CC BY
25УДК 541.64:678.745.84:615.015.35
М.Ю.Еропкин1, М.В.Соловский2, Е.М.Еропкина1, Е.Л.Шульцева2
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
ПОЛИМЕРНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ АНТИБИОТИКОВ-АМИНОГЛИКОЗИДОВ
ГУНИИ гриппа РАМН 2Институт высокомолекулярных соединений РАН, С.-Петербург
Синтезированы водорастворимые сополимеры акриламида (АА) с акриловой (АК) или метакриловой (МАК) кислотами с мол.массой 29000 и содержанием карбоксилсодержащего со-мономера 17—19 моль%, отличающиеся низкой токсичностью in vitro. Проведен токсикологический анализ на культуре фибробластов легкого эмбриона человека комплексов антибиотиков-аминогликозидов (канамицина, гентамицина и неомицина) с указанными сополимерами. Показано, что комплексы аминогликозид-сополимер АА-МАК обладают пониженной токсичностью по сравнению как с соответствующими антибиотиками, так и полимером-носителем, что согласуется с результатами исследования их химического строения.
Ключевые слова: токсичность in vitro, аминогликозиды, полимерные комплексы, полиакриламид, акриловая кислота, метакриловая кислота.
Введение. Антибиотики аминогликозидно-го ряда гентамицин, канамицин и неомицин — структурно родственные соединения, для которых характерно проявление выраженной токсичности при их использовании в лечебных целях, в частности, они характеризуются ото-и нефротоксичностью. Поэтому применение аминогликозидов проводят под контролем содержания их в крови, что практически неудобно, а неомицин из-за своей высокой токсичности не разрешен к парентеральному применению [2]. Хотя острые токсичные дозы (DL50) на животных для этих соединений относительно высоки, в токсикологической литературе наблюдается очень широкий разброс по их DL50 в зависимости как от вида использованного животного, так и способа введения препарата. Так, для канамицина моносульфата DL50 варьируют по разным источникам от 340 мг/кг (мышь, внутривенно) до > 17500 мг/кг (мышь, внутри-желудочно). Не меньший разброс значений характерен и для других аминогликозидов [2, 10]. В целом по степени возрастания токсичности аминогликозиды можно расположить следующим образом: канамицин < гентамицин < неомицин. В то же время, данных по токсикологическому исследованию этих антибиотиков in vitro относительно мало [6, 9, 12]. Исходя из этого, нашей первой задачей было оценить токсичность изучаемых антибиотиков, причем в форме их оснований, используемой для последующей конъюгации с носителями, на культуры клеток и подобрать оптимальную клеточную культуру, а также количественный метод оценки жизнеспособности клеток и параметров клеточного метаболизма.
Известно, что одним из эффективных и технологичных способов снижения токсичности лекарственных веществ (ЛВ) при сохранении специфической биологической активности является комплексообразование ЛВ с водорастворимыми нетоксичными ионогенными полимерами-носителями [1, 5]. В связи с этим нами была осуществлена модификация канамици-на (КО), гентамицина (ГО) и неомицина (НО) в форме оснований водорастворимыми реакцион-носпособными сополимерами акриламида (АА) с акриловой (АК) и метакриловой (МАК) кислотами. Выбор карбоксилсодержащих сополимеров АА в качестве полимеров-модификаторов свойств КО и ГО произведен впервые и обусловлен двумя причинами. Во-первых, наличие в сополимерах звеньев акриламида может обеспечить высокую гидрофильность полимерных цепей этих соединений. Действительно, сополимеры АА с МАК, содержащие гидрофобные микроблоки из звеньев МАК, растворимы в воде при содержании звеньев МАК до 20—22 мол.% и образуют водорастворимые комплексы с КО, ГО и НО. Во-вторых, в литературе имеются данные о нетоксичности поли-АА для теплокровных животных [4]. Это позволяло надеяться, что синтезированные сополимеры АА с АК (МАК), содержащие не более 20 мол.% карбоксильных групп, также будут нетоксичны. Далее мы провели сравнительное исследование токсичности in vitro полимеров-носителей АА-АК и АК-МАК, а также комплексов всех изученных антибиотиков с указанными носителями.
Материалы и методы исследования. Химические методы. Сополимеры акриламида с акриловой кислотой или метакриловой кислотой
получали ампульным методом путем гетерофаз-ной совместной полимеризации очищенных АА и АК в изопропаноле при 50°С в атмосфере аргона. Выпавший в осадок сополимер многократно обрабатывали абсолютизированным ацетоном и сушили в вакууме. Состав сополимеров определяли потенциометрическим титрованием их карбоксильных групп 0,1 N раствором NaOH на титраторе рН-673, а молекулярную массу — вискозиметрическим методом. Характеристическую вязкость сополимеров измеряли в вискозиметре Уббелоде при 30°С в 1 N растворе NaNO3 в воде.
В работе использовали сульфат гентамицина фирмы «Fluka» (Швейцария) и товарные сульфат канамицина и сульфат неомицина ОАО «Синтез» (Россия). Для получения антибиотиков в форме основания водные растворы их сульфатов пропускали через колонку с анионитом ЭДЭ-10П в ОН- форме.
Комплексообразование КО, ГО и НО с сополимерами АА-АК и АА-МАК проводили в водных растворах при комнатной температуре. Целевой раствор подвергали лиофильной сушке. Выход полимерных комплексов составлял 74— 95%. Содержание антибиотиков-оснований в комплексах определяли УФ-спектроскопией по методу [13]. УФ-спектры записывали на спектрофотометре Specord M-400.
Токсикологические методы in vitro. В предварительных опытах для работы использовали несколько клеточных линий: МА-104 (клетки почечного эпителия зеленой мартышки), А-549 (клетки карциномы легкого человека) и ФЛЭЧ (фибробласты легкого эмбриона человека). Оказалось, что авторская линия ФЛЭЧ, полученная и депонированная в коллекции клеточных культур НИИ гриппа РАМН, оптимальна для оценки in vitro токсичности аминогликозидов, так как дает наиболее близкие значения с данными литературы [6]. Кроме того, ФЛЭЧ — единственная не-трансформированная культура клеток из использованных, дающая результаты, наиболее адекватные при их проекции на организм человека. В
дальнейших исследованиях мы выбрали именно ФЛЭЧ как нашу «рабочую» клеточную линию.
В качестве тест-метода оценки состояния клеток в культуре был выбран метод восстановления тетразолиевого красителя резазурина. Краситель резазурин восстанавливается митохондриальны-ми дегидрогеназами живых клеток до флуоресцирующего продукта резаруфина (X макс. возбуждения при 530 нм, X макс. эмиссии при 590 нм). Интенсивность флуоресценции регистрировали на планшетном анализаторе «Chameleon» (Hydex, Финляндия). Показателем служила величина относительной флуоресценции (интенсивность флуоресценции образца/интенсивность флуоресценции бесклеточного контроля). Данный метод является одним из наиболее распространенных тест-методов оценки жизнеспособности и дыхательного метаболизма клеток in vitro, входящим в набор тестов по оценке токсичности, официально принятых в Европейском Союзе [7, 8]. Суспензию клеток засевали в 96-лу-ночные пластиковые культуральные планшеты («Sarstedt», Германия или «Orange», Бельгия) и культуру выращивали 24 ч в среде Игла-МЕМ с добавлением 10% сыворотки теленка до образования конфлуэнтного монослоя. Далее ростовую среду заменяли на растворы испытываемых препаратов в бессывороточной (поддерживающей) среде Игла-МЕМ и клетки дополнительно инкубировали 72 ч, после чего определяли интегральную активность их митохондриальных дегидро-геназ резазуриновым методом.
Результаты и обсуждение. В табл. 1 представлены основные химические характеристики синтезированных сополимеров АА-АК и АК-МАК и полимерных комплексов КО, ГО и НО на их основе.
Условия проведения процесса сополимериза-ции (молярное соотношение со-мономеров в исходной смеси, их концентрация и др.) позволили получить низкомолекулярные (М.м. = 19000— 29000 Да) сополимеры АА, содержащие 17—32 мол.% карбоксильных групп. Получение низкомолекулярных водорастворимых сополимеров АА—АК, АА—МАК, способных выводиться из
Таблица 1
Некоторые химические характеристики полимерных комплексов АА-АК и АА-МАК с антибиотиками-аминогликозидами
Состав полимерного комплекса Мол.масса Содержание АК или МАК (моль%) Вычисленное содержание антибиотика (масс%) Найденное содержание антибиотика (масс%)
НО-АА-АК 29000 19 15 13,8
ГО-АА-АК а 16,1
КО-АА-АК а 14,3
НО-АА-МАК а 17 15 15,3
ГО-АА-МАК а 16,1
КО-АА-МАК а 14,3
живого организма путем почечной фильтрации, было важным результатом работы. Строение сополимеров подтверждено функциональным анализом и исследованием их ИК спектров.
Комплексообразование антибиотиков оснований с карбоксилсодержащими сополимерами АА изучали методом ПМР спектроскопии в дей-терированной воде и в 0,9% растворе №С1 в D2О. Обнаружено, что в ПМР спектре полимерного комплекса ГО с сополимером АА—МАК в D2О наблюдаются только широкие сигналы протонов полимера-носителя и отсутствуют сигналы протонов ГО. Это свидетельствует о малой подвижности участков полимерных цепей, содержащих карбоксильные группы, в результате их связывания многофункциональным агентом — гентами-цином-основанием и о высокой степени иммобилизации молекул ГО в полимерной матрице. Спектральная картина существенно не изменяется при комплексообразовании ГО с сополимером АА—МАК в D2О в присутствии хлорида натрия, что свидетельствует о стабильности исследованных комплексов. Образование полимерных комплексов КО, ГО и НО в водных растворах подтверждали также методом мембранного равновесия в статических условиях при 37°С. При этом установлено, что в воде в случае более стабильного комплекса ГО с сополимером АА— МАК (с повышенной плотностью заряженных групп, обусловленной их микроблочным распределением по полимерной цепи) за 24 ч от полимера-носителя отщепляется 24,5% антибиотика, от сополимера АА—АК с меньшей плотностью ионогенных групп на цепи — существенно большее количество (45,4%). В физиологическом растворе скорости прохождения ГО через полупроницаемую мембрану выравниваются: за сутки 50,1% антибиотика проходят через мембрану в первом случае и 54,6% — во втором. Следу-
ет отметить, что через 24 ч в обоих случаях остаются ~ 50% антибиотика, связанного с полимером-носителем, что может обеспечить пролонгирование антимикробного действия антибиотика. Вискозиметрические исследования полимерных комплексов НО, КО и ГО показали, что комплексы на основе сополимеров АА—МАК, в отличие от комплексов на основе сополимеров АА—АК, имеют более компактную структуру макромолекулярных клубков. В образовании таких комплексов участвует большее число реак-ционноспособных карбоксильных групп сополимера и аминогрупп антибиотика, расположенных внутри клубка. Это может привести к большему снижению токсичности комплексов КО и ГО на основе сополимеров АА—МАК по сравнению с комплексами на основе сополимеров АА— АК, что и подтвердили результаты дальнейших токсикологических исследований на культурах ФЛЭЧ (табл. 2).
В табл. 2 представлены среднеингибиторные концентрации, т.е. концентрации препаратов, подавляющие клеточную жизнеспособность на 50 % по сравнению с интактным контролем, вычисленные по уравнениям линейной регрессии (линеаризация данных и вычисление параметров уравнений регрессии производились в программе Excel 2003). При этом в каждом опыте использовали не менее пяти концентраций изучаемых препаратов (на каждую концентрацию не менее двух проб). Использовали двоичные разведения препаратов или разведения, кратные 1,47 (корень шестой степени от 10). Каждый опыт повторяли минимум дважды.
Обращает на себя внимание относительно невысокая токсичность НО, ГО и КО, которая, тем не менее, находится в пределах разброса значений DL50 этих антибиотиков, полученных на разных видах животных и различных путях введе-
Таблица 2
Токсическое действие антибиотиков неомицина (НО), гентамицина (ГО) и канамицина (КО) в форме
оснований и их комплексов с полимерами акриламид-акриловая кислота (АА-АК) и акриламид-метакриловая кислота (АА-МАК) на культуры эмбриональных фибробластов легкого человека(ФЛЭЧ)
Антибиотик (носитель) Среднеингибиторная концентрация (IC50), мг/мл
НО 4,19+0,29
ГО 4,44+1,22
КО 7,17+0,69
АА-АК 11,8+0,30
АА-МАК 14,49+1,28
Комплекс НО-АА-АК 10,77+0,93
Комплекс НО-АА-МАК 18,7+0,20
Комплекс ГО-АА-АК 10,58+0,82
Комплекс ГО-АА-МАК 15,07+0,85
Комплекс КО-АА-АК 11,85+1,29
Комплекс КО-АА-МАК 17,18+1,31
ния препаратов [10]. Кроме того, наши данные согласуются с данными В.Г.Черникова и др. [6], полученными на ряде клеточных культур, которые выявили IC50 для гентамицина в пределах 2—3,5 мг/мл, для неомицина — 3—4,5 мг/мл, а для канамицина — 4—7 мг/мл. Как и в опытах in vivo, на клеточных культурах канамицин обладает меньшей токсичностью, чем гентамицин и неомицин. Все это позволяет считать использованную модель адекватной решению поставленных задач. Что касается относительно низкой токсичности in vitro исследованных антибиотиков, то мы можем выдвинуть следующую гипотезу: все клеточные линии культивируются в присутствии малых доз того или иного антибиотика. Это может приводить к активации защитного ответа на фактор стресса малой интенсивности. При этом происходит активация генов множественной лекарственной устойчивости, благодаря чему потомки таких клеток обладают устойчивостью не только к соединению, вызвавшему активацию, но и к целому ряду других [3, 11].
Токсичность исследованных полимеров-носителей существенно различалась: как видно из табл. 2, IC50 АА-МАК примерно в 1,2 раза выше, чем АА-АК. Комплексы антибиотиков с АА-АК проявляют примерно такую же токсичность, как полимер-носитель. Что касается комплексов НО-АА-МАК, ГО-АА-МАК и КО-АА-МАК, то их токсичность ниже (соответствующие 1С50 выше) не только самих антибиотиков, но и полимера-носителя. Это находится в полном соответствии с результатами вискозиметрических исследований комплексов, свидетельствующих о взаимной нейтрализации гораздо большего числа активных химических групп в случае комплексов аминогликозидов с АА-МАК, что и ведет к снижению их токсичности.
Такое удачное сочетание аминогликозидных антибиотиков с АА-МАК в качестве носителя, безусловно, нуждается в дальнейшем изучении, в частности, мы планируем исследовать влияние на токсичность in vitro различного содержания МАК в полимере.
Выводы. 1. Синтезированы относительно низкомолекулярные (М.м. = 19000—29000) водорастворимые сополимеры акриламид-акрило-вая кислота (АА-АК) и акриламид-метакриловая кислота (АА-МАК), характеризующиеся низкой токсичностью in vitro.
2. Получены комплексы антибиотиков ами-ногликозидов (канамицина, гентамицина и нео-мицина) с указанными сополимерами, причем комплексы аминогликозид-АА-МАК отличаются большей стабильностью и имеют более компактную структуру за счет участия в их образовании большего числа реакционноспособных групп.
3. Комплексы аминогликозид-сополимер АА-МАК обладают пониженной токсичностью на культуре фибробластов человека по сравнению как с соответствующими антибиотиками, так и полимером-носителем.
Работа выполнена при финансовой поддержке проекта по программе ОХНМРАН«Биомолекулярная и медицинская химия».
Список литературы
1. АфиногеновГ.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры. — СПб. : Гиппократ, 1993. — 263 с.
2. Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия (справочник). — М.: Медицина, 1982. — 495 с.
3. Нейфах А.А., Александрова А.Ю. Пониженное накопление флуоресцентных красителей в клетках, обладающих множественной лекарственной устойчивостью //Докл. АН СССР, 1986. — Т. 291. — № 4. — С. 989-991.
4. Савицкая М.Н., Холодова Ю.Д. Полиакрил-амид. — Киев: Техника, 1969. — 187с.
5. Соловский М.В., Заикина Н.А., Окулова Н.В. и др. Исследование антимикробной активности и острой токсичности полимерных солей гентами-цина // Антибиотики и химиотерапия, 2000. — Т. 45. — № 6. — С.10-12.
6. Черников В.Г., Терехов С.М., Крохина Т.Б. и др. Сравнительное изучение цитотоксичности антибиотиков аминогликозидного ряда на панельной клеточной биотест-системе // Бюлл.эксп.биол. мед., 2003. — Т. 135. — № 1. — С. 117-120.
7. Andrews M.J., Garle M.J., Clothier R.H. Reduction of new tetrazolium dye, Alamar Blue, in cultured rat hepatocytes and liver fractions//ATLA, 1997. — V. 25. — P. 641-653.
8. Clothier R, Starzec G., Pradel L. et al. The prediction of human skin responses by using the combined in vitro fluorescein leakage/Alamar Blue (Rezazurin) assay//ATLA, 2002. — V. 30. — P.493-504.
9. Dean R.T., Jessup W., Roberts C.R. Effects of exogenous amines on mammalian cells, with particular reference to membrane flow // Biochem. J., 1984. — V. 217. — № 1. — P. 27-40.
10. http://toxnet.nlm.nih.gov.
11. Kondratov R.V., Komarov P.G., Backer J. et al. Small molecules that dramatically alter multidrug resistance phenotype by modulating the substrate specificity of P-glycoprotein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001. — V. 98. — № 24. — P. 14078-14083.
12. Schafer T.W., Pascale A., Shimonaski G. et al. Evaluation of gentamycin for use in virology and tissue culture //Appl. Microbiol., 1972. — V. 23. — № 3. — P. 565-570.
13. Snyder S.L., Sobocinski P.Z. Convinient TNBS method for determination of amines // Analyt. Biochem., 1975. — V. 64. — № 2. — P. 284-288.
Материал поступил в редакцию 23.12.05.
M.Yu.Yeropkin1, M.V.Solovskiy2, Ye.M.Yeropkina1, Ye.L.Shultseva2
COMPARATIVE STUDY OF THE CYTOTOXIC ACTION OF ANTIBIOTICS POLYMERIC DERIVATIVES - AMINOGLYCOSIDES
1State-owned Institute of Inluenza, Russian Academy of Medical Sciences 2Institute of high- molecular compounds, Russian Academy of Sciences, St.-Petersburg
Water-soluble co-polymers of acrylamide (Aa) with acrylic (Ac) or metacrylic (Mac) acids were synthesized with a molecular mass of 29000 and the content of a carboxyl-containing co-monomer of 17 to 19 mole %, all the polymers being distinctive of their low toxicity in vitro. Complexes of antibiotics — aminoglycosides (kanamycin, gentamycin and neomycin) and of the said co-polymers were analyzed from the toxicological point of view on a cell culture of human embryo lung fibroblasts. It was shown that complexes of aminoglycosides and co-polymer Aa-Mac have lower toxicity as compared to both corresponding antibiotics and polymer-carrier which is in consistence with their chemical formula.
УДК [615.917:661.718].074
Е.И.Малочкина*, Т.А.Зотова, А.И.Торубаров, В.А.Жаков, М.А.Сокальский,
В.В.Шелученко, В.А.Петрунин
ХИМИКО-АНАЛИТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРОДУКТОВ ДЕСТРУКЦИИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ОТРАВЛЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ, ВЫМЫВАЕМЫХ ИЗ БИТУМНО-СОЛЕВЫХ МАСС
ФГУПГосударственный научно-исследовательский институт органической химии и технологии, Москва
Исследована динамика вымываемости экотоксикантов из промышленных образцов битумно-солевых масс от зарина, зомана и российского УХ при параметрах окружающей среды, характерных для района размещения полигона захоронения отходов и проведена их идентификация с использованием газовой и жидкостной хроматографии. Показано, что для многих идентифицированных продуктов миграции отсутствуют сведения о токсическом воздействии на живой организм.
Ключевые слова: битумно-солевые массы зарина, зомана и российского УХ, продукты выщелачивания из битумно-солевых масс, токсичность, сенсибилизирующее, гонадотропное, тератогенное и мутагенное действие.
Введение. Промышленные отходы, которые образуются при проведении технологического процесса, в том числе и при уничтожении химического оружия, могут являться источником поступления химических веществ в окружающую природную среду. Этап обращения с отходами и по технологической и технической сложности осуществления, по материальным затратам оказывается порой более сложной проблемой, чем создание и использование целевой продукции
[1, 13].
Химические вещества промышленных отходов, включаясь во все типы миграции и биологический кругооборот, могут приводить к загрязнению важнейших жизнеобеспечивающих природных сред: воздуха, воды, почвы и пищи [6, 8].
Способность химических элементов к аккумуляции в живых организмах с токсическим воздействием на многие их системы приводит как к появлению специфической заболеваемости, так
* Фрагмент диссертационной работы
и к ослаблению иммунных систем и росту общей неспецифической заболеваемости, особенно аллергического характера [12].
Одним из видов отходов, образующихся при уничтожении фосфорорганических отравляющих веществ — зарина, зомана и российского УХ ^УХ), являются битумно-солевые массы (БСМ) — промышленные отходы, подлежащие подземному захоронению на специальных полигонах. Поэтому при захоронении БСМ должны быть учтены не только технологии подготовки отходов к захоронению и самого захоронения, но и сделан детальный и тщательный прогноз санитарно-эпидемиологической обстановки [14].
Целью данной работы являлась оценка процесса вымываемости экотоксикантов из БСМ, идентификация вымываемых веществ из БСМ зарина, зомана и RVX и их токсикологическая характеристика.
Материалы и методы исследования. Объектами исследования являлись промышленные образцы БСМ, полученные при уничтожении зари-
