 867-80.
23. Yamada K., Yamaura J., Katoh M. et al. Fabrication of cultured oral gingiva by tissue engineering techniques without materials of animal origin. J. Periodontol. 2006; 77(4): 672-7.
24. McGuire M.K., Scheyer eT., Schupbach P. Growth factor-mediated treatment of recession defects: a randomized controlled trial and histologic and microcomputed tomography examination. J. Periodontol. 2009; 80: 550-64.
25. McGuire M.K., Scheyer eT. A randomized, double-blind, placebo controlled study to determine the safety and efficacy of cultured and expanded autologous fibroblast injections for the treatment of interdental papillary insufficiency associated with the papilla priming procedure. J. Periodontol. 2007; 78: 4-17.
26. Koseoglu S., Duran I., Saglam M et al. Efficacy of collagen
membrane seeded with autologous gingival fibroblasts in gingival recession treatment: a randomized, controlled pilot study. J
Periodontol. 2012 Dec 21. Epub ahead of print.
27. Lorenz K., Sicker M., Schmelzer E. et al. Multilineage differentiation potential of human dermal skin-derived fibroblasts. Exp. Dermatol. 2008; 17(11): 925-32.
28. Junker J.P., Sommar P., Skog M. et al. Adipogenic, chondrogenic and osteogenic differentiation of clonally derived human dermal fibroblasts. Cells Tiss. Organ. 2010; 191(2): 105-18.
29. Киселева Е.В., Чермных Э.С., Воротеляк Е.А. и др. Сравнение дифференцировочных потенций фибробластоподобных клеток стромы костного мозга, жировой ткани, волосяного сосочка и фибробластов дермы человека. Цитология 2009; 51(1): 12-9.
30. Alt E., Yan Y., Gehmert S. et al. Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colonyforming potential. Biol. Cell. 2011; 103(4): 197-208.
31. Блинова М.И., Калмыкова Н.В., Юдинцева Н.М. и др. Использование культивируемых клеток кожи человека для лечения трофических язв. Информ. бюлл. «Клеточные культуры» 2006; 21: 33-44.
32. Калмыкова Н.В., Блинова М.И., Юдинцева Н.М. и др. Эквивалент кожи и способ его получения. Патент РФ 2342164. 2006 Апр 05.
33. Pittenger M.F., Mbalaviele G., Black M. et al. Primary mesenchymal cells. In: Koller M.R., Palsson B.O., Masters G.R.W., editors. Mesenchymal Stem Cells. Human Cell Culture. Kluver Acad. Publ.; 2001. p. 189-207.
34. Chandrakasan G., Torchia D., Piez K. Preparation of intact monomeric collagen from rat tail tendon and skin and the structure of the nonhelical ends in solution. J. Biol. Chem. 1976; 251: 6062-67.
35. Кухарева Л.В. Гидротермическое сокращение коллагеновых волокон как метод исследования их структуры. Цитология 2009; 51(3): 257-64.
36. Kalkwarf K.L., Krejci R.F., Berry W.C. Jr. Chronic mucogingival defects in miniature swine. J. Periodontol. 1983; 54(2): 81-5.
37. Tarnow D.P. Semilunar coronally repositioned flap. J. Clin. Periodontol. 1986; 13(3): 182-5.
Поступила 27.05.2013
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
