Десна, как источник стромальных клеток с высоким дифференцировочным и репаративным потенциалом Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

DOI: 10.23868/201707014

десна, как источник стромальных клеток с высоким дифференцировочным и репаративным потенциалом

ВЛ. Зорин 12, А.И. Зорина 1, И.И. Еремин 2, Р.В. Деев 12■3, П.Б. Копнин 4, Г.А. Воложин 5, А.А. Пулин 2

1 Институт стволовых клеток человека, Москва, Россия

2 Центральная клиническая больница с поликлиникой, Москва, Россия

3 Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Рязань, Россия

4 Российский онкологический центр им. Н.Н. Блохина, Москва, Россия

5Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова, Москва, Россия

Gingiva as a source of stromal cells with high differentiating and reparative potential.

V.L. Zorin 12, A.I. Zorina 1, I.I. Eremin 2, R.V. Deev1 2 3, P.B. Kopnin 4, GA. Volozhin 5, АА. Pulin 2

1 Human Stem Cells Institute, Moscow, Russia

2 Central Clinical Hospital with Outpatient Health Center, Moscow, Russia

3 I.P. Pavlov Ryazan State Medical University, Ryazan, Russia

4 N.N. Blokhin Cancer Research Center, Moscow, Russia

5 A.I. Evdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry, Moscow, Russia

В настоящем обзоре представлены систематизированные сведения относительно свойств мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, а также детально рассмотрены дифференцировочный и репаративный потенциалы стромальных клеток десны и возможности их применения в регенеративной медицине.

Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, фибробласты, десна, костный мозг, кожа.

This review is focused on systematization of data describing several features of multipotent mesenchymal stromal cells. It also presents a detailed review of differentiation and reparation potential of human gingiva-derived stromal cells and opportunities of their therapeutic application in regenerative medicine.

Keywords: multipotent mesenchymal stromal cells, fibroblasts, gingival, bone marrow, skin.

введение

Современная регенеративная медицина решает задачи восстановления поврежденной ткани с помощью активации эндогенных стволовых клеток или трансплантации ауто- и аллогенных клеток. Одна из концепций последнего направления базируется на применении региональных стромальных клеток с целью восстановления структурных и функциональных нарушений тканей и(или) органов при лечении различных заболеваний [1—4]. В качестве главного кандидата для реализации данной концепции рассматривают мезенхимальные стволовые и(или) прогениторные клетки, входящие в состав соединительной ткани многих органов и являющиеся одним из самых распространенных типов стволовых клеток (СК) взрослого организма [5—8].

В литературе встречаются различные названия этих клеток, наиболее часто — «мезенхимальные стволовые клетки» (МСК) [9, 10] или «мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки» (ММСК) [11]; были предложены и другие термины: «стволовые клетки соединительной ткани» — для клеток соединительной ткани лица и ротовой полости [12]; «скелетные стволовые клетки» — для стромальных клеток, выделенных из костного мозга [13]. Мы будем использовать термин «мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки» (ММСК). Несмотря на практически повсеместное распространение этих клеток в организме, вопросы адекватного выбора оптимального тканевого источника для их получения остаются в центре внимания исследователей.

e-mail: zorin@hsci.ru

Цель обзора — на основе анализа исследований последних лет рассмотреть дифференцировочный и репаративный потенциалы клеток десны и возможности их применения в регенеративной медицине. Речь пойдет о мультипотентных мезенхимальных стромальных клетках (ММСКд) и фибробластах (Фд), получаемых из соединительной ткани десны.

регенеративные свойства мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток

Наиболее хорошо изученным и широко используемым в клинической практике типом клеток являются мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, открытые в 1969 г. Р.К. Чайлахяном (сотрудником лаборатории иммуноморфологии, возглавляемой А.Я. Фриденштейном) в монослой-ной культуре костного мозга [14]. Сегодня мульти-потентные мезенхимальные стромальные клетки и подобные им клетки найдены, практически, во всех органах и тканях организма человека. А.Я. Фриден-штейн с соавт. (1974) охарактеризовали ММСК как популяцию клоногенных стромальных клеток-предшественников, которые при пассировании способны образовывать монослойную культуру [15]. Все типы ММСК отличает ряд присущих им свойств:

— клоногенный потенциал (могут образовывать в культуре клеточные колонии — клоны клеток, происходящие из одной клетки-предшественницы) [9, 13, 15—18]. Клональная природа колоний позволяет определить содержание этих клеток в органах кроветворения и иммунитета и изучить изменение

их численности при различных патологических состояниях организма или воздействиях на организм (облучение, травма и т.д.) [19—22];

— способность к самоподдержанию, то есть производству дочерних клеток, обладающих таким же потенциалом, что и родительские клетки. При этом ММСК могут делиться как асимметрично (образуя две различные дочерние клетки, одна из которых является ММСК, а другая программируется к дифференцировке в коммитированную клетку), так и симметрично (продуцируя две идентичные копии исходной ММСК) [23];

— способность к мультилинейной дифференцировке, как в мезенхимальном направлении — в различные типы клеток соединительной ткани (в остео-, хондро-, и адипогенные клетки) [10, 18, 23—30], так и в немезенхимальном — в эндотелиальные [31], мышечные [32] и нейрональные клетки (нейрональ-ная и глиальная дифференцировка [33]), кератино-циты [34-37];

— способность продуцировать широкий спектр биологически активных веществ, способствующих репарации тканей, включая васкулогенез и эпители-зацию [38-40];

— выраженные иммуномодулирующие свойства [41, 42].

Анализ кондиционированной среды, полученной в процессе культивирования ММСК, выявил, что данные клетки секретируют множество факторов роста/ цитокинов, в том числе проангиогенные (разные типы VEGF) и стимулирующие эпителиальный морфогенез (EGF и FGF7) [43], физиологический уровень которых, как показано в исследованиях, является ключевым для обеспечения регенеративных процессов в тканях, например при заживлении ран [44].

К настоящему времени биологические особенности ММСК достаточно хорошо описаны. Международным обществом клеточной терапии (ISCT, International Society for Cellular Therapy) на основе характеристики ММСК костного мозга утверждены минимальные критерии для морфофункциональной характеристики всех ММСК-подобных популяций [45]: способность исследуемых клеток к адгезии к культуральному пластику; дифференцировка in vitro в остео-, хондро- и адипогенном направлениях; экспрессия маркеров CD105, CD73, CD90, характерных для стромальных клеток, и отсутствие экспрессии маркеров CD45, CD34, CD14, CD11 b, CD79a, CD19, HLA-DR, характерных для гемопоэ-тических и эндотелиальных клеток. Наличие указанных критериев играет важную роль в развитии регенеративной медицины, поскольку стандартизация клеточного материала является необходимым условием для успешного внедрения в практику результатов биомедицинских разработок, основанных на использовании ММСК.

Способы выделения мультипотентных

мезенхимальных стромальных клеток

ММСК можно выделить из разных тканей, например, из биоптатов соединительной ткани (в частности, ММСК десны и кожи) посредством их ферментативного расщепления или из мононуклеарной фракции клеток, полученной путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла из аспирата костного мозга (ММСК костного мозга). Культивируют ММСК, как правило, в среде альфа-МЕМ с добав-

лением сыворотки эмбрионов коров. Для получения фибробластов используют аналогичные протоколы выделения, т.к. оба типа клеток адгезивны к культуральному пластику и имеют сходные условия культивирования. Первичная (исходная) культура стромальных клеток гетерогенна вследствие наличия в ней и ММСК, и дифференцированных фибробластов. Морфологически и по большинству общих молекулярных маркеров ММСК и фибробласты схожи, что затрудняет их идентификацию, поскольку до сих пор не найдены надежные специфические маркеры каждого из них [6, 46—48]. Тем не менее, в некоторых работах было показано, что ряд маркеров (STRO-1, p75, Oct-4, SOX-2, SSEA-4, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD133, CD146) с достаточной долей достоверности свидетельствуют о принадлежности исследуемых клеток к стволовым, поэтому могут быть использованы для идентификации ММСК [12, 49]. В первичной культуре стромальных клеток ММСК составляют небольшой процент, по мнению В. Fournier и соавт. (2013) — менее 1% от общей клеточной популяции [6].

Для получения ММСК наиболее часто используют два метода: метод избирательного клонирования, основанный на выделении клоногенных клеток-предшественников (КОЕ-ф) из первичной культуры стромальных клеток, и клеточный сортинг, при котором клетки изолируют с помощью проточного цитофлу-ориметра, оснащенного клеточным сортером, выявляя их по экспрессии маркеров клеточной поверхности ММСК [5, 6, 15, 38, 50, 51].

Используя метод избирательного клонирования стромальные клетки первичной культуры или суспензию костного мозга эксплантируют с низкой плотностью посева в культуральную посуду и культивируют до образования клеточных колоний. Затем самые большие колонии изолируют: именно их клетки становятся кандидатами в ММСК. В культуре фибробластов стандартно образуются 3 типа колоний, которые принято называть плотными, диффузными и смешанными, наибольшие по размеру — плотные колонии [20, 52].

Для подтверждения наличия у изолированных клеток характерных черт ММСК проводят анализ на ключевые маркеры и способность этих клеток к дифференцировке в ортодоксальных направлениях (остео-, хондро-, адипогенном) [5, 6, 27, 45].

Исследования показывают, что по сравнению с исходной культурой стромальных клеток (выделенных, например, из десны или кожи) — смешанной, содержащей преимущественно дифференцированные фибробласты — клетки образованных колоний не только обладают более высокой способностью к самоподдержанию и мультипотентной дифферен-цировке, но и сохраняют этот потенциал на протяжении нескольких пассажей [6, 26, 38].

Основными свойствами ММСК, благодаря которым применение этих клеток становится перспективным направлением в регенеративной медицине, являются: высокая пролиферативная активность, способность к мультипотентной дифференцировке, имму-номодуляторный эффект, стимуляция ангиогенеза и эпителизации [6, 29-31, 38, 39, 41, 43, 44, 53, 54]. Однако результаты исследований in vivo показали, что лишь небольшое количество ММСК «встраивается» в ткань. Ключевую же роль в процессе регенерации, скорее всего, играет паракринный эффект (благодаря факторам роста и(или) иным цитокинам, продуцируе-

мым трансплантированными клетками), который реализуется путем стимулирующего воздействия на резидентные клетки ткани-реципиента [38, 39, 43, 44, 55]. В этой связи можно полагать, что клинический эффект при использовании ММСК обусловлен в меньшей степени дифференцировкой этих клеток, приводящей к восстановлению клеточного гомеоста-за, и в большей степени их паракринной активностью, которая способствует иммуномоделированию и ангиогенезу, активации/пролиферации резидентных клеток, а также и реэпителизации (при заживлении ран) [55, 56].

Исследованиями в этой области занимаются ведущие лаборатории мира. В центре внимания остаются вопросы, касающиеся морфофункциональной иерархии выделенных из различных тканей ММСК: идентичны ли они, относятся ли к единой популяции или являются отдельными субпопуляциями и пр. [27, 57-59].

Десна, как источник стромальных клеток,

свойства

Современные стандартные протоколы выделения и культивирования ММСК позволяют получать их практически из всех органов и тканей вне зависимости от эмбрионального происхождения последних, в частности из жировой ткани, плаценты, кожи, пери-одонта, тимуса, надкостницы, мышц, синовиальной жидкости, легких, крови, пуповинной крови, тканей ротовой полости и др. [6, 60, 61]. Столь широкое распространение ММСК в организме связывают с их периваскулярной локализацией [62, 63].

На сегодняшний день в регенеративной медицине наиболее востребованы ММСК костного мозга (ММСКкм). Однако получение этого типа клеток имеет определенные ограничения: возраст пациента (показано, что их функционирование у пожилых пациентов снижено) [64] и травматичность процедуры забора красного костного мозга [65].

Большой интерес вызывают интраоральные источники ММСК, в частности слизистая оболочка полости рта: специфичность ее строения, особенности подлежащих структур, кровоснабжения, иннервации, связь с надкостницей - эти и другие аспекты могут оказывать влияние на количество ММСК, их проли-феративный и дифференцировочный потенциалы, спектр продукции биологически активных веществ [3, 4, 6-8, 53, 58].

Десна, покрывающая края челюстей, является составной частью слизистой оболочки полости рта. Морфологически она представлена многослойным плоским эпителием (на 90% — ороговевающим, на 10% — неороговевающим) и собственной пластинкой из рыхлой и плотной волокнистой соединительной ткани [58].

Необходимо отметить следующие характеристики соединительной ткани десны:

— обладает высоким терапевтическим потенциалом как аутографт (для восстановления дефицита мягких тканей ротовой полости, уретры и т.п.), благодаря чему уже не одно десятилетие успешно используется в клинической практике [53];

— служит важным биологическим барьером и выполняет роль существенного компонента иммунитета ротовой полости [66];

— отличается высокой способностью к регенерации (среди тканей организма у десны скорость самообновления одна из самых высоких) [53];

— легкодоступна, процедура биопсии малоинва-зивна и не доставляет пациенту дискомфорта [66— 68];

— процесс восстановления структуры тканей десны после повреждения происходит значительно быстрее, чем при заживлении кожных ран [69—71], и без образования рубца [66, 69—72].

Этиология уникального заживления ран десны (как и слизистой оболочки ротовой полости в целом) [73] до конца не изучена. Для объяснения этого феномена было предложено несколько моделей заживления ран [73-76] и на основании полученных данных был сделан вывод о том, что ключевую роль в этом сложном процессе играют фибробласты [53, 71, 76] и специфичные мезенхимальные стволо-вые/прогениторные клетки [8, 66—68].

Происхождение мультипотентных мезенхимальных

стромальных клеток десны

Черепно-мозговые мезенхимальные ткани, включая соединительную ткань ротовой полости, происходят из нервного гребня (НГ) и производных мезодермы. Стволовые клетки НГ (СКНГ), мигрируя в вентральном направлении через передний отдел сомита, дают начало мезенхимальным структурам, в том числе и соединительнотканной пластинке десны [51, 77—79]. L. Davies и соавт. (2010) показали, что стволовые/прогениторные клетки, выделенные из соединительнотканной пластинки десны, берут свое начало из НГ [51]. Согласно результатам других исследований, дочерние (прогениторные) клетки, образующиеся в результате деления СКНГ (так называемые постмиграционные НГ-клетки, ПМ-СКНГ), присутствуют в тканях взрослого организма [4]; видимо, именно они и представляют собой тканеспе-цифичные прогениторные НГ-клетки [4, 79, 80].

Анализ клеточных популяций, выделенных из десны мышей и человека, подтвердил, что большинство неэпителиальных клеток десны также произошли из клеток НГ (НГ-ММСКд) [4, 81]. Одновременно с этим в десне присутствуют и ММСК, происходящие из мезодермы (М-ММСКд). Согласно результатам работ, проведенных Х. Xu и соавт. (2013) на Wnt1-Cre/R26R двойных трансгенных мышах, 90% ММСКд берут начало из НГ и 10% — из мезодермы [81]. Этот факт свидетельствует о наличии в десне гетерогенной популяции ММСКд, имеющих различное эмбриональное происхождение [3, 4, 81].

Свойства мультипотентных мезенхимальных

стромальных клеток десны

Стволовые и (или) прогениторные клетки десны (ММСКд) были выделены и описаны целым рядом научных коллективов [66—68, 82—84].

ММСКд характеризуются высоким клоногенным потенциалом [66, 85], способностью к самоподдержанию (что было подтверждено серией последовательных трансплантаций in vivo) [86, 87], соответствуют минимальным критериям, установленным Международным обществом клеточной терапии для ММСК [45, 66, 68, 82, 83].

Выделенные ММСКд экспрессируют поверхностные маркеры, подобные маркерам ММСКкм, обладают сходными дифференцировочным потенциалом и иммуномодуляторными свойствами [47, 66, 88] (табл., рис. 1).

таблица. Сравнительная характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из костного мозга (ММСКкм) и десны (ММСКд) человека (по [6], с изм.)

ММСКкм

Происхождение

Костный мозг человека

Метод Маркеры Маркеры Дифференцировочный

выделения «+» «-» потенциал

Метод

избирательного клонирования

ММСКд Десна человека

Метод

избирательного клонирования

STRO-1 SSEA-4 CD29 CD44 CD73 CD90 CD105 CD146 VCAM1C Coll1 Coll3 ON FGF2

STRO-1 SSEA-4 CD29 CD44 CD73 CD90 CD105 CD146

CD11b CD14 CD34 CD45 HLA-DR MyoD

NF Coll2 OC BSP OP PPARg

CD34 CD45 CD117 CD200 HLA-DR

In vitro:

Остео-, хондро-,адипогенное направления, фибробласты, гепатоциты, миобласты (скелетные и миокардиальные), гладкомышечные, эндотелиальные нейрональные и глиальные клетки In vivo (эксперимент): Остео- и хондробласты, гепатоциты, гладкомышечные и эндотелиальные клетки

Применение в клинических исследованиях:

При несовершенном остеогенезе, инконтиненции,буллезном эпидермолизе [89,90], эректильной дисфункции,регенерации эндотелия,печени, хряща, инфаркте миокарда

In vitro:

Остео-, хондро-, адипогенное направления, эндотелиальные клетки, миобласты, нейрональные клетки

In vivo:

Остеобласты, миобласты [100,148,149], фибробласты (с образованием характерной для десны соединительной тканью)

Дифференцировочный потенциал ММСКд. Целый ряд исследований (in vitro и in vivo) подтвердил способность MMCKq к дифференцировке в ортодоксальных направлениях. Так, в работе S. Ge и соавт. (SOIS) показано, что при трансплантации ММС1<д (без предварительной индукции) иммуноде-фицитным животным образуются компоненты соединительной ткани, аналогичные таковым десны [88]. Н. Yang и соавт. (SO13) регистрировали образование костного матрикса при подкожной трансплантации иммунодефицитным мышам MMCKq, культивированных в среде с остеогенными факторами, на носителе [91]. В работе V. Zorin и соавт. (SO14) идентифицировано повышение продукции специфичных для костного матрикса белков, что является одним из предикторов остеогистогенеза [9Э]. B. Fournier и соавт. (SO1O) описали образование костной ткани после подкожной имплантации MMCKq (как и при введении ММС^м в качестве положительного контроля) на кальцийфосфатном носителе [66]. F. Wang и соавт. (SO11) отмечали эффективное восстановление целостности костной ткани после трансплантации MMCKq на коллагеновом носителе в область костного дефекта в нижней челюсти ШхЭх^м) и своде черепа (S мм) крыс [93]. K. El-Sayed и соавт.(SO1S) наблюдали регенерацию всех тканей периодонта, включая кость, цемент зуба и связки периодонта при использовании MMCKq, культивированных на депротеинизированной бычьей губчатой кости или коллагеновом носителе, для восполнения

экспериментально созданных дефектов периодонта у карликовых свиней [94].

Однако в некоторых работах было отмечено, что в условиях активного воспалительного процесса in vivo, а также при культивировании в присутствии провоспалительных цитокинов in vitro может наблюдаться подавление способности ММСКд дифференцироваться в соответствующем направлении [95].

Во многих исследованиях показана способность ММСКд к дифференцировке и в эктодермальном направлении — в нейрональные и нейроглиальные клетки, что, возможно, объясняется участием мезенхимы нервного гребня в происхождении собственной пластинки десны [51, 66, 96].

Таким образом, наряду с дифференцировкой в мезодермальном направлении, ММСКд способны дифференцироваться и в немезенхимальные типы клеток [97]. Эта особенность ММСКд, вероятно, связана с их происхождением из двух эмбриональных источников: М-ММСКд — из мезодермы и НГ-ММСКд — из нервного гребня (рис. 2).

Интересно отметить, что НГ-ММСКд, по сравнению с М-ММСКд, обладают более высоким потенциалом к хондрогенной дифференцировке (показано в условиях in vitro) и экспрессируют более высокие уровни маркеров клеток нервной ткани (р-тубулина, нестина и нейрофиламента М) [4, 81].

При этом НГ-ММСКд ассоциируются с определенным фенотипом тканеспецифичных прогениторных клеток, в них экспрессируются гены, связанные с НГ:

Nestin, Snai1, Twist1, Pax3, Sox9, FoxD3. Экспрессия этих генов выявлена и в других клетках, ведущих свое происхождение из НГ, в частности, в клетках-предшественниках кожи (skin-derived precursor cells, SCPs) и пост-миграционных НГ-стволовых клетках (pNCSCs) ПМ-СКНГ [98].

Следует подчеркнуть, что дифференцировочный потенциал ММСКд вышеуказанными направлениями не ограничивается. Так, в работе Q. Zhang и соавт. (2009) было показано, что при культивировании ММСКд в среде, способствующей росту эндотели-альных клеток, около 40% ММСКд начинали экс-прессировать маркер эндотелиоцитов CD31 [68].

В.Л. Зорин и соавт. (2014) [99], S. Ansari и соавт. (2016) [100] экспериментально выявили способность ММСКд, как и ММСК из других источников, дифференцироваться в мышечном направлении.

ММСКкм

ММСКд

А

Б

В

Г

Д

Рис. 1. Имунофлуоресцентный анализ экспрессии внутриклеточных маркеров ММСК десны и костного мозга: А — ф-актин; Б — виментин; В — коллаген I типа; Г — коллаген III типа; Д — эластин. Визуализация ядер с помощью ОДР!. Масштабный отрезок: 20 мкм

Рис. 2. Схематическое изображение фибробластического дифферона десны. ММСКд характеризуются высокими пролиферативным и иммуномодуляторным потенциалом; НГ-ММСКд, по сравнению с М-ММСКд, обладают более выраженной хондро-и нейрогенной активностью

Иммунорегуляторные свойства ММСКд. ММСКд оказывают существенное влияние на быструю реализацию выраженного противовоспалительного эффекта, что является одной из ключевых составляющих уникальной ранозаживляющей способности слизистой оболочки полости рта [56, 101].

Было установлено, что ММСКд обладают иммун-носупрессивными свойствами, которые проявляются в виде снижения пролиферации и подавления активации иммунокомпетентных клеток (главным образом, Т-лимфоцитов) [68, 82, 83], ингибирования продукции простагландина Е2 дендритными клетками и дегрануляции тканевых базофилов, приобретения макрофагами противовоспалительного фенотипа М2 [56, 86, 102—106]. Последний феномен наблюдали как in vitro в опытах по сокультивированию макрофагов с ММСКд, так и in vivo — при трансплантации ММСКд эти клетки мигрируют в область кожной раны, где взаимодействуют с макрофагами и поляризуют их в М2-фенотип, тем самым значительно ускоряя течение раневого процесса [56, 102, 106].

ММСКд, вызывая М2-поляризацию макрофагов, приводят к индукции экспансии клеток Th17, увеличению содержания маннозных рецепторов (MR, CD206) и секреторных цитокинов IL-10, а также к снижению содержания TNF-a и IL-6 [103]. Таким образом, ММСКд способствуют значительному снижению клеточной инфильтрации раны и, соответственно, снижению воспалительных процессов. Было высказано предположение, что эти клетки оказывают противовоспалительный эффект также и за счет IFN-c индуцированной экспрессии IDO (индолеами-на 2,3-диоксигеназы), COX-2 (циклооксигеназы-2) и индуцибельной синтазы окиси азота, которые являются ключевыми иммуносупрессорными факторами [3, 68, 103].

Все указанные факторы, способствуя редукции воспалительных реакций, в частности при заживлении кожных ран, значительно ускоряют процесс регенерации тканей.

Немаловажным является и отсутствие на ММСКд экспрессии HLA-антигенов класса II — особенность, выявленная in vitro [103, 105, 107]. Этот факт был подтвержден в эксперименте: при внутривенном

введении ММСКд человека животным наблюдали подавление реакции отторжения аллогенных тканей и контактной гиперчувствительности [6, 81, 82, 86]. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования аллогенных ММСКд для профилактики развития и лечения, в частности, такого осложнения, как реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ) [7, 108].

При этом следует отметить, что субпопуляция НГ-ММСКд обладает более выраженными иммуно-супрессорными свойствами по сравнению с субпопуляцией М-ММСКд. Это было обнаружено in vitro при индукции апоптоза активированных Т-клеток [81], а также в условиях in vivo при лечении экспериментально индуцированного колита у мышей [68].

Роль ранних стволовых и(или) прогениторных клеток нервного гребня в популяции ММСКд. Исключительные регенеративные возможности ММСКд, по всей видимости, связаны с присутствием в данной популяции ранних стволовых/прогениторных клеток НГ (СКНГ или ПМ-СКНГ, или, возможно, обеих этих субпопуляций — на сегодняшний день остается до конца не выясненным; мы будем использовать термин СКНГ), с характерным для них фенотипом и исключительно широким дифференцировочным потенциалом [3, 4, 6, 53, 81]. Так, эксперименты, проведенные X. Xu и соавт. (2013) на 8-недельных NC-reporter Wnt1 -Cre/R26RYFP мышах, показали, что СКНГ присутствуют в соединительной ткани десны и представляют собой довольно большую часть ММСКд [81]. СКНГ сохраняются и в десне взрослых особей, о чем свидетельствуют исследования, проведенные на 8-месячных мышах той же линии [4]. Однако с возрастом их содержание уменьшается, и выделить их (из-за небольшого количества клеток и трудоемкости протоколов выделения) довольно сложно [109].

Учитывая высокий нейрональный потенциал культур Фд и ММСКд, В. Fournier и соавт. (2016) [4] предложили оригинальное решение экспансии клеток с НГ-подобным фенотипом (СКНГ) посредством культивирования Фд и ММСКд по протоколу флотирующих сфер (нейросфер) в бессывороточной среде в присутствии митогенов EGF и FGF2 (по аналогии с культивированием нейрональных клеток-предшественников) [110, 111]. Показано, что в Фд и ММСКд экспрессируются ассоциированные с НГ гены (Nestin, Snai1, Twist1, Pax3, Sox9 и FoxD3) и при культивировании в вышеуказанных условиях и Фд, и ММСКд способны образовывать нейросферы. Структурно эти клеточные агрегаты представляют собой сферические образования, на внешних оболочках которых расположены поляризованные нестин-поло-жительные клетки (ММСКд-nestin + ), окруженные внеклеточным матриксом (ВКМ). Последний содержит белки, характерные для эмбриональной ткани. ММСКд-nestin+ характеризуются высокой экспрессией нейрональных маркеров MAP2 и маркеров, ассоциированных со Шванновскими клетками. Также их отличает способность дифференцироваться в TAU + , нейрофиламент-М и GFAP-положительные клетки, что подтверждает наличие у ММСКд-nestin + высокого нейронального дифференцировочного потенциала [4, 110]. По мнению В.Fournier и соавт. (2016) [4], а также других исследователей образование нейросфер происходит при активном участии специфических белков кадгеринов, которые могут быть использованы в качестве маркера для селективного выделения ММСКд-nestin+ [112-114].

При этом MMCKQ-nestin+ демонстрируют значительное увеличение уровня экспрессии генов, в том числе Nestin, Tenascin-C, Sox9, регулирующих развитие НГ- и нейрональных стволовых/прогениторных клеток. Одновременно с этим наблюдается более низкая регуляция генов, отражающих фибро-бласт-ассоциированный синтез коллагена I типа, по сравнению с таковой в стандартной монослойной культуре. Отметим, что можно добиться переключения фенотипа — повышения экспрессии генов nestin и Sox9 и снижения регулирования гена коллагена

1 типа, заменив стандартную культуральную среду на бессывороточную с добавлением митогенов.

Усиление фенотипа MMCKQ-nestin+ в нейрос-ферах в сторону нейронального (или НГ-подобного), по мнению В. Fournier и соавт. (2016), происходит под контролем создаваемых ими же ниш, некоторые особенности которых характерны для эмбриональной ткани [4]. Эти ниши, по всей видимости, являются критичными факторами поддержания НГ-подобного фенотипа. При культивировании MMCKQ-nestin+ в стандартной монослойной культуре соответствующие их фенотипические признаки утрачиваются.

В работе В. Fournier и соавт. (2016) было также показано, что после эксплантации в монослой-ные культуры выделенные из нейросфер ММСКд-nestin + генерируют адгезивные пролиферирующие популяции фибробластоподобных клеток, содержащие две субпопуляции клеток: nestin + и collagen I + [4]. Тем самым было подтверждено, что клеточные популяции соединительной ткани десны содержат

2 типа ММСК - НГ-ММСКд (Nestin + ) и М-ММСКд (collagen I + ).

Итак, учитывая результаты многочисленных исследований, можно заключить, что соединительная ткань десны содержит гетерогенную популяцию ство-ловых/прогениторных клеток, из которой можно выделить как минимум три субпопуляции: НГ-ММСКд, М-ММСКд и более ранние клетки-предшественники (СКНГ) ММСKд-nestin + . Из них НГ-ММСКд и ММСKд-nestin+ отличаются более выраженным нейрональным дифференцировочным потенциалом. Важно отметить, что и селективная, выделенная с помощью метода избирательного клонирования, культура фибробластоподобных клеток, и неселективная (первичная) содержат СКНГ, которые можно получить в необходимом для терапии количестве посредством их экспансии по методу флотирующих сфер.

Очевидно, что получение регенеративных клеток десны, обладающих иммунорегуляторными, клоно-генными и пролиферативными свойствами, широким дифференцировочным потенциалом, не может не представлять интереса для медицины, поскольку открывается возможность создания универсального терапевтического клеточного продукта для лечения самого широкого спектра заболеваний.

терапевтический потенциал фибробластов

десны

Дифференцированные фибробласты (гетерогенная популяция клеток разной стадии дифференци-ровки) являются ключевым звеном фибробластиче-ского дифферона. Именно эти клетки обеспечивают морфофункциональную организацию соединительной ткани и реализуют ее физиологический и репара-

тивный гистогенез [46, 47, 53, 115, 116]. По мнению ряда авторов, фибробласты служат главным «действующим лицом» в уникально быстрой и безрубцо-вой регенерации десны после ее повреждения [6, 53, 56, 66].

Регенеративный эффект трансплантированных Фд обеспечен целым рядом их свойств.

1. Фд обладают высокой способностью к редукции воспаления (доказано in vivo), значительно превосходя в этом процессе, в частности, фибробласты кожи (Фк) [101, 117]. Были выявлены значительные различия и в продукции цитокинов/медиаторов, участвующих в воспалительном процессе, и в ответной реакции на них иммунных клеток [53]. Например, было показано, что Фд продуцируют больше остео-протегерина (остеокластингибирующего фактора) и меньше остеокластогенных факторов по сравнению с Фк, что, соответственно, приводит к ослаблению остеокластогенных процессов, способствующих резорбции костной ткани [118]. Фд также продуцируют большие количества матричных металлопротеи-наз [76], регулирующих активность воспалительных медиаторов и их ингибиторов [119]. По сравнению с Фк они менее чувствительны к профиброгенному действию фактора роста TGF-P1, стимулирующего развитие фиброза и образование рубцов [53, 120, 121].

2. Иммуносупрессивная активность Фд проявляется в виде подавления пролиферации моноцитов в периферической крови и ингибирования их диффе-ренцировки в дендритные клетки (в условиях in vitro) [122, 123], что может способствовать повышению иммунотолерантности, поскольку дендритные клетки оказывают большое влияние на развитие иммунного ответа [68, 86, 121].

3. Продукция Фд широкого спектра проангиоген-ных факторов, включая VEGF, CXCL12, IL8, MCP-1, CCL2 и CXCR1, стимулирует неоангиогенез и рост эндотелиальных клеток (показано in vitro) [6, 53, 76, 124].

4. Фд отличаются интенсивной секрецией факторов роста, стимулирующих реэпителизацию, включая фактор роста кератиноцитов (FGF7) и гепато-цитов (HGF/SF) [125, 126]. При сокультивировании с кератиноцитами Фд проявляют паттерн экспрессии матричной металлопротеиназы 1, регулирующей миграцию кератиноцитов в процессе заживления раны [53, 56, 127, 128].

Эксперименты in vivo также подтвердили, что при введении Фд в системный кровоток иммунодефи-цитных мышей ускорялось заживление ран, сопровождаемое быстрым неоангиогенезом и реэпители-зацией [102]. Другие исследования показали, что именно фибробласты определяют эпителиальный фенотип слизистой оболочки ротовой полости: при трансплантации в десну Фд индуцируют образование эпителия кератинизированной десны, идентичного эпителию этой ткани в норме [6, 129]. Были получены данные, свидетельствующие о способности Фд регулировать эпителизацию тканей и вне ротовой полости. В частности, при использовании биоинженерных конструктов, содержащих аутогенные Фд, наблюдается выраженная регенерация функционального эпителия трахеи у крыс [130, 131]. Следует отметить, что у Фк такая способность к индукции развития соответствующего морфологического или функционального эпителиального фенотипа не выявлена [130].

Полученные данные говорят о том, что Фд обладают высоким потенциалом для стимуляции развития эпителия и регуляции экспрессии цитокератинов в эпителиальных клетках [132]. При этом они оказывают значительное влияние не только на эпителиальный морфогенез, но и на структуру эпителиальной ткани. В частности, результаты экспериментов по рекомбинации тканей и клеток подтверждают, что формирование фенотипов эпителия слизистой оболочки ротовой полости напрямую зависит от расположенной под ним соединительной ткани и составляющих ее фибробластов [6, 132].

Основная функция Фд, как и фибробластов других тканей, заключается в продукции и организации внеклеточного матрикса (ВКМ), который создает единое структурное пространство десны и специфические ниши для клеток, включая эндотелиальные, эпителиальные и ткане-специфические стволовые клетки [118]. Взаимодействие клеток осуществляется посредством секретируемых Фд факторов ро-ста/цитокинов по типу «рецептор-лиганд», а также за счет непосредственных контактов «клетка-клетка», образуя тем самым сложные коммуникационные сети.

Роль фибробластов десны и кожи в процессе

заживления ран. Сравнительный анализ

Исключительный вклад Фд в быструю регенерацию десны без образования рубцов после повреждений заметно выделяет их среди фибробластов других тканей (за исключением слизистой оболочки ротовой полости). Так, при их сравнении с Фк, которые чаще всего используют для заживления кожных ран различного генеза, было выявлено, что эти два типа фибробластов практически не отличаются друг от друга по способности сокращать коллаген и фибриновый гель in vitro (общепринятый метод для изучения функциональной активности фибробластов) [133] (рис. 3). Однако была отмечена более высокая способность Фд к миграции и внедрению в трехмерный коллагеновый матрикс за счет быстрой и интенсивной секреции ими PDGF (тромбоцитарный фактор роста), стимулирующего миграцию [53]. Благодаря этому, Фд быстро «заселяют» образующуюся в процессе заживления раны грануляционную ткань. Выраженная способность Фд к сокращению и разрушению фибриновых волокон на ранних стадиях заживления, за счет повышенной экспрессии активатора плазминогена [134], позволяет, по всей видимости, этим клеткам быстро перестраивать ВКМ, тем самым ускоряя репаративные процессы в ране [73].

В работе W. Mah с соавт. (2014) сравнивали уровни экспрессии генов, связанных с заживлением ран и образованием рубцов [76]. Эксперименты, проведенные авторами с использованием трехмерной клеточной модели, показали, что Фк характеризуются склонностью к избыточной аккумуляции ВКМ, активированию сигнальных путей TGF-p и сокращению кожных краев раны, что создает благоприятные условия для развития фиброза и рубцов. В отличие от Фк, Фд «запрограммированы» на быстрое завершение воспалительного процесса и ремодели-рование ВКМ, сопровождаемое неоангиогенезом, что способствует быстрому заживлению ран без образования рубцов. По-видимому, эта способность Фд объясняется особенностями их происхождения [3, 6, 53, 81].

Фибробласты кожи

Фибробласты десны

А

Б

Рис. 3.

Культуры фибробластов человека:

А — фазово-контрастная световая микроскопия; Б — окраска фибриллярного актина флуоресцентно-меченым фаллоидином. Масштабный отрезок: А - 150 мкм; Б — 20 мкм

Было установлено, что фибробласты сохраняют свой специфический паттерн экспрессии генов НОХ, своего рода «топографический код», определяющий тканевую специфичность функций клеток и их взаимодействие с другими клетками [116, 135]. Так, сравнительные исследования Фд и Фк лица человека, включающие анализ профилей экспрессии генов, показали, что эти два типа фибробластов имеют заметные различия [116, 120]. Между ними существует значительная разница в экспрессии 278 генов (всего было проанализировано 5284 гена), связанных, преимущественно, с ВКМ, оксидоредук-тазами, факторами роста/цитокинами [136]. Также были обнаружены (in vitro и in vivo) различия в количестве секретируемых клетками компонентов ВКМ (эластина, коллагенов I, III и V типов, фибронекти-на, периостина, остеопонтина, гиалуронана, белков, обогащенных цистеином 1, тромбоспондинов, сульфатированных гликозаминогликанов, гепарина, хондроитина, дерматана и кератансульфата, малых обогащенных лейцином протеогликанов и тенасци-нов) [6, 26, 133]. Соответственно, наблюдаются и значительные различия между создаваемыми Фд и Фк нишами в ВКМ, которые играют ключевую роль в реализации их функций [137]. Заметно различается также и спектр интегриновых рецепторов, посредством которых фибробласты взаимодействуют со своими специфическими нишами [53, 120, 135].

Говоря о характеристиках Фд, имеющих значение для регенерации тканей in vivo, отметим, что по некоторым из них (по иммуномодуляторным свойствам, выраженному противовоспалительному эффекту) Фд сходны с ММСКд [6, 47, 53, 86, 138]. Однако насколько иммуномодуляторные свойства Фд и ММСКд in vivo сопоставимы в качественном и количественном отношении, какие механизмы вовлекаются в процесс иммунной защиты — вопросы, требующие дальнейшего изучения.

Возможности терапевтического применения

клеток десны

Результаты многочисленных доклинических испытаний и иследований дифференцировочных способностей различных типов клеток в условиях in vitro и in vivo, сравнительный анализ их использования в медицине, начиная с ММСКкм и Фк, продемонстрировали, что ММСКд и Фд обладают значительным терапевтическим потенциалом для регенерации тканей и органов [3, 6, 53, 56, 85, 86, 103, 139-142] и могут быть более эффективны, чем ММСКкм, в лечении целого ряда тяжелых заболеваний [56, 101].

Заслуживают внимания следующие направления использования клеточного потенциала соединительной ткани десны в регенеративной медицине.

1. Заживление кожных ран

Эксперименты, проведенные C. Linard и соавт. (2015) на беспатогенных мышах NOD/SCID по заживлению радиационных ожогов с помощью ММСКд человека показали, что после интрадермальной трансплантации ММСКд в кожные края раны плотный, полностью сформированный эпидермис, кожные придатки и волосяные фолликулы образуются гораздо раньше, чем после трансплантации ММСКкм: по данным гистологического анализа срезов кожи, после применения ММСКд — через 1 нед., ММСКкм — через 3 нед. [56]. Отметим, что процесс заживления ран при использовании ММСКд, также как и при трансплантации ММСКкм, включал ремоделиро-вание коллагенового матрикса, изменение баланса коллаген/MMP/TIMP, модуляцию содержания/локализации тенасцина С, увеличение содержания факторов роста VEGF, EGF и FGF7. Трансплантированные ММСКд, как и ММСКкм, способствовали редукции в коже воспалительного процесса, вызванного облучением, и «переключению» дифференцировки макрофагов в направлении М2-фенотипа. Известно,

что макрофаги этого фенотипа способствуют увеличению содержания факторов роста VEGF и TGF-P1 и стимулируют ангиогенез, дифференцировку фибро-бластов в миофибробласты, а также обеспечивают контроль над размером волосяных фолликулов [56, 143, 144]. Однако процесс заживления ран при трансплантации ММСКд осуществлялся значительно быстрее по сравнению с ММСКкм и ассоциировался с более быстрыми ремоделированием ВКМ, синтезом факторов роста и поляризацией макрофагов [56].

Исследование, проведенное S. Ansari с соавт. (2016), продемонстрировало, что трансплантация ММСКд человека способствует и более быстрому ангиогенезу с образованием более плотной сети капилляров по сравнению с ММСКкм человека [100].

Следует подчеркнуть, что ММСКд, трансплантированные в кожу, примыкающую к очагу повреждения, находятся в этой зоне более длительное время, чем трансплантированные ММСКкм [56]. Последний факт подтверждают и испытания, проведенные на кроликах с моделированной аневризмой аорты, в которых трансплантированные ММСКд регистрировали и через три месяца после проведения клеточной терапии, в то время как более 90% трансплантированных ММСКкм не обнаруживалось уже через несколько дней после введения [101].

Результаты исследования, проведенного C. Linard с соавт. (2015) позволяют сделать вывод о том, что более быстрый клинический эффект ММСКд, по сравнению с ММСКкм, может быть вследствие значительно более высокого уровня экспрессии генов, отвечающих за синтез белков — факторов роста фи-бробластов FGF и S100A4, вовлеченных в процесс активации фибробластов, и трансформирующего фактора роста TGF-P2, способствующего морфогенезу и регенерации волосяных фолликулов. В трансплантированных ММСКд наблюдалось 26-кратное увеличение экспрессии нейрогенного фактора роста noggin, который участвует в непрерывном цикле регенерации волос [56]. «Взрывы» увеличения содержания этого белка в нише стволовых клеток способствуют активации их пролиферации и, соответственно, эпителиальному морфогенезу.

Таким образом, ММСКд могут в большей степени, чем ММСКкм, стимулировать процессы регенерации тканей. Более выраженный регенеративный эффект ММСКд обеспечивается за счет «избыточной» продукции ими факторов роста, участвующих в процессе заживления ран, и длительного присутствия в области раны, а также за счет более высокой способности к неоангиогенезу.

В плане вклада в процесс ранозаживления целесообразно рассматривать не только селективную популяцию ММСКд, выделенную из первичной культуры стромальных клеток десны, но и Фд: получены достаточно убедительные данные, согласно которым культура Фд в целом также может быть эффективна при лечении кожных ран [6, 53, 71, 73, 76, 85, 101, 118, 120].

К настоящему времени накоплен значительный, насчитывающий десятилетия, опыт терапевтического применения фибробластов кожи, как в виде суспензии, так и в составе тканеинженерного конструкта. Их использование приводит к значительному улучшению состояния кожи, однако полностью восстановить ее структуру и функции Фк не могут [53, 145]. Преимущества в этом отношении Фд свя-

заны, прежде всего, с их способностью обеспечивать эффективное ранозаживление без образования рубцов [53, 71, 101, 117].

Кроме того, представляют интерес такие свойства Фд, как высокая способность к реэпителизации и ангиогенезу, что особенно важно при лечении хронических кожных ран у пациентов с сахарным диабетом и сердечно-сосудистыми заболеваниями [48].

На основе вышеизложенного можно сделать вывод о том, что и ММСКд, и Фд следует считать перспективным типом клеток для создания клеточных продуктов (как ауто-, так и аллогенных), применяемых при лечении кожных ран различного генеза, как с острым, так и хроническим течением раневого процесса, в том числе препаратов, которые позволят восстанавливать целостность кожи в самых тяжелых клинических случаях.

2. Восстановление костной ткани

Сравнение (как in vitro, так и in vivo) популяций ММСКд и ММСКкм показало сходство между этими двумя типами клеток по иммунофенотипическому профилю и способности к остеогенной дифференци-ровке [82, 84, 91—94]. Однако было установлено, что ММСКд человека отличаются более высокими пролиферативным потенциалом и уровнем адгезии к поверхности матрикса (в частности, к поверхности гранул из бета-трикальцийфосфата) [84, 92]. Данные, представленные в работе V. Zorin и соавт. (2014), свидетельствуют о возможности применения ММСКд человека в сочетании с соответствующим скаффолдом с целью восстановления костной ткани [92]. Авторами показана принципиальная возможность индукции остеогенной дифференцировки без добавления каких-либо специфических стимуляторов, а только путем совмещения ММСКд с каль-цийфосфатным носителем.

Трансплантация ММСКд человека оказалась также эффективным методом восстановления костных дефектов как при локальной (в комбинации с матриксом), так и при системной трансплантации. Так, Q. Xu с соавт. (2014) продемонстрировали, что внутривенно введенные ММСКд регистрируются в костных дефектах и активно участвуют в формировании новой костной ткани у иммунодефицитных мышей с дефектами нижней челюсти и свода черепа [81, 146, 147].

Полученные данные позволяют рассматривать ММСКд (при соответствующей их индукции) в качестве оптимальной клеточной популяции для восстановления костной ткани, а также для создания тка-неинженерных костных графтов и клеточной терапии при костной реконструкции.

3. Восстановление мышечной ткани

Данные, полученные рядом исследователей в условиях in vitro и in vivo [99, 100, 148, 149], свидетельствуют о том, что ММСКд могут быть использованы для разработки клеточных продуктов для лечения заболеваний мышечной системы. Так, после инициации дифференцировки in vitro ММСКд (также как и ММСКкм человека, которые служили в качестве положительного контроля) приобретали морфологию мышечных клеток, которые экспрес-сировали высокий уровень маркеров, характерных для мышечных клеток. Эксперименты S. Ansari и соавт. (2016) показали, что при внутрикожной транс-

плантации иммунодефицитным мышам ММСКд, предварительно заключенные в трехмерные RGD-содержащие альгинатные каркасы (альгинатный гидрогель, содержащий индукционные для миоген-ной дифференцировки факторы) и инкубированные в течение 4 недель после инициации дифференци-ровки in vitro (так же, как и ММСКкм человека, которые вводили в качестве положительного контроля), приобретали морфологию мышечных клеток и экс-прессировали большие количества мРНК для маркеров мышечной регенерации (MyoD, Myf5 и MyoG) [100]. Гистологическое и иммуногистохимическое/ флуоресцентное окрашивание на белки-маркеры, специфичные для мышечной ткани, подтвердило образование мышечной ткани при подкожной трансплантации, выполненной на животной модели in vivo. ММСКд человека продемонстрировали значительно более высокую способность к миогенезу по сравнению с ММСКкм.

Исследования, проведенные И. Корсаковым с со-авт. (2017) на кроликах, продемонстрировали, что трансплантация аутогенных ММСКд в поврежденную скелетную мышцу способствует значительному сокращению размеров области повреждения [148]. Анализ экспрессии факторов миогенной дифферен-цировки MyoD и миогенина, а также гистологические исследования выявили в поврежденной мышце активированный репаративный рабдомиогенез, сопровождаемый увеличением количества активированных и терминально дифференцированных миогенных клеток-предшественниц (что может быть следствием как прямой дифференцировки трансплантированных клеток, так и (или) следствием активации дифференцировки резидентных миосателлитоцитов под влиянием факторов, продуцируемых ММСКд). Авторы также отметили, что трансплантация ММСКд способствует замедлению темпов формирования соединительнотканного рубца, создавая тем самым условия для более полной регенерации мышечной ткани.

Анализ полученных результатов позволяет предположить, что ММСКд (при соответствующей индукции) являются перспективным типом клеток для инженерии мышечной ткани.

4. Восстановление сосудов

На сегодняшний день представлено достаточно данных о терапевтической эффективности применения как Фд, так и субпопуляции ММСКд при восстановлении стенок сосудов и трахеи. Хорошие клинические результаты достигаются за счет способности этих клеток к снижению уровня продукции матриксной металлопротеиназы 9, деградации эластина, усилению реэпителизации [66, 101, 117, 129], выраженной редукции воспаления in vivo [101, 117] и иммуномодуляции [6, 101, 117, 118]. В экспериментах на животной модели Фд были использованы для восстановления сосудистой стенки при аневризме сонной артерии. При трансплантации Фд в стенки артерии наблюдали значительное уменьшение размеров дефекта, в то время как в контроле (использовали культуральную среду или Фк) дефект продолжал увеличиваться. Также было отмечено, что Фд способствовали восстановлению количества эластина в артериальных стенках [101]. Эффективным оказалось и применение аутоФд для коррекции рубцов голосовых связок, проведенной на пяти пациентах [150].

5. Восстановление нервной ткани

По данным В. Fournier и соавт. (2016) Фд могут служить источником клеток, ассоциированных с НГ-клетками и обладающих характерным дифференци-ровочным потенциалом, и, следовательно, имеющих хорошие перспективы использования в регенеративной медицине и лечении заболеваний нервной системы [4]. Кроме того, эти клетки десны могут быть использованы для изучения механизмов дифферен-цировки НГ-клеток.

Важно наличие ранних клеток-предшественников (СКНГ) в первичной культуре Фд и в селективной культуре ММСКд. Это позволяет за счет экспансии клеток в нейросферах селективно изолировать определенную субпопуляцию — ММ^д^ей^^ обладающую высоким нейрональным потенциалом. Было установлено, что способностью к образованию ней-росфер обладают и ММСКд, и первичная (смешанная) культура Фд. Поэтому любая из этих культур может быть использована для эффективной экспансии ММСКд-nestin+ и их применения с целью лечения заболеваний нервной системы [4, 56, 81].

Q. Zhang и соавт. (2016) использовали ММСКд человека и их производные — iNPCs (индуцированные нейрональные стволовые/прогениторные клетки, полученные из ММСКд посредством культивирования последних по протоколу нейросфер) для периневральной трансплантации в область повреждения седалищного нерва крыс (Sprague-Dawley) [151]. Результаты продемонстрировали выраженный клинический эффект (особенно при применении iNPC-клеток), проявляющийся в регенерации аксонов в области травмы и в области дистальных сегментов поврежденного седалищного нерва. По мнению авторов, клинический эффект наблюдается вследствие паракринной активности трансплантированных клеток, способствующей ремиелинизации поврежденного нерва за счет регуляции транскрипционных факторов с-Jun и Krox-20/EGR2 — антагонистов миелинизации. Также результаты экспериментов (in vitro и in vivo) показали, что и ММСКд и iNPC-клетки способны дифференцироваться в нейрональные клетки.

6. Восстановление хрящевых тканей

Изучение дифференцировочного потенциала НГ-ММСКд подтвердило, что они способны к диффе-ренцировке вхондрогенном направлении. Механизм реализации этого потенциала до конца не изучен, тем не менее, вполне вероятно, что использование этих клеток может стать оптимальным методом восстановления хрящевой ткани, в частности при лечении пациентов с патологией височно-нижнечелюст-ного сустава, ткани которого также происходят из НГ [81].

7. Лечение заболеваний и состояний,

связанных с нарушениями иммунитета

Выраженные иммуномодуляторные свойства ММСКд, превосходящие таковые у ММСКкм, позволяют считать ММСКд перспективным клеточным материалом для терапии воспалительных и аллергических заболеваний [6, 7, 53, 68, 81, 86, 103, 105, 107]. По мнению исследователей, эти клетки могут быть использованы для лечения таких серьезных иммунных патологий, как РТПХ, колиты. Что касается последних, то получен хороший клинический

эффект от системного введения ММСКд при экспериментально-индуцированных колитах: значительно снижается тяжесть воспалительного процесса за счет супрессии инфильтрирующих стенку кишечника «клеток воспаления» и секреции ими воспалительных цитокинов/медиаторов, а также за счет увеличения численности субпопуляции Т-клеток (Treg cells) и экспрессии гена, кодирующего IL-10. Тем самым подтверждается, что применение ММСКд может дать хороший клинический эффект при лечении тяжелых воспалительных заболеваний кишечника [68].

Вполне вероятно, что введение ММСКд может служить перспективным методом лечения и аутоиммунных патологий, что подтверждают результаты работ, в которых для лечения индуцированных химиотерапией мукозитов у мышей системно вводили ММСКд [152]. У данных животных было выявлено значительное снижение симптоматики и выраженная регенерация поврежденного эпителия.

Терапевтический эффект ММСКд человека был продемонстрирован на животной модели при лечении коллаген-индуцированного артрита; были отмечены значительное снижение клинических проявлений, уменьшение продукции воспалительных цитокинов (IFN-c, IL-17A) и выраженный иммуномо-дуляторный эффект после трансплантации ММСКд [153]. По мнению автора исследования, механизм данного терапевтического эффекта основан на активации CD39/CD73 и индукции CD41CD391FoxP31 T-регуляторных клеток.

8. Фибробласты десны, как источник

индуцированных плюрипотентных стволовых

клеток

Еще одним перспективным направлением применения Фд в регенеративной медицине является получение на их основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs — induced pluripotent stem cells [154]), которые также могут быть источником ММСК [155, 156], содержащим их в достаточно большом количестве. Особый интерес к iPSCs обусловлен тем, что, с одной стороны, они обладают свойствами эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), то есть способны к образованию эмбриональных телец и тератом и к дифференцировке в производные трех зародышевых листков [157], а с другой — их использование позволяет избежать этических проблем, связанных с применением ЭСК.

Источниками iPSCs могут служить разные соматические клетки, однако, по мнению ряда исследователей, преимущество Фд заключается в достаточно высоком «выходе» iPSCs. Так, эффективность получения iPSCs из Фк, мезенхимальных, эпителиальных и гемопоэтических клеток животных и человека в большинстве случаев составляет менее 1% [158, 159], а эффективность получения iPSCs из Фд мыши оказалась в семь раз больше, чем из Фк [160].

Первоначально iPSCs из Фд человека и мыши были получены посредством внедрения в геном факторов перепрограммирования с применением ретровирусных векторов [160, 161]. Они обладали высоким пролиферативным потенциалом, однако имели ряд характеристик, которые с точки зрения клеточной терапии расцениваются как недостатки. В частности, у них отсутствовала продукция плюрипотентных (TRA160, TRA181 и ALP) и гемопоэтических (CD14, CD34 и CD45) маркеров [162], был риск

возникновения генетических мутаций и трансмиссии вирусных геномов вследствие использования для их получения ретровирусов [155, 163].

В настоящее время iPSCs из Фд (как животных, так и человека) получают путем доставки в клетки факторов перепрограммирования (Oct-4, Sox-2, Klf4, L-myc, Lin28, TP53 shRNA) с помощью эпи-сомных плазмидных векторов [164, 165]. iPSCs, полученные этим методом, обладают не только про-лиферативным потенциалом, сходным с таковым у ЭСК, но и экспрессируют плюрипотентные маркеры, включая Oct-4, Tra181, nanog, SSEA-4, и сохраняют нормальный кариотип. Так, в исследовании in vivo отмечено развитие тканей всех трех зародышевых листков в тератомах, образованных из iPSCs, перепрограммированных указанным способом, что подтверждает плюрипотентность последних [165]. Также имеются данные (in vitro и in vivo) по диффе-ренцировке таких iPSCs в ММСК, которые, в свою очередь, эффективно дифференцируются в остео-генном направлении [166, 167].

Как показали работы Q. Lian с соавт. (2010) [168] и Y. Umezaki с соавт. (2015) [156], iPSCs, полученные из Фд путем доставки в клетки факторов перепрограммирования с помощью эписом-ных плазмидных векторов, обладают более высоким пролиферативным потенциалом по сравнению с первичными культурами ММСКкм и Фк. Y. Umezaki и соавт. (2015) даже после 20 пассажей iPSCs не наблюдали изменений кариотипа, что подтверждает отсутствие интеграции плазмид в геном этих клеток; также не было отмечено онкогенного потенциала. Авторы исследования, основываясь на результатах собственных изысканий и учитывая накопленный опыт других ученых, пришли к заключению, что использование комбинации первичной культуры Фд с эписомальными плазмидами (в качестве вектора доставки в клетки факторов перепрограммирования) представляет собой идеальный способ эффективного и безопасного получения iPSCs, в том числе и с целью их последующей индукционной дифференци-ровки в ММСК.

По мнению ряда ученых, использование перепрограммированных из Фд iPSCs, как самостоятельно, так и в составе тканеинженерных конструкций в комбинации с биоматериалами, можно рассматривать в качестве инновационных технологий для аутогенной терапии широкого спектра заболеваний, особенно для восстановления соединительных тканей че-люстно-лицевой области и пародонта [160]. Весьма эффективным представляется применение персонализированных iPSCs из Фд, специфичных для патологии тканей ротовой полости, в терапии заболеваний этой зоны, включая скрининг лекарственных препаратов в условиях, приближенных к интраораль-ным [169]. Перспективно также и создание индивидуального криобанка Фд [160].

Однако следует отметить, что, несмотря на многообещающие возможности терапии на основе iPSC-клеток, она все еще находится на начальной стадии разработки. Необходимо проведение дальнейших научных работ с детальным изучением био-и онкобезопасности применения этих клеток, глубоких исследований их хромосомной стабильности, как на ранних, так и на поздних пассажах, более комплексного анализа дифференцировочного потенциала и др.

Заключение

Проведенный к настоящему времени анализ клеточного потенциала соединительной ткани десны подтверждает наличие в ней клеток, отличающихся высокой дифференцировочной и репаративной способностью, в количестве, достаточном для эффективного применения с целью восстановления поврежденных тканей. Это позволяет рассматривать десну в качестве чрезвычайно перспективного тканевого источника клеточного материала для использования в регенеративной медицине, включая получение на основе стромальных клеток десны индуцированных плюрипотентных клеток (iPCs).

ЛИТЕРАТУРА:

1. Lindvall O., Kokaia Z. Stem cells for the treatment of neurological disorders. Nature 2006; 441: 1094-6.

2. Segers V., Lee R. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature 2008; 451: 937-42.

3. El-Sayed K., Dörfer С. Gingival Mesenchymal Stem/Progenitor Cells: A Unique Tissue Engineering Gem. Stem Cells International 2016; 2016: 7154327.

4. Fournier В., Loison-Robert L., Ferré F. et al. Characterisation of human gingival neural crest-derived stem cells in monolayer and neurosphere cultures. European Cells and Materials 2016; 31: 40-58.

5. Pevsner-Fischer M., Levin S., Zipori D. The origins of mesenchymal stromal cell heterogeneity. Stem Cell Rev. 2011; 7: 560-8.

6. Fournier B., Larjava H., Häkkinen L. Gingiva as a source of stem cells with therapeutic potential. Stem Cells Dev. 2013; 22: 3157-77.

7. Volponi А., Sharpe Р. The tooth — a treasure chest of stem cells. British Dental Journal 2013; 215(7): 353-8.

8. Jin S., Lee J., Yun J.H. et al. Isolation and characterization of human mesenchymal stem cells from gingival connective tissue. J. Periodont. Res. 2015; 50(4): 461-7.

9. Caplan A. Mesenchymal stem cells. J. Orthop. Res. 1991; 9: 641-50.

10. Pittenger M., Mackay A., Beck S. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284: 143-7.

11. Horwitz E., Le Blanc K., Dominici M. et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The Interrnational Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2005; 7(5): 393-5.

12. Mao J., Prockop D. Stem cells in the face: tooth regeneration and beyond. Cell Stem Cell 2010; 11: 291-301.

13. Bianco P., Robey P. Skeletal stem cells. In: Lanza R.P., editor. Handbook of Adult and Fetal Stem Cells. San Diego: Academic Press; 2004. p. 415-24.

14. Чайлахян Р.К., Лалыкина К.С. Спонтанная и индуцированная дифференцировка костной ткани в популяции фибробластопо-добных клеток, полученных из длительных монослойных культур костного мозга и селезенки. ДАН СССР 1969; 187(2): 473-9.

15. Friedenstein A., Deriglasova U., Kulagina N. et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp. Hematol. 1974; 2: 83-92.

16. Чайлахян Р.К., Фриденштейн А.Я., Васильев А.В. Клоноо-бразование в монослойных культурах костного мозга и селезенки. Бюлл. эксперим. биол. 1970; 2: 94-8.

17. Friedenstein A., Chailakhyan R., Lalykina K. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet. 1970; 3: 393-403.

18. Чайлахян Р.К., Герасимов Ю.В., Куралесова А.И. и соавт. Пролиферативные и дифференцировочные потенции индивидуальных клонов стромальных клеток-предшественников костного мозга. Известия АН. Серия биологическая 2001; 6: 682-92.

19. Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А. Изменение численности кло-ногенных стромальных клеток в кроветворных органах. В: Клеточные основы кроветворного микроокружения. Москва: Медицина; 1980. с. 122-5.

20. Владимирская Е.В., Кошель И.В. Стромальные фибробла-сты нормального костного мозга у детей. Гематология и трансфузи-ология 1990; 1: 3-5.

21. Астахова В.С. Активность КОЕф костного мозга — показатель регенераторного потенциала кости у человека. В: Туник Л.В., редактор. Остеогенные клетки-предшественники костного мозга человека. Киев: Феникс; 2000. с. 87-132.

22. Kuznetsov S., Mankani М., Bianco Р. et al. Enumeration of the colony-forming units—fibroblast from mouse and human bone marrow in normal and pathological conditions. Stem Cell Research 2009; 2: 83-94.

Кроме того, фибробластический дифферон соединительной ткани десны, происходящий из НГ, может служить новым инструментом для изучения механизмов НГ-подобного фенотипа и мультилиней-ной дифференцировки в мезо- и эктодермальном направлениях. Результаты таких исследований могут лечь в основу разработки инновационых методов восстановления тканей и органов челюстно-лицевой области, лечения неврологических, ортопедических и, возможно, орфанных заболеваний.

Благодарности

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-25-00166).

23. Morrison S., Kimble J. Asymmetric and symmetric stem cell divisions in development and cancer. Nature 2006; 441(7097): 1068-74.

24. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Герасимов Ю.В. Пролиферативные и дифференцировочные потенции скелетогенных костномозговых колониеобразующих клеток. Цитология 1986; XXVIII(3): 341-9.

25. Friedenstein A., Chailakhyan R., Gerasimov U. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet. 1987; 20: 263-72.

26. Augello A., Kurth T., Bari C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur. Cell. Mater. 2010; 20: 121-33.

27. Al-Nbaheen M., Vishnubalaji R., Ali D. et al. Human stromal (mesenchymal) stem cells from bone marrow, adipose tissue and skin exhibit differences in molecular phenotype and differentiation potential. Stem Cell Rev. 2013; 9(1): 32-43.

28. Keating A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell 2012; 14: 709-16.

29. Bianco P., Cao X., Frenette P. et al. The meaning, the sense and the significance: translating the science of mesenchymal stem cells into medicine. Nat. Med. 2013; 19: 35-42.

30. Nombela-Arrieta C., Ritz J., Silberstein L. The elusive nature and function of mesenchymal stem cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2011; 12(2): 126-31.

31. Oswald J., Boxberger S., J0rgensen B. et al. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro. Stem Cells 2004; 22(3): 377-84.

32. Meligy F., Shigemura K., Behnsawy H. et al. The efficiency of in vitro isolation and myogenic differentiation of MSCs derived from adipose connective tissue, bone marrow, and skeletal muscle tissue. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 2012; 48(4): 203-15.

33. Tropel P., Platet N., Platel J. et al. Functional neuronal differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells 2006; 24(12): 2868-76.

34. Sasaki M., Abe R., Fujita Y. et al. Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type. J. Immunol. 2008; 180(4): 2581-7.

35. Wu Y., Chen L., Scott P. et al. Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis. Stem Cells 2007; 25: 2648-59.

36. Wu Y., Zhao R.C., Tredget E.E. Concise review. Bone marrow derived stem/progenitor cells in cutaneous repair and regeneration. Stem Cells 2010; 28: 905-15.

37. Harris R.G., Herzog E.L., Bruscia E.M. et al. Lack of a fusion requirement for development of bone marrow-derived epithelia. Science 2004; 305: 90-3.

38. Galderisi U., Giordano A. The gap between the physiological and therapeutic roles of mesenchymal stem cells. Med. Res. Rev. 2014; 34(5): 1100-26.

39. Boink M., van den Broek L., Roffel S. et al. Different wound healing properties of dermis, adipose, and gingiva mesenchymal stromal cells. Wound Repair Regen. 2016; 24(1): 100-9.

40. Shakoori P., Zhang Q., Le A.D. Applications of Mesenchymal Stem Cells in Oral and Craniofacial Regeneration. Oral Maxillofac. Surg. Clin. North. Am. 2017; 29(1): 19-25.

41. Wang Y., Chen X., Cao W. et al. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat. Immunol. 2014; 15(11): 1009-16.

42. Nauta A., Fibbe W. Immunomodulatory properties of mesenchymal stromal cells. Blood 2007; 110: 3499-506.

43. Chen L., Tredget E., Wu P. et al. Paracrine factors of mesenchymal stem cells recruit macrophages and endothelial lineage cells and enhance wound healing. PLoS ONE 2008; 3(4): 1886.

44. Maxson S., Lopez E., Yoo D. Concise review: role of mesenchymal stem cells in wound repair. Stem Cells Transl. Med. 2012; 1: 142-9.

45. Dominici М., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining ultipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8(4): 315-7.

46. Sorrell J., Caplan A. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. J. Cell Sci. 2004; 117: 667-75.

47. Haniffa M., Collin M., Buckley C. et al. Mesenchymal stem cells: the fibroblasts' new clothes? Haematologica 2009; 94: 258-63.

48. Wong T., McGrath J., Navsaria H. The role of fibroblasts in tissue engineering and regeneration. Br. J. Dermatol. 2007; 156: 1149-55.

49. Пулин А.А., Сабурина И.Н., Репин B.C. Поверхностные маркеры, характеризующие мультипотентные мезенхимальные стро-мальные клетки (ММСК) костного мозга человека. Гены и Клетки 2008; 3(3): 25-30.

50. Robey P.G., Kuznetsov S.A., Riminucci M. et al. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods Mol. Biol. 2014; 1130: 279-93.

51. Davies L., Locke M., Webb R. et al. A multipotent neural crest-derived progenitor cell population is resident within the oral mucosa lamina propria. Stem Cells Dev. 2010; 19: 819-30.

52. Лебединская О., Горская Ю., Куралесова А. Mорфологическая характеристика колоний стромальных клеток-предшественников в культурах гетеротопных трансплантатов костного мозга и селезенки мышей разного возраста. Морфология: научно-теоретический мед. журнал 2004; 126(6): 46-9.

53. Häkkinen L., Larjava H., Fournier B. Distinct phenotype and therapeutic potential of gingival fibroblasts. Cytotherapy 2014; 16: 1171-86.

54. Djouad F., Bouffi C., Ghannam S. et al. Mesenchymal stem cells: innovative therapeutic tools for rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 2009; 5(7): 392-9.

55. Hocking A., Gibran N. Mesenchymal stem cells: paracrine signaling and differentiation during cutaneous wound repair. Exp. Cell Res. 2010; 316: 2213-9.

56. Linard С., Tissedre F., Busson E. et al. Therapeutic Potential of Gingival Fibroblasts for Cutaneous Radiation Syndrome: Comparison to Bone Marrow-Mesenchymal Stem Cell Grafts. Stem Cells and Development 2015; 24(10): 1182-93.

57. Bourin P., Bunnell B.A., Casteilla L. et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy 2013; 15(6): 641-8.

58. Бозо И., Зорин В., Еремин И. и соавт. Особенности муль-типотентных мезенхимальных стромальных клеток, полученных из различных интраоральных источников. Гены и Клетки 2014; 9(4): 34-42.

59. Sousa B., Parreira R., Fonseca E. et al. Human adult stem cells from diverse origins: an overview from multiparametric immunophenotyping to clinical applications. Cytometry A 2014; 85(1): 43-77.

60. Chen L., He D., Zhang Y. The differentiation of human placenta-derived mesenchymal stem cells into dopaminergic cells in vitro. Cell. Mol. Biol. Lett. 2009; 14: 528-36.

61. da Silva Meirelles L., Chagastelles P., Nardi N. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J. Cell Sci. 2006; 119: 2204-13.

62. Бозо И.Я., Деев Р.В., Пинаев Г.П. «Фибробласт» — специализированная клетка или функциональное состояние клеток ме-зенхимного происхождения? Цитология 2010; 52(2): 99-109.

63. Sacchetti В., Funari А., Remoli С. et al. No Identical ''Mesenchymal Stem Cells'' at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels. Stem Cell Reports 2016; 6: 897-913.

64. Schatteman G., Ma N. Old bone marrow cells inhibit skin wound vascularisation. Stem Cells 2006; 24: 717-21.

65. Chen J., Wong V., Gurtner G. Therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells for cutaneous wound healing. Front. Immunol. 2012; 3: 192-212.

66. Fournier B., Ferre F., Couty L. et al. Multipotent progenitor cells in gingival connective tissue. Tissue Eng. Part A 2010; 16: 2891-9.

67. El-Sayed K., Paris S., Graetz С. et al. Isolation and characterization of human gingival margin-derived STRO-1/MACS( + ) and MACS(-) cell populations. International Journal of Oral Science 2014; 7(2): 80-8.

68. Zhang Q., Shi S., Liu Y. Mesenchymal stem cells derived from human gingiva are capable of immunomodulatory functions and ameliorate inflammation-related tissue destruction in experimental colitis. J. Immunol. 2009; 183: 7787-98.

69. Mak K., Manji A., Gallant-Behm C. et al. Scarless healing of oral mucosa is characterized by faster resolution of inflammation and control of myofibroblast action compared to skin wounds in the red Duroc pig model. J. Dermatol. Sci. 2009; 56: 168-80.

70. Wong J., Gallant-Behm C., Wiebe C. et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound Repair Regen. 2009; 17: 717-29.

71. Glim J., van Egmond M., Niessen F. et al. Detrimental dermal wound healing: what can we learn from the oral mucosa? Wound Repair Regen. 2013; 21: 648-60.

72. Larjava H., Wiebe C., Gallant-Behm С. et al. Exploring scarless healing of oral soft tissues. Journal of the Canadian Dental Association 2011; 77: 18-28.

73. Hakkinen L., Uitto V.J., Larjava H. Cell biology of gingival wound healing. Periodontol. 2000; 24: 127-52.

74. Chesney J., Bucala R. Peripheral blood fibrocytes: novel fibroblast-like cells that present antigen and mediate tissue repair. Biochem. Soc. Trans. 1997; 25: 520.

75. Ivarsson M., Sundberg C., Farrokhnia N. et al. Recruitment of type I collagen producing cells from the microvasculature in vitro. Exp. Cell Res. 1996; 229(2): 336-49.

76. Mah W., Jiang G., Olver D. et al. Human gingival fibroblasts display a non-fibrotic phenotype distinct from skin fibroblasts in three-dimensional cultures. PloS ONE 2014; 9: 907-15.

77. Chai Y., Jiang X., Ito Y. et al. Fate of the mammalian cranial neural crest during tooth and mandibular morphogenesis. Development 2000; 127: 1671-9.

78. Chai Y., Maxson R. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev. Dyn. 2006; 235: 2353-75.

79. Le Douarin N., Calloni G., Dupin E. The stem cells of the neural crest. Cell Cycle 2008; 7: 1013-9.

80. Yoshida T., Vivatbutsiri P., Morriss-Kay G. et al. Cell lineage in mammalian craniofacial mesenchyme. Mech. Dev. 2008; 125: 797808.

81. Xu X., Chen C., Akiyama K. et al. Gingivae Contain Neural-crest- and Mesoderm-derived Mesenchymal Stem Cells. J. Dent. Res. 2013; 92(9): 825-32.

82. Tang L., Li N., Xie H. et al. Characterization of mesenchymal stem cells from human normal and hyperplastic gingiva. J. Cell. Physiol. 2011; 226: 832-42.

83. Mitrano T., Grob M., Carrion F. et al. Culture and characterization of mesenchymal stem cells from human gingival tissue. J. Periodontol. 2010; 81: 917-25.

84. Зорин В., Зорина А., Еремин И. и соавт. Сравнительный анализ остеогенного потенциала мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток слизистой оболочки полости рта и костного мозга. Гены и Клетки 2014; 9(1): 50-7.

85. Tomar G., Srivastava R., Gupta N. et al. Human gingiva-derived mesenchymal stem cells are superior to bone marrow-derived mesenchymal stem cells for cell therapy in regenerative medicine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010; 393: 377-83.

86. Zhang Q., Nguyen A., Yu W. et al. Human oral mucosa and gingiva: a unique reservoir for mesenchymal stem cells. Journal of Dental Research 2012; 91(11): 1011-8.

87. Robey P.G., Kuznetsov S.A., Riminucci M. et al. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods Mol. Biol. 2014; 1130: 279-93..

88. Ge S., Mrozik K., Menicanin D. et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem cell-like cells from healthy and inflamed gingival tissue: potential use for clinical therapy. Regen. Med. 2012; 7(6): 819-32.

89. Petrof G., Lwin S.M., Martinez-Queipo M. et al. Potential of Systemic Allogeneic Mesenchymal Stromal Cell Therapy for Children with Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa. Journal of Investigative Dermatology 2015; 135: 2319-21.

90. El-Darouti M., Fawzy M., Amin I. et al. Treatment dystrophic epidermolysis bullosa with bone marrow non-hematopoietic stem cells: a randomized controlled trial. Dermalogic Therapy 2016; 29: 96-100.

91. Yang H., Gao L., An Y. et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from gingival tissue and periodontal ligament in different incubation conditions. Biomaterials 2013; 34(29): 7033-47.

92. Zorin V.L., Komlev V.S., Zorina A.I. et al. Octacalcium phosphate ceramics combined with gingiva-derived stromal cells for engineered functional bone grafts. Biomed. Mater. 2014; 9(5): 055005.

93. Wang F., Yu N., Yan X. et al. Gingiva-derived mesenchymal stem cell-mediated therapeutic approach for bone tissue regeneration. Stem Cells Dev. 2011; 20: 2093-102.

94. El-Sayed K., Paris S., Becker S. et al. Periodontal regeneration employing gingival margin-derived stem/progenitor cells: an animal study. J. Clin. Periodontol. 2012; 39: 861-70.

95. Li N., Liu N., Zhou J. et al. Inflammatory environment induces gingival tissue-specific mesenchymal stem cells to differentiate towards a pro-fibrotic phenotype. Biol. Cell 2013; 105(6): 261-75.

96. Zhang W., Walboomers X., Kuppevelt T. et al. In vivo evaluation of human dental pulp stem cells differentiated towards multiple lineages. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2008; 2: 117-25

97. Xu X., Chen C., Akiyama K. et al. Gingivae Contain Neuralcrestand Mesoderm-derived Mesenchymal Stem Cells. J. Dent. Res. 2013; 92(9): 825-32.

98. Fernandes K., Toma J., Miller F. Multipotent skin-derived precursors: adult neural crest-related precursors with therapeutic potential. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B: Biol. Sci. 2008; 363: 185-98.

99. Зорин В., Еремин И., Рыбко В. и соавт. Слизистая оболочка полости рта — новый источник получения миобластов. Гены и Клетки 2014; IX(3): 5-13.

100. Ansari S., Chen C., Xu X. et al. Muscle Tissue Engineering Using Gingival Mesenchymal Stem Cells Encapsulated in Alginate Hydrogels Containing Multiple Growth Factors. Annals of Biomedical Engineering 2016; 44(6): 1908-20.

101. Durand E., Fournier B., Couty L. et al. Endoluminal gingival fibroblast transfer reduces the size of rabbit carotid aneurisms via elastin repair. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2010; 32: 1892-901.

102. Zhang Q., Su W., Shi S. et al. Human gingiva-derived mesenchymal stem cells elicit polarization of M2 macrophages and enhance cutaneous wound healing. Stem Cells 2010; 28: 1856-68.

103. Liu J., Yu F., Sun Y. et al. Concise Reviews: Characteristics and Potential Applications of Human Dental Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells 2015; 33: 627-38.

104. Nemeth K., Leelahavanichkul A., Yuen P. et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat. Med. 2009; 15: 42-9.

105. Galler K., Cavender A., Koeklue U. et al. Bioengineering of dental stem cells in a PEGylated fibrin gel. Regen. Med. 2011; 6: 191200.

106. Maggini J., Mirkin G., Bognanni I. et al. Mouse bone marrow-derived mesenchymal stromal cells turn activated macrophages into a regulatory-like profile. PLoS ONE 2010; 5(2): 9252.

107. Yamaza T., Kentaro A., Chen C. et al. Immunomodulatory properties of stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Stem Cell Res. Ther. 2010; 1(1): 5.

108. Le Blanc K., Frassoni F., Ball L. et al. Treatment of severe acute graft versus host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet 2004; 363: 1439-41.

109. Hunt D., Jahoda C., Chandran S. Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation. Curr. Opin. Biotechnol. 2009; 20: 522-30.

110. Svendsen C., Bhattacharyya A., Tai Y. Neurons from stem cells: preventing an identity crisis. Nat. Rev. Neurosci. 2001; 2: 831-4.

111. Abe S., Hamada K., Miura M. et al. Neural crest stem cell property of apical pulp cells derived from human developing tooth. Cell Biol. Int. 2012; 36: 927-36.

112. Taneyhill L. To adhere or not to adhere: the role of Cadherins in neural crest development. Cell Adh. Migr. 2008; 2: 223-30.

113. Taneyhill L., Schiffmacher A. Cadherin dynamics during neural crest cell ontogeny. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 2013; 116: 291-315.

114. Yagita Y., Sakurai T., Tanaka H. et al. N-cadherin mediates interaction between precursor cells in the subventricular zone and regulates further differentiation. J. Neurosci. Res. 2009; 87: 3331-42.

115. Зорина A., Бозо И., Зорин В. и соавт. Фибробласты дермы: особенности цитогенеза, цитофизиологии и возможности их клинического применения. Гены и Клетки 2011; 6(2): 15-26.

116. Chang H., Chi J., Dudoit S. et al. Diversity, topographic differentiation, and positional memory in human fibroblasts. PNAS USA 2009; 99: 12877-82.

117. Gogly B., Naveau A., Fournier B. et al. Preservation of rabbit aorta elastin from degradation by gingival fibroblasts in an ex vivo model. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2007; 27: 1984-90

118. Häkkinen L., Larjava H., Koivisto L. Granulation tissue formation and remodeling. Endodontic Topics 2012; 24: 94-129.

119. Dufour A., Overall C. Missing the target: matrix metalloproteinase antitargets in inflammation and cancer. Trends Pharmacol. Sci. 2013; 34: 233-42.

120. Guo F., Carter D., Mukhopadhyay A. et al. Gingival fibroblasts display reduced adhesion and spreading on extracellular matrix: a possible basis for scarless tissue repair? PLoS ONE 2011; 6: 270-97.

121. Cappellesso-Fleury S., Puissant-Lubrano B., Apoil P. et al. Human fibroblasts share immunosuppressive properties with bone marrow mesenchymal stem cells. J. Clin. Immunol. 2010; 30: 607-19.

122. Seguier S., Tartour E., Guerin C. et al. Inhibition of the differentiation of monocyte-derived dendritic cells by human gingival fibroblasts. PLoS ONE 2013; 8: 709-37.

123. Hosokawa Y., Hosokawa I., Ozaki K. et al. Cytokines differentially regulate ICAM-1 and VCAM-1 expression on human gingival fibroblasts. Clin. Exp. Immunol. 2006; 144: 494-502.

124. Okada Y., Meguro M., Ohyama H. et al. Human leukocyte histocompatibility antigen class II-induced cytokines from human gingival fibroblasts promote proliferation of human umbilical vein endothelial cells: potential association with enhanced angiogenesis in chronic periodontal inflammation. J. Periodont. Res. 2009; 44: 103-9.

125. McKeown S., Hyland P., Locke M. et al. Keratinocyte growth factor and scatter factor expression by regionally defined oral fibroblasts. Eur. J. Oral Sci. 2003; 111: 42-50.

126. Chinnathambi S., Bickenbach J. Human skin and gingival keratinocytes show differential regulation of matrix metalloproteinases when combined with fibroblasts in 3-dimensional cultures. J. Periodontol. 2005; 76: 1072-83.

127. Koivisto L., Larjava H., Häkkinen L. Reepithelialization of wounds. Endodontic Topics 2012; 24: 59-93.

128. Karring T., Ostergaard E., Loe H. Conservation of tissue specificity after heterotopic transplantation of gingiva and alveolar mucosa. J. Periodont. Res. 1971; 6: 282-93.

129. Kobayashi K., Suzuki T., Nomoto Y. et al. Potential of heterotopic fibroblasts as autologous transplanted cells for tracheal epithelial regeneration. Tissue Eng. 2007; 13: 2175-84.

130. Kobayashi K., Suzuki T., Nomoto Y. et al. A tissue-engineered trachea derived from a framed collagen scaffold, gingival fibroblasts and adipose-derived stem cells. Biomaterials 2010; 31: 4855-63.

131. Locke M., Hyland P., Irwin C. et al. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. J. Periodont. Res. 2008; 43: 279-89.

132. Karring T., Lang N., Loe H. The role of gingival connective tissue in determining epithelial differentiation. J. Periodont. Res. 1975; 10: 1-11.

133. Lorimier S., Hornebeck W., Godeau G. et al. Morphometric studies of collagen and fibrin lattices contracted by human gingival fibroblasts; comparison with dermal fibroblasts. J. Dent. Res. 1998; 77: 1717-29.

134. Parsonage G., Filer A., Haworth O. et al. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends Immunol. 2005; 26: 150-6.

135. Palaiologou A., Yukna R., Moses R. et al. Gingival, dermal, and periodontal ligament fibroblasts express different extracellular matrix receptors. J. Periodontol. 2001; 72: 798-807.

136. Ebisawa K., Kato R., Okada M. et al. Gingival and dermal fibroblasts: their similarities and differences revealed from gene expression. J. Biosci. Bioeng. 2011; 111: 255-8.

137. Brizzi M., Tarone G., Defilippi P. Extracellular matrix, integrins, and growth factors as tailors of the stem cell niche. Curr. Opin. Cell Biol. 2012; 24: 645-51.

138. Mahanonda R., Sa-Ard-Iam N., Montreekachon P. et al. IL-8 and IDO expression by human gingival fibroblasts via TLRs. J. Immunol. 2007; 178: 1151-7.

139. Su W., Zhang Q., Shi S. et al. Human gingiva derived mesenchymal stromal cells attenuate contact hypersensitivity via prostaglandin E(2)-dependent mechanisms. Stem Cells 2011; 29: 1849-60.

140. Грудянов А.И., Степанова И.И., Зорин В.Л. и соавт. Применение аутогенных фибробластов слизистой оболочки полости рта человека для устранения рецессий десны. Стоматология 2013; 1: 21-5.

141. Неробеев А.И., Голубева С.Н., Добродеев А.С. и соавт. Нейрофиброматоз — возможности хирургической реабилитации. Анналы пластической реконструктивной и эстетической хирургии 2014; 4: 10-20.

142. Görski B. Gingiva as a new and the most accessible source of mesenchymal stem cells from the oral cavity to be used in regenerative therapies. Postepy Hig. Med. Dosw. (Online) 2016; 70(0): 858-71.

143. Lucas T., Waisman A., Ranjan R. et al. Differential roles of macrophages in diverse phases of skin repair. J. Immunol. 2010; 184: 3964-77.

144. Yano K., Brown L., Detmar M. Control of hair growth and follicle size by VEGF-mediated angiogenesis. J. Clin. Invest. 2001; 107: 409-17.

145. Felder J., Goyal S., Attinger C. A systematic review of skin substitutes for foot ulcers. Plast. Reconstr. Surg. 2012; 130: 145-64.

146. Moshaverinia А., Chen С., Xu Х. et al. Bone regeneration potential of stem cells derived from periodontal ligament or gingival tissue sources encapsulated in RGD-modified alginate scaffold. Tissue Engineering Part A 2014; 20(3-4): 611-21.

147. Xu Q.C., Wang Z.G., Ji Q.X. et al. Systemically transplanted human gingiva-derived mesenchymal stem cells contributing to bone tissue regeneration. International Journal of Clinical and Experimental Pathology 2014; 7(8): 4922-9.

148. Корсаков И., Самчук Д., Пулин А. и соавт. Влияние ау-тологичных клеток альвеолярной десны, обладающих миогенным потенциалом, на регенерацию скелетной мышечной ткани. Гены и Клетки. В печати 2017.

149. Zorin V., Pulin А., Eremin I. et.al. Myogenic potential of human alveolar mucosa derived cells. Cell Cycle 2017; 16(6): 545-55.

150. Chhetri D., Berke G. Injection of cultured autologous fibroblasts for human vocal fold scars. Laryngoscope 2011; 121: 785-92.

151. Zhang Q., Nguyen P., Xu Q. et al. Neural progenitor-like cells induced from human gingiva-derived mesenchymal stem cells regulate myelination of schwann cells in rat sciatic nerve regeneration. Stem Cells Translational Medicine 2016; 5: 1-13.

152. Zhang Q., Nguyen A., Shi S. et al. Threedimensional spheroid culture of human gingiva-derived mesenchymal stem cells enhances mitigation of chemotherapyinduced oral mucositis. Stem Cells Dev. 2011; 21: 937-47.

153. Chen M., Su W., Lin X. et al. Adoptive transfer of human gingiva- derived mesenchymal stem cells ameliorates collagen-induced arthritis VIA suppressing Th1 and Th17 and enhancing regulatory T cell differentiation. Arthritis Rheum. 2013; 65: 1181-93.

154. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126: 663-76.

155. Hynes K., Menicanin D., Mrozik K. et al. Generation of functional mesenchymal stem cells from different induced pluripotent stem cell lines. Stem Cells and Development 2014; 23(10): 1084-96.

156. Umezaki Y., Hashimoto Y., Nishishita T. et al. Human Gingival Integration-Free iPSCs; a Source for MSC-Like Cells. Int. J. Mol. Sci. 2015; 16: 13633-48.

157. Okita K., Matsumura Y., Sato Y. et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods 2011; 8: 409-12.

158. Chun Y., Byun K., Lee B. Induced pluripotent stem cells and personalized medicine: current progress and future perspectives. Anat. Cell Biol. 2011; 44: 245-55.

159. Streckfuss-Bömeke K., Wolf F., Azizian A. et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 2013; 34(33): 2618-29.

160. Egusa H., Okita K., Kayashima H. et al. Gingival fibroblasts as a promising source of induced pluripotent stem cells. PLoS ONE 2010; 5(9): 127-43.

161. Wada N., Wang B., Lin N.H. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal

ligament fibroblasts. Journal of Periodontal Research 2011; 46(4): 438-47.

162. Yamanaka S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell Stem Cell 2012; 10(6): 678-84.

163. Hussein S., Nagy K., Nagy A. Human induced pluripotent stem cells: the past, present, and future. Clinical Pharmacology STherapeutics 2011; 89(5): 741-5.

164. Yin X., Li Y., Li J. et al. Generation and periodontal differentiation of human gingival fibroblasts-derived integration-free induced pluripotent stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 2016; 473(3): 726-32.

165. Ji J., Tong X., Huang X. et al. Sphere-shaped nano-ydroxyapatite/chitosan/gelatin 3D porous scaffolds increase proliferation and osteogenic differentiation of human induced pluripotent stem cells from gingival fibroblasts. Biomed. Mater. 2015; 10(4): 045005.

166. Zou L., Luo Y., Chen M. et al. A simple method for deriving functional MSCs and applied for osteogenesis in 3d scaffolds. Sci. Rep. 2013; 3: 2243.

167. Okita K., Matsumura Y., Sato Y. et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods 2011; 8: 409-12.

168. Lian Q., Zhang Y., Zhang J. et al. Functional mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells attenuate limb ischemia in mice. Circulation 2010; 121: 1113-23.

169. Srijaya T., Pradeep P., Zain R. et al. The promise of human induced pluripotent stem cells in dental research. Stem Cells Int. 2012; 2012: 1-10.

Поступила: 01.12.2016