CC BY
63УДК 661.163.4:616-002.3
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА НЕКОТОРых АНТИСЕПТИКОВ,
полученных на основе нанотехнологий
Андреев В.А. (доцент кафедры)*, Касанов К.Н. (м.н.с.), Сбойчаков В.Б. (зав. кафедрой), Степанова Н.В. (слушатель интернатуры)
Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2015
В статье показана обоснованность применения антисептиков при гнойно-воспалительных процессах как дополнение к лечению антибиотиками. Отражены основные преимущества использования антисептиков для лечения раневых инфекций перед антибиотиками. Представлена сравнительная характеристика традиционных и новых антисептиков, полученных на основе нанотехнологий. Приведены основные достоинства наноантисептиков. Установлено их бактерицидное действие на различные бактерии, в том числе - на госпитальные штаммы. Исследованы воздействие различных концентраций антисептиков на тестируемые микроорганизмы и эффективность воздействия на госпитальные штаммы бактерий различных концентраций модифицированного катапола, содержащего акриловую и метакриловую кислоты. Отмечено преимущество использования катапола, содержащего акриловую кислоту. Выявлены основные наноантисептики, обладающие наибольшей эффективностью. Отражена перспектива их использования в качестве компонента для раневых покрытий.
Ключевые слова: акриловая кислота, арабиногалактан, мета-криловая кислота, модифицированный катапол, наноантисептики, раневые покрытия
COMPARATIVE EVALUATION OF SOME ANTISEPTICS OBTAINED ON THE BASIS OF NANOTECHNOLOGY
Andreev V.A. (associate professor of the chair), Kasanov K.N. (junior scientific collaborator), Sboichakov V.B. (head of the chair), Stepanova N.V. (student of internship)
Military Medical Academy named after S.M. Kirov, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2015
Validity of the antiseptics use in pyo-inflammatory processes as a complement to antibiotic treatment has been shown in the article. The main advantage of the antiseptics use for the treatment of wound infections before antibiotics are reflects. Comparative characteristic of traditional and new antiseptics, obtained on the basis of nanotechnology is presents. The main advantages of nanoantibiotics are done. It was installed their bactericidal activity against various bacteria, including hospital strains. The effects of different concentrations of antiseptics for the tested microorganisms and the effectiveness of hospital strains of bacteria of various concentrations of modified katapola containing acrylic and methacrylic acid have been investigated. It was marked the advantage of katapola using containing acrylic acid. The main nonanticipating with the greatest efficiency is identified. The perspective of their use as a component in wound dressings is reflected.
Key words: acrylic acid, arabinogalactan, methacrylic acid, modified katapola, nonanticipatory, wound coverings
Контактное лицо: Андреев Виктор Александрович, Тел.: (812) 292-34-65
ВВЕДЕНИЕ
Проблема распространения устойчивых к антибиотикам штаммов, в большой степени, осложняет борьбу с гнойно-воспалительными инфекциями в стационарах. Так, частота больных с гнойно-деструктивными процессами мягких тканей и их осложнениями составляет 30-35% от общего числа больных [1]. Причем металлобеталактамазопродуцирующие штаммы у неферментирующих бактерий, разрушающие как беталактамы, так и карбапенемы, выявлены в 23 стационарах 9 городов России, а частота выделения мети-циллинрезистентных штаммов в стационарах Москвы и Санкт-Петербурга достигает 65,9% [2].
В связи с вышеизложенным, применение в хирургической практике антисептиков и материалов на их основе, в значительной степени, дополняет профилактику и лечение раневых инфекций. Важным качеством антисептиков является более медленное, по сравнению с антибиотиками, появление устойчивых к ним штаммов бактерий. Однако к традиционным антисептикам, таким как фурацилин, хлоргексидин, борная кислота и другие, возбудители гнойно-воспалительных инфекций выработали устойчивость, что, в значительной мере, снизило эффективность использования антисептиков. Появление резистентности отмечают даже к пероксиду водорода, что связано со способностью ингибировать антисептик выработкой бактериальной каталазы и другими клеточными и внеклеточными метаболитами. Одним из современных способов повышения эффективности применения антисептиков является применение нанотехнологий. Так, использование серебра в виде наноразмерных частиц способно многократно повысить бактерицидный эффект [3].
Вещества в виде наночастиц обладают свойствами, часто - радикально отличными от их аналогов в виде макроскопических дисперсий, что помогает создавать новые фармакологически активные препараты и применять их в медицине [4]. Помимо антибактериального, использование веществ в наносостоянии дает возможность достигать и другие активные лечебные эффекты: иммуномодулирующий, антиоксидантный, дегидратационный а также сорбционный при применении с соответствующими раневыми покрытиями [5]. Одной из первых технологий, основанных на использовании наносостояний, является применение липосом - микроскопических сферических везикул, мембрана которых состоит из молекул природных фосфолипидов, аналогичных входящим в состав клеточных мембран эукариотов. Достоинства липосом как носителей лекарств очевидны: полученные из природных фосфолипидов липосомы полностью биоде-градируемы и биосовместимы, они пригодны для иммобилизации в них многих фармакологических агентов. Антибактериальные препараты внутри липосом более устойчивы в организме, так как изолированы липидной мембраной от повреждающих воздействий внешних условий и не оказывают общетоксического действия на макроорганизм.
Вместе с тем, большинство антисептиков на основе наноматериалов исследованы еще недостаточно.
Цель работы - изучение антимикробной активности наноантисептиков (серебро, золото, платина, железо, стабилизированные арабиногалактаном; коллоидные растворы серебра, цинка и меди), традици-
■
онных антисептиков (катапол, диоксидин) и нового антисептического препарата (модифицированного ка-тапола).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили в соответствии с «Методами испытаний дезинфекционных средств для оценки их безопасности и эффективности» (М., M3 РФ, 1998) на следующих микроорганизмах: Staphylococcus aureus (штамм ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). После 15 минутной экспозиции соответствующих концентраций этих микроорганизмов антимикробное действие растворов нейтрализовали универсальным нейтрализатором (содержащим твин 80, сапонин 3%, гистидин 0,1%, цистеин 0,1%), 0,5% растворами тиосульфата натрия и хлористого натрия (для нейтрализации антисептиков, содержащих Ag). Затем проводили высев на соответствующую плотную среду, используя количественные методы посева. Антисептики считали эффективными при подавлении роста 99,99% колони-еобразующих единиц (КОЕ) соответствующих микроорганизмов. Дополнительно определяли размеры зон угнетения роста тест-микробов, образующихся при испытании растворов различных концентраций и обработанных ими нано-гель-пленок Acetobacter xylinum. Исследование проводили, придерживаясь методики, изложенной в «Testing for antibacterial activity and efficacy on textile products» (Japanese Industrial Standard). Метод описан для определения бактерицидной активности изделий из текстильного материала, его перевод опубликован во втором английском издании в 2002 г. (Japanese Standards Association /Akasaka, Minato-ku, Tokyo, 107-8440 JAPAN). Посевную дозу готовили согласно стандарту мутности 0,5 по МакФарланд, что соответствует концентрации микроорганизмов 1,5-108 КОЕ/мл. После посева соответствующих микроорганизмов и аппликации материалов, содержащих антисептики, чашки Петри инкубировали при 37 оС. Зоны задержки роста микроорганизмов измеряли с точностью до 0,5 мм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Первую группу исследованных препаратов составили неорганно-органические нанобиокомпозиты, содержащие металлы (серебро, золото, платину и железо), стабилизированные арабиногалактаном. Вторая группа препаратов включала коллоидные растворы серебра, цинка и меди, стабилизация которых была осуществлена путём адсорбции наночастицами положительно заряженных ионов металлов. В результате происходило образование нанокластеров, которые удерживаются в жидкости, не переходя в донную фазу за счёт теплового движения молекул воды. Третью группу составили комплексы ПВП-нано-Ag0 (повиар-гол) и ПВП-нано-Se0 (селенопол), представляющие собой наночастицы нуль-валентного серебра и селена, стабилизированные ПВП (поливинилпирролидон). Концентрации исследуемых препаратов в растворах были выбраны в соответствии с рекомендациями производителей (0,5, 1,0, 3,0% диоксидин; 2,5% катапол; 2,5% повиаргол; 0,5% селенопол; коллоидные растворы: 0,15% Ag0; 2,15% Zn0; 1,7% Cu0; растворы металлов, стабилизированные арабиногалактаном: 2,5% Ag0; 0,03% и 2,5% Au0; 0,01% и 2,5% Fe0; 0,028% и 2,5% Pt0;
0,1% фуллерен С60, ковалентно связанный с ПВП; 0,3% водная дисперсия шунгитового углерода (ШУ).
Изучали также комбинированный препарат на основе концентрата антимикробного средства «Ар-дезин», содержащего 50% пероксида водорода и 750 мг/дм3 серебра в виде комплексных ионов с винной кислотой. С помощью восстановителя, введенного в этот препарат, ионное серебро частично было переведено в нанокристаллическое, что зафиксировано по появлению оптического эффекта Тиндаля в прозрачном растворе. Препараты сравнивали с традиционными антисептиками - диоксидином, катаполом и модифицированным катаполом (МК). Последний был разработан в Институте высокомолекулярных соединений РАН и представляет антисептический комплекс, из состава которого был исключён ПВП.
Исходный антисептик - катапол является сополимером ПВП с кротоновой кислотой и катамином Б (антисептик - диметилалкилбензиламмоний хлорид). Сополимер при этом способствует пролонгированному действию препарата. Вместе с тем, включение ПВП в лекарственные композиции нежелательно в связи с агрессивным воздействием на ткани организма [6]. В модифицированном катаполе вместо ПВП использовали 2-деокси-2-метакриламидо-Б-глюкозу, а вместо кротоновой кислоты - акриловую или метакриловую кислоту. Результаты исследования антибактериальной активности представлены в таблице 1.
Таблица 1
Антибактериальная активность антисептиков
Препарат Эффективность обеззараживания при различных концентрациях растворов антисептиков (в %)
S. aureus ATCC29212 P. aeruginosa ATCC 27853 E. coli ATCC 25922
Диоксидин 1% 99,99 99,99 29,6±2,70
Диоксидин 0,5% 99,99 99,99 34,3±1,53
Диоксидин 3% 99,99 99,99 30,2±1,98
Катапол 2,5% 99,99 99,99 34,5±1,37
Повиаргол 2,5% 99,99 94,0 99,99
Селенопол 0,5% 99,99 98,0 99,99
Ag0 0,15% 90,99 96,0 98,0
1,7% 10,0 15,0 55,0
Zn0 2,15% 21,0 10,0 28,0
Ag0 0,1мас% на основе средства «Ардезин» 10,0 55,0 60,0
Ag0 0,25мас% основе средства «Ардезин» 99,99 99,99 99,99
Fe0 0,01% и 2,5% (арабиногалактан) 6,0 8,0 8.0
Pt0 0,028% и 2,5% (арабиногалактан) 8,0 10,0 8,0
C60/ПВП 0,1% 6,0 8,0 8,0
ШУ 0,3% 4,0 6,0 4,0
МК-А 1,5% (с акриловой кислотой) 99,99 99,99 99,99
МК-М 1,5% (с метакриловой кислотой) 99,99 99,99 99,99
Ag0 0,1мас% на основе средства «Ардезин» 10,0 55,0 60,0
Ag0 0,25мас% основе средства «Ардезин» 99,99 99,99 99,99
Чувствительность микроорганизмов к двум модифицированным формам катапола (с акриловой -МК-А и метакриловой - МК-М кислотами) с определением оптимальной антимикробной концентрации МК, в сравнении с катаполом, была исследована нами на госпитальных штаммах, выделенных из ран пострадавших и больных, находившихся на лечении в клини-
ке военно-полевой хирургии ВМА им. С.М. Кирова: S. aureus, P. aeruginosa, Acinetobacter baumannii. Эти бактерии представляли группу наиболее часто выделяемых возбудителей гнойно-воспалительных инфекций. Общее количество наблюдений составило 158 (табл. 2).
Таблица 2
Оценка эффективности антимикробного действия различных
концентраций модифицированных форм катапола на госпитальные штаммы микроорганизмов по зонам задержки роста (мм, Х±ст)
Концентрация Исследованные штаммы микроорганизмов
S. aureus P. aeruginosa A. baumannii
МК-А 2,0% 29,9±1,51 26,5±2,04 40±2,11
МК-А 1,5»% 39,9±1,52 25,0±1,6 39,9±1,44
МК-А 1,0% 24,0±2,03 23,2±2,25 20,4±2,97
МК-А 0,5% 22,8±1,36 22,7±2,05 20,3±3,03
МК-М 2,0% 21,8±3,55 28,1±1,59 19,9±1,61
МК-М 1,5% 34,3±1,49 24,6±1,83 20,4±1,10
МК-М 1,0% 24,1±2,22 20,4±2,80 24,6±1,95
МК-М 0,5% 23,76±2,08 20,0±2,99 20,2±2,44
Катапол 2,0% 24,1±2,16 29,7±1,46 30,2±2,43
Катапол 1,5% 21,4±1,78 29,9±2,17 28,3±2,18
Катапол 1,0% 20,3±4,12 27,2±3,34 27,8±2,70
Катапол 0,5% 20,1±2,86 19,9±2,53 24,9±2,27
Госпитальный штамм Препа рат
Диоксидин 1% Аргентарабино-галактан 2,5% Катапол 2,5% МК-А 1,5%
Klebsiella pneumoniae 34,6±1,69 20,6±1,50 29,3±2,20 33,1±1,76
S. aureus 34,3±1,27 33,6±1,57 19,4±1,83 36,9±2,18
P. aeruginosa 34,3±1,24 22,9±2,66 14,5±1,75 24,8±1,93
Ассоциация микроорганизмов 32,6±2,96 25,1±1,37 24,0±2,26 30,1±1,31
Как видно из таблицы 3, имело место повышение резистентности госпитальных штаммов S. aureus и P. aeruginosa к 2,5% раствора катапола, что, вероятно, связано с достаточно длительным применением его в клинике для местного лечения ран.
Наиболее эффективными оказались образцы нано-гель-плёнок бактериальной целлюлозы, содержащие 1% раствор диоксидина и 1,5% раствор МК-А, что наглядно видно на рисунке 1.
Как видно из представленных результатов, МК-А обладал наиболее высокой антимикробной активностью к исследованным штаммам в концентрации 1,5%. МК-М также оказался наиболее эффективен в концентрации 1,5%, но в меньшей степени по сравнению с МК-А. Предшественник МК - катапол более эффективно подавлял рост синегнойной палочки, но в остальных случаях эффективность его воздействия на рост бактерий была более низкой, что, вероятно, связано с повышением резистентности к нему исследованных госпитальных штаммов.
На основании полученных результатов был сделан вывод, что модифицированный катапол может быть использован в качестве антисептического компонента для раневых покрытий, причём наибольшей эффективностью обладает 1,5% раствор, содержащий в своей структуре акриловую кислоту.
Мы также изучали антимикробную активность 4-х различных концентраций аргентарабиногалактана: 0,1%, 0,25%, 0,75%, 1,5%, 2,5%, 3,0%. Растворы предварительно сорбировали на нано-гель-плёнках бактериальной целлюлозы. Установлено, что по отношению к исследуемым штаммам микроорганизмов наиболее эффективным оказался 2,5% раствор аргентарабино-галактана.
Растворы, проявившие максимальную антимикробную активность, сорбировали нано-гель-плёнкой целлюлозы Acetobacter xylinum и изучали их на госпитальных штаммах по зонам задержки роста (табл. 3).
Таблица 3
Сравнительная характеристика антимикробного действия
антисептиков, сорбированных нано-гель-плёнкой целлюлозы АсеЬЬаСегхуНпит, на госпитальные штаммы микроорганизмов по зонам задержки роста (мм, Х±ст)
Рис. 1. Антибактериальная активность препаратов нано-гель-плёнки бактериальной целлюлозы с абсорбцией на ней антисептиков
Зафиксировано повышение резистентности исследованных госпитальных штаммов (особенно S. aureus) к 2,5% раствору катапола. Раствор серебра, стабилизированный арабиногалактаном, менее эффективно подавлял рост K. pneumoniae и P. aeruginosa.
На современном этапе, помимо использования традиционных повязок и мазей, находят все большее применение раневые покрытия. Это и понятно, если учесть возможность создания разнообразных свойств, обеспечивающих скорейшее заживление раневой поверхности, таких как: создание оптимальной среды для заживления, сорбционные свойства (в том числе поглощение микроорганизмов из раневой поверхности), доставку лекарственных препаратов в рану, обеспечивающих антимикробное действие и др. Для придания антимикробных свойств возможна иммобилизация серебра на раневые покрытия в различных формах (в виде солей, коллоидных растворов, серебро-содержащих белков и др.). Однако указанные формы не обеспечивают достаточной продолжительности антимикробного действия активного ионизированного серебра. По данным многочисленных публикаций, наиболее перспективным для иммобилизации на раневые покрытия являются наноразмерные частицы серебра (AgNPs - ArgentumNanoParticles), обеспечивающие дозированный и пролонгированный антимикробный эффект [4]. Разработка способов получения и введения в матрицу раневых покрытий наночастиц серебра даст возможность значительно улучшить их антимикробные свойства. Широко представлены способы синтеза наночастиц металлов, в том числе AgNPs, в структуре природных (монтмориллонит, каолинит, смектит и др.) и синтетических (лапонит) слоистых силикатов [1, 3, 5, 7]. Полученные таким образом нано-размерные частицы удерживаются в межслоевом пространстве и/или на внешних поверхностях силиката, что препятствует их агрегации и образованию мало-
активных агломераций. Высокая сорбционная способность (набухание) слоистых силикатов, заметное влияние на исходные физико-химические свойства полимеров, а также антимикробное действие, обусловленное способностью к образованию AgNPs, определяют интерес к использованию их в качестве наполнителей матриц раневых покрытий. Так, иммобилизованный в структуру композитного покрытия модифицированный серебром монтмориллонит (Ag-MMT) является источником дозированного выведения Ag+ в рану и, обеспечивая пролонгированные антимикробные свойства покрытия, препятствует цитотоксическому действию серебра.
При сравнительной оценке биоцидной активности ряда традиционных антисептиков и водных взвесей высокодисперсного (D<0,25 мм) модифицированного монтмориллонита различной концентрации выявили значимую эффективность последнего. Наиболее эффективное бактериостатическое действие Ag-MMT содержащих образцов установили по отношению к культурам E. coli и P. aeruginosa, причем отмечали равнозначное действие на референтные и госпитальные штаммы указанных микроорганизмов. На рисунке 2 представлены результаты определения бактериостати-ческого действия разработанных образцов и коммерческих раневых покрытий в отношении госпитального штамма синегнойной палочки.
По результатам оценки способности разработанных матриц подавлять рост раневой микробиоты установлено значимое снижение уровня бактериальной обсемененности инфицированных ран, а также возможность сравнительно длительного его поддержания ниже критического уровня (103 КОЕ) за счет пролонгированного антимикробного действия. Эффективное подавление раневой инфекции, являющейся ведущим патогенетическим звеном осложненного течения раневого процесса, объясняет значимое сокращение сроков заживления ран. На рисунке 3 представлена макроскопическая картина гранулирующих ожоговых ран на 20 сутки после некрэктомии с использованием различных способов ведения. Наблюдали выраженность процессов репарации, отсутствие перифокаль-ного воспаления, гнойного отделяемого при ведении ран с использованием разработанных антимикробных матриц.
Рис. 2. Бактериостатическое действие раневых покрытий в отношении госпитального штамма P. aeruginosa: А - коммерческих (1 - «Бранолинд Н», 2 - «АМН», 3 -«АУТ-М», 4 - «Mepore®», 5 - «Апполо», 6 - «Cosmopor®»,
7 - «Atrauman® Ag»), В - на основе гидрогелевого нанокомпозита (концентрация Ag-MMT в полимере, масс.%: 1 - 0%, 2 - 1%, 3 - 10%, 4 - 3%, 5 - 2%, 6 - 5%), С - на
основе дезинтегрированной целлюлозы Gluconobacter xylinus (концентрация Ag-MMT в полимере, масс.% 1 - 0%, 2 - 0,05%, 3 - 0,1%, 4 - 0,2%, 5 - 0,3%, 6 - 0,5%, 7 - 1%)
Так, видно, что ни одно из коммерческих покрытий не образует зоны задержки роста бактерий, т.е. их применение для профилактики и борьбы с раневой инфекцией не дает достаточной эффективности. Отметим, что разработанные монтмориллонит содержащие матрицы значимо подавляли рост метициллин-рези-стентного стафилококка (MRSA). Данное наблюдение особенно актуально в условиях возросшей резистентности микроорганизмов, в т.ч. основных возбудителей раневой инфекции по отношению к традиционным антисептикам.
Рис. 3. Общий вид гранулирующих ожоговых ран на
20 сутки после некрэктомии: А - ведение раны под асептической повязкой, В - применение антимикробного покрытия на основе гидрогелевого нанокомпозита с АдЫРБ
выводы
Нано-гель-плёнки бактериальной целлюлозы с иммобилизованными на них антисептическими препаратами (2,5% раствор аргентарабиногалактана, 2,5% раствор катапола, 1% раствор диоксидина и 1,5% раствор модифицированного катапола) могут быть применены в качестве матрицы биоактивных раневых покрытий. При этом последние два антисептика обладают наибольшей антибактериальной активностью.
Модифицированный катапол, содержащий в своем составе акриловую кислоту, перспективен как для использования в качестве антисептического компонента раневых покрытий, так и для обработки ран на догоспитальном этапе медицинской эвакуации. Наибольшей эффективностью обладает его 1,5% раствор.
Раневые покрытия для инфицированных ран вме- вязкой ускоряют сроки заживления. сто традиционного ведения ран под асептической по-
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Толстых М.П., Луцевич О.Э. Теоретические и практические аспекты заживления ран. - М.: Дипак, 2007. - 96 с.
2. Шевченко О.В., Эйдельштеин М.В., Степанова М.Н. Металлобеталактамазы: значение и методы выявления у грамо-трицательных неферментирующих бактерий// Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. - 2007. - Т. 9, №3. - С. 20-25.
3. Крутяков Ю.А., Кудринский А.А., Оленин А.Ю., Лисичкин Г.В. Синтез и свойства наночастиц серебра: достижения и перспективы// Успехи химии. -2008. - Т. 77. - С. 242.
4. Borm P.J., et al.The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC// Particle Fibre Toxic. - 2006. - Vol. 3. - P. 11-35.
5. Венгерович Н.Г. Патогенетическое обоснование биоактивных наноматериалов при раневом процессе: Дис. ... канд. мед. наук - СПб, 2011.
6. Попов В.А., Тюнин М.А., Зайцева О.Б. и др. Морфофункциональные изменения во внутренних органах экспериментальных животных при внутрибрюшинном введении комплекса С60 с N-поливинилпирролидоном// Прил. Вест. Рос. Воен.-мед. академии. - 2008. - Т. 23, №3. - С. 484.
7. Патент на изобретение «Антисептическое средство» №2446808 МПК 8А61 К 31/78, опубл. 10.04.2012 г. Авторы: Венгерович Н.Г., Хрипунов А.К., Андреев В.А и др.
Поступила в редакцию журнала 20.06.2015
Рецензенты: С.Д. Жоголев, В.С. Митрофанов
