Антимикробная активность полимерных комплексов антибиотика амикацина Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ, 2014, Т.16, №4

УДК 544.777:615.33:582.282.23

антимикробная активность

полимерных

комплексов

антибиотика

амикацина

Ананьева Е.П.* (зав. кафедрой), 1Караваева А.В. (ст. преподаватель кафедры), 2соловский М.В. (в.н.с.)

1 Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия (кафедра микробиологии); 2 Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург, Россия

©Коллектив авторов, 2014

Были получены водорастворимые полимерные комплексы амикацина с сополимерами N-винилпирролидона (ВП) с крото-новой кислотой (КК), а также с полисахаридом лютеланом, образуемым дрожжами рода Cryptococcus, содержащие 20% и 25% антибиотика. Комплексообразование амикацина с сополимерами ВП-КК подтверждено определением предельных емкостей связывания амикацина этими сополимерами. Полученные полимерные комплексы сохраняют высокий уровень и широкий спектр антимикробного действия, присущие амикацину. Установлено, что полимерные комплексы амикацина на основе сополимера ВП-КК по значениям полулетальной смертельной дозы (ЛД50) характеризуются в 4 раза меньшей острой токсичностью, чем немоди-фицированный полимерами амикацин.

Ключевые слова: амикацин, дрожжевой полисахарид, острая токсичность, полимерный комплекс амикацина, противомикроб-ная активность, сополимер Ы-винил-2-пирролидон-кротоновой кислоты

antimicrobal activity of polymeric complexes of

antibiotic amikacin

1 Ananieva E.P. (head of the chair), 1Karavaeva A.v. (senior lecturer of the chair), 2 solovskij M.v. (leading scientific collaborator)

1 Saint-Petersburg State Chemical Pharmaceutical Academy; 2 Institute of Macromolecular Compounds of Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Russia

©Collective of authors, 2014

Hydrophilic polymeric complexes of amikacin with copolymers N-vinyl-2-pyrrolidone-crotonic acid and polysaccharide lutelan which was formed by yeasts of the Cryptococcus genus have been obtained. The content of antibiotic amikacin in the complexes was come to the bound 20-25%. Formation complexes of amikacin with copolymers N-vinyl-2-pyrrolidone-crotonic acid were confirmed by definition limit capacity binding of amikacin with copolymer. The polymeric complexes were

* Контактное лицо: Ананьева Елена Петровна, Тел: (812) 571-74-39

preserved the high level and broad-spectrum of antimicrobial action. It was established that polymeric complexes of amikacin on the basis of copolymers N-vinyl-2-pyrrolidone-crotonic acid by values LD50 were characterized by four times less of acute toxicity as compared with non-modified amikacin.

Key words: acute toxicity, antimicrobial action, amikacin, biosynthetic polysaccharide, copolymers N-vinyl-2-pyrrolidone-crotonic acid, polymeric complex of amikacin

введение

Амикацин - полусинтетический антибиотик из группы аминогликозидов, обладающий широким спектром антимикробного действия. Резистентность к амикацину развивается медленно. К недостаткам этого антибиотика, как и всех аминогликозидов, следует отнести проявление токсичности, в частности, ото- и нефротоксичность [1].

Известно, что комплексообразование аминогли-козидов с биосовместимыми полимерами приводит к снижению острой токсичности данных антибиотиков [Соловский М.В. и др. // Антибиотики и химиотерапия. - 2000. - Т. 45, №6].

Цель работы - получение полимерных комплексов амикацина, исследование их острой токсичности и изучение антимикробной активности.

Для модификации амикацина, содержащего ре-акционноактивные аминогруппы, в качестве полимерных носителей использовали нетоксичные синтетические сополимеры N-виниллпирролидона (ВП) с кротоновой кислотой (КК) [Соловский М.В. и др. // Антибиотики и химиотерапия. - 2000. - Т. 45, №6] и высокомолекулярный полисахарид лютелан, образуемый дрожжами Cryptococcus luteolus, содержащий звенья глюкуроновой кислоты [Витовская Г.А. и др. // Биоорганическая химия. - 1988. - №10].

материалы и методы

Сополимеры N-виниллпирролидона с кротоно-вой кислотой (ВП-КК) получали путем радикальной сополимеризации в изопропаноле в запаянных ампулах в атмосфере аргона в присутствии инициатора азоизобутиронитрила. Состав сополимеров определяли потенциометрически, по содержанию карбоксильных групп, молекулярную массу - вискозиме-трическим методом [Павлов Г.М. и др. // Высокомол. соед. - 1990. - 32А].

Внеклеточный полисахарид лютелан получали при культивировании C. luteolus в жидкой синтетической питательной среде, клетки отделяли центрифугированием, а из упаренного на вакуум-выпарном аппарате нативного раствора полисахарид осаждали спиртом этиловым [Витовская Г.А. и др. // Биоорган. химия. - 1988. - №10].

Для получения полимерных комплексов амика-цина сульфат переводили в амикацина основание (далее - амикацин) методом ионообменной хроматографии на ЭДЭ-10П в ОН- форме. Амикацин выделяли из щелочного фильтрата путем лиофильной сушки.

Комплексообразование амикацина с сополимера-

ми ВП-КК и лютеланом проводили в воде при перемешивании и массовом соотношении антибиотик : полимер, равном 0,25-0,33 : 1. Полученный раствор лиофильно сушили. Содержание амикацина в полимерных производных устанавливали методом спектроскопии [Snyder S.L., Sobocinski P.Z. // Analyt. Bio-chem. - 1975. - Vol. 64, №2].

Для определения антимикробной активности полученных амикацина основания и его комплексов использовали тест-микроорганизмы, указанные в Государственной Фармакопее (ГФ) XII: Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, Staphylococcus aureus АТСС 209Р, а также тест-штаммы микроорганизмов, полученные из НИИ ортопедии и травматологии им. Вредена: Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 14153, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442, Staphylococcus aureus 6538.

Антимикробную активность выявляли методом серийных разведений в жидких питательных средах (МПБ) с последующим высевом на плотную питательную среду (МПА) для определения бактерицидного или бактериостатического действия препарата [2, 3]. Микробная нагрузка составляла 5-104 клеток/мл тест микроорганизмов.

Исследование острой токсичности амикацина и его комплекса с сополимером ВП-КК выполняли согласно «Методическим указаниям по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» [3]. Работу проводили на 30 белых беспородных мышах-самцах массой 18-22 г в возрасте 9-12 недель к моменту введения препаратов. Тестируемые вещества вводили однократно внутрибрюшин-но в диапазоне доз от 1000 до 7940 мг/кг, ориентируясь на максимальный объем жидкости, допустимый при внутрибрюшинном введении мышам. В каждую группу (на каждую дозу) включали по 3 животных. Состояние мышей оценивали в течение первого часа, а также через 1, 3, и 14 суток после введения препаратов. Значение однократной полулетальной дозы (ЛД50) рассчитывали экспресс-методом Прозоровского [Прозоровский В.Б. и др. // Фармакология и токсикология. - 1978. - №4].

результаты и обсуждение

В таблице 1 приведены некоторые характеристики полученных полимерных комплексов амикацина.

Таблица 1

Характеристика полимерных комплексов амикацина

Полимер-носитель Комплекс

Обозначение m, мол. % Молекулярная масса, Да Обозначение Выход, % Содержание амикацина, масс. %

вычислено обнаружено

ВП-КК(1) 19,7 29000 A(20)+1 93,8 20 18,8

ВП-КК (1) 19,7 29000 A(25)+1 97,8 25 24,2

ВП-КК (2) 12,5 15000 A(20)+2 98,4 20 19,3

Лютелан 26,0 500000 A(20)+ лютелан 80,4 20

Примечание: m - содержание - СООН групп в полимерах; А -амикацин.

В процессе комплексообразования участвуют карбоксильные группы сополимеров и первичные аминогруппы антибиотика. Комплексы содержали ~ 20-25% амикацина и хорошо растворялись в воде.

Процесс комплексообразования амикацина с сополимерами ВП-КК подтверждали определением предельных емкостей связывания амикацина мг/г) сополимерами ВП-КК разного состава (табл. 2).

Таблица 2

Предельные емкости связывания амикацина

сополимерами

Сополимер ВП-КК q, мгА/г сополимера

образцы ММ, Да m, мол.% Н2О 0,9% раствор NaOH

1 39000 8,7 150,5 64,7

2 15000 12,5 163,3 107,9

3 19000 18,3 261,0 163,6

4 29000 19,7 341,1 277,9

5 30,4 497,7

6 38,9 667,6 516,4

Примечание: ММ - молекулярная масса.

Как следует из данных таблицы 2, связывание антибиотика в воде и в изотоническом растворе хлорида натрия возрастает по мере увеличения содержания карбоксильных групп в сополимере. Кроме того, для одного и того же сополимера значения q уменьшаются при переходе от связывания в воде к связыванию в 0,9%-ом растворе NaCl. Согласно этим данным, превалирует электростатический характер взаимодействия антибиотика с сополимерами ВП-КК. Вместе с тем, нельзя исключить и контакты амикацина с макромолекулами сополимеров ВП-КК посредством водородных связей в ходе комплексоо-бразования.

Антимикробная активность комплексов в отношении фармакопейных тест-штаммов E. coli, P. aeruginosa и S. aureus приведена в таблице 3.

Таблица 3

Антимикробная активность амикацина и его полимерных комплексов в отношении тест-микроорганизмов (гФ ХП), мкг/мл

Препарат E. coli АТСС 5922 S. aureus 209 Р P. aeruginosa АТСС 9027

МБК МБК МИК МБК

Амикацин (контроль) 32,0 8,0 8,0 16,0

A(20)+1 32,0 (6,4) 4,0(0,8) 16,0 (3,2) 32,0 (6,4)

A(25)+1 16,0 (4,0) 4,0(1,0) 16,0 (4,0) 32,0 (8,0)

A(20)+2 32,0 (6,4) 4,0(0,8) 16,0 (3,2) 32,0 (6,4)

А+лютелан 64,0 (12,8) 48,0 (9,6) 32,0 (6,4) 32,0 (6,4)

Примечание: МИК - минимальная ингибирующая концентрация; МБК - минимальная бактерицидная концентрация. В скобках указаны значения МБК и МИК в пересчете на содержание антибиотика в комплексе.

Показано, что по сравнению с амикацином антибактериальная активность его полимерных комплексов [A(20)+1] и [A(20)+2] в отношении S. aureus возрастала в два раза, хотя содержание антибиотика в комплексе составляло лишь 20%. В отношении E. coli минимальная бактерицидная концентрация (МБК) оставалась на уровне контроля. Однако при увеличении количества амикацина в комплексе с 20% до

ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2014. Т.1б. №4

25% наблюдали повышение антимикробной активности в 2 раза. Известно, что условно-патогенные бактерии P. aeruginosa обладают множественной устойчивостью к лекарственным препаратам. Антимикробная активность всех полимерных комплексов в отношении P. aeruginosa была в 2 раза меньше, чем контрольного препарата амикацина, причем отмечали бактериостатическое действие исследуемых образцов. При пересчете на содержание активного вещества (амикацина) в комплексах МБК в отношении данного тест-микроорганизма возрастала в 2-2,5 раза.

Особый интерес представляет комплекс ами-кацина с дрожжевым полисахаридом лютеланом, состоящий из маннозы, ксилозы и глюкуроновой кислоты, и с молекулярной массой 500.000 Да [Ви-товская Г.А. и др. // Биоорган. химия. - 1988. - №10]. Лютелан, как и другие экзополисахариды дрожжей рода Cryptococcus, обладает широким спектром биологической активности. Этот гликан проявляет иммуномодулирующее, гиполипидемическое, энте-росорбционное действия [Елинов Н.П. Химия микробных полисахаридов. - М., 1984], а, имея в своей структуре значительное количество карбоксильных групп, способен образовывать комплексы с амино-гликозидами. Показано снижение антимикробной активности амикацина в комплексе с лютеланом в отношении грамотрицательных бактерий в 2 раза, грамположительных - в 6 раз (табл. 3). Это может быть связано с высокой молекулярной массой (ММ) полисахарида (ММ лютелана в 25 раз выше, чем ММ синтетических сополимеров) и сложностью высвобождения антибиотика из комплекса. Однако при пересчете на содержание амикацина в комплексе, МБК в отношении E. coli и P. aeruginosa возрастает в 2,5 раза, а в отношении S. aureus отличается незначительно от контрольных значений. Также изучали антимикробную активность некоторых комплексов с тест-культурами, предоставленными НИИ травматологии и ортопедии им. Р.Р. Вредена: P mirabilis, S. aureus, K. pneumoniae, P. aeruginosa. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

минимальная бактерицидная концентрация амикацина и его полимерных комплексов в отношении

клинических штаммов бактерий, мкг/мл

Препарат S. aureus K. pneumoniae P. aeruginosa P. mirabilis

МБК МБК МИК МБК МБК

Амикацин (контроль) 8,0 8,0 8,0 16,0 32,0

A(25)+1 4,0 (0,8) 8,0 (2,0) 8,0 (2,0) 16,0 (4,0) 64,0 (16,0)

A(20)+2 8,0 (1,6) 8,0 (1,6) 32,0 (6,4) 64,0 (12,8) 64,0 (12,8)

Антимикробная активность исследованных комплексов не изменялась в отношении K. pneumoniae и S. аureus, но в пересчете на чистый антибиотик возрастала. Менее эффективным оказались комплексы в отношении P. aeruginosa и P. mirabilis, причем бактерии P mirabilis обладали наименьшей чувствитель-

ностью как к амикацину, так и к его полимерным комплексам. Отметим, что при пересчете на содержание чистого антибиотика в комплексах оба образца оказались более активными, чем амикацин в отношении всех четырёх микроорганизмов, в том числе и P. mirabilis.

При изучении острой токсичности было показано, что полулетальная смертельная доза полимерного комплекса амикацина составила 6050±1100 мг/кг при размахе колебаний ее средней ошибки 5000-7200 мг/кг, а ЛД 50 самого амикацина — 1540±250 мг/кг при размахе колебаний ее средней ошибки 1300-1800 мг/кг (табл. 5).

Таблица 5

острая токсичность in vivo амикацина, его полимерного комплекса и носителя при внутрибрюшном введении мышам

Препарат ЛД50, мг/мл

Сополимер ВП-КК1 7100 [6]

Полимерный комплекс A(20)+1 6050±1100

Амикацин 1540±250

По этому показателю, согласно классификации токсичности веществ при парентеральных способах введения, амикацин относят к малотоксичным препаратам [4]. Еще меньшей токсичностью обладает полимерный комплекс амикацина, относящийся к 4 классу токсичности - не токсичные вещества, также как и использованный полимерный носитель (табл.

5).

Таким образом, показана возможность получения нетоксичных полимерных комплексов амикацина с сополимерами N-виниллпирролидона с кротоновой кислотой, которые сохраняли антимикробную активность, имея в своем составе лишь 20-25% антибиотика.

выводы

1. На основе сополимеров N-виниллпирролидона с кротоновой кислотой и полисахарида лютелана получены полимерные комплексы амикацина с содержанием антибиотика 20 и 25%. Предполагаем наличие электростатического характера взаимодействия в комплексах.

2. Показано, что комплексы амикацина с синтетическими сополимерами ВП-КК в опытах in vitro проявляли выраженное антимикробное действие, сопоставимое с антибиотиком амикацином (в отношении грамотрицательных бактерий), а в отношении штаммов S. aureus превышали активность амикацина в 2 раза. Применение лютелана в качестве носителя для антибиотика приводило к снижению антимикробной активности комплекса, что, вероятно, связано с высокой молекулярной массой полисахарида.

3. В опытах in vivo острая токсичность комплексов амикацина с синтетическими сополимерами оказалась в 4 раза меньше токсичности амикацина основания.

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М: Новая волна, 2005. - 1206 с.

2. Гунар О.В., Каграманова К.А. Методы определения антимикробного действия лекарственных веществ // Хим.-фарм. журнал. - 2005. - №5. - С. 53-56.

3. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. I часть. - М.: Гриф и К, 2012. -944 с.

4. Березовская И.В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения // Хим.-фарм. журнал. -2003. - №3. - С. 32-34.

Поступила в редакцию журнала 07.11.2014 Рецензент: Н.П. Елинов