CC BY
28
3,4 mg of protein) and roncoleukine (1500 IE/animal) was lower by 6,03 times compared with control. The helminths recovered from immunized dogs had no the terminal segment. The efficacy of protection was 94,5%.
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ПРОТОСКОЛЕКСОВ ECHINOCOCCUS GRANULOSUS И ECHINOCOCCUS MULTILOCULARIS
Бережко В.К., Тхакахова А.А., Сасикова М.Р.
ВНИИ гельминтологи им. К.И. Скрябина
Введение. Характеристика антигенного состава различных белковых материалов, к числу которых относятся и паразитарные антигены, методом электрофореза позволяет определять, с одной стороны, количество входящих в их состав компонентов, их электрофоретическую подвижность, а с другой, по степени и четкости проявления полос косвенно судить о количественном содержании каждого из них в исследуемом препарате.
Использование при электрофоретическом разделении маркеров известной молекулярной массы позволяет также охарактеризовать по этому показателю все компоненты исследуемого биоматериала. В последние годы наибольшее распространение получил метод денатурирующего диск-электрофореза в полиакриамидном геле (ПААГ) с SDS, который широко использовали при характеристике различных антигенных препаратов из гельминтов, включая и эхинококки (Dottorini, Tassi, 1978; Feng et al, 1993; Wen et al, 1995; Ito et al, 1993; Rafiei, Craig, 2002 и др.).
Целью настоящей работы было провести сравнительную электрофоретическую характеристику спектра белков-антигенов клеточных метаболитов протосколексов E. granulosus и E. multilocularis.
Материалы и методы. Источником получения клеточных метаболитов служили протосколексы E. granulosus и E. multilocularis.
Культивирование клеток протосколексов эхинококков проводили в искусственной питательной среде RPMI-1640 в условиях СО2-инкубатора фирмы «Herauser» по методике Далаевой, Бережко (2005). Полученные серии клеточных метаболитов предварительно исследовали на антигенную активность иммуноферментной реакцией с использованием референс-положительных и отрицательных сывороток, в качестве которых использовали соответственно сыворотки людей с подтвержденным (хирургически) диагнозом цистной и альвеолярной формы эхинококкоза и сыворотки людей-доноров. Для последующей работы использовали только антигеноактивные серии клеточных метаболитов.
Разделение полученных клеточных метаболитов проводили денатурирующим электрофорезом в вертикальной камере («Хеликон», Россия)
58
в пластинах полиакриламидного геля размером 10*8 см в градиенте концентрации ПААГ 10-15% в присутствии додецилсульфата натрия. Электрофорез проводили при силе тока 25 мА на один гель. Электрофореграммы окрашивали 1%-ным раствором амидочерного 10 Б на 7%-ной уксусной кислоте в течение 15-20 мин., отмывку проводили 7%-ной уксусной кислотой. В качестве маркеров для определения молекулярной массы белковых компонентов в составе исследуемых биоматериалов использовали: апротинин (6500 Da); лизоцим (14400 Da); ингибитор трипсина (21500 Da); углекислая ангидраза (31000 Da); овальбумин (45000 Da); бычий сывороточный альбумин (66000 Da); фосфорилаза (97400 Da); р-
галактозидаза (116000 Da); миозин (200000 Da).
Результаты и обсуждение. Электрофоретический анализ клеточных метаболитов протосколексов E. granulosus и E. multilocularis не выявил существенных различий как в количественном отношении, так и в проявлении и степени окраски белковых компонентов на электрофореграммах.
В биоматериале из E. granulosus проявилось 9, а из E. multilocularis — 8 компонентов, располагающихся в диапазоне белков молекулярной массы 31,0200,0 кДа (таблица). Наиболее четко выраженные и интенсивно окрашенные полосы на электрофореграммах обоих видов эхинококков представляли компоненты, проявившиеся в зоне белков молекулярной массы между 45-66 кДа. Незначительные различия регистрировали в четкости проявления белковых компонентов, располагающихся в зоне белков молекулярной массы между 31,0-45,0 кДа. Эти белки более четко представлены на электрофореграмме клеточных метаболитов протосколексов E. granulosus.
Таблица
Белковый спектр клеточных антигенов протосколексов Echinococcus multilocularis и Echinococcus granulosus
№ п/п Исследуемый биоматериал Результаты исследований в ПААГ
Кол-во выявлен- ных белковых компонен -тов Молекулярная масса белковых компонентов в кДа
14,4- 21,5 21,5- 31,0 31,0- 45,0 45,0- 66,0 66,0- 97,0 116,0- 200,0
1 Клеточный антиген протосколексов E. multilocularis 8 — — 1 3 1 3
2 Клеточный антиген протосколексов E. granulosus 9 — — 2 3 1 3
59
В то же время белковые компоненты, проявившиеся в зоне белков молекулярной массы между 66-200 кДа на фореграммах биоматериалов обоих видов эхинококков фактически не различались ни по электрофоретической подвижности, ни по степени и четкости проявления. Полученные нами результаты в большинстве своем согласуются с аналогичными исследованиями других авторов, хотя имеются и некоторые различия в количестве выявляемых белковых компонентов.
Так, электрофорез очищенных антигенов (АГ) цистной жидкости E. granulosus в ПААГ с SDS показал, что выделенный из нее АГ 4 имел молекулярную массу 67, а АГ 5 включал три компонента между 20 и 10,5 кДа (Pozzuoli et al., 1972; 1975). По другим данным аналогичный анализ фракции 5 цистной жидкости E. granulosus выявил единственную линию на уровне белков мол. массы 69 кДа (Dottorini, Tassi, 1977; 1978).
В экскретах и секретах герминативных клеток и цистной жидкости E. granulosus Feng et al. (1993) обнаружили два компонента мол. массы 52 и 38 кДа, причем наибольшую специфичность в иммунологических реакциях регистрировали с компонентом мол. массы 52 кДа. В то же время Zhang, Mc Manus (1996) считали потенциально важным диагностическим маркером цистного эхинококкоза компонент мол. массы 38 кДа. При аналогичном анализе белковых экстрактов из протосколексов и тканей метацестод E. multilocularis регистрировали белковые фракции в зоне белков мол. массы 44, 35, 27, 21, 17,5, 16,5 кДа, которые распознавались антителами класса IgG, ^Gn IgG4.
Наиболее специфичными были признаны антигены протосколексов мол. массы 27, 21 и 17,5 кДа (Wen et al., 1995 а, в).
Заключение. В результате исследований белкового спектра клеточных метаболитов протосколексов E. granulosus и E. multilocularis установили, что в процессе культивирования клетки протосколексов обоих видов эхинококков выделяют в среду обитания продукты метаболизма белковой природы, в большинстве своем идентичные по молекулярной массе и электрофоретической подвижности. Полученные данные позволяют сделать заключение о возможности использования в качестве источника получения антигенов как E. granulosus, так и E. multilocularis.
Литература: 1. Далаева И.Б., Бережко В.К. // Материалы докладов научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - 2005. - вып. 6. - С. 97-99. 2. Dottorini S., Tassi C. // IntJ.Parasitol.-1978. - V.8.-P.259-265. 3. Feng J.J., Wang J.Y., Qu J.A., Xiao S.H. // Chin. J. Parasitol. and Parasit. Diseases. - 1993. - V. ll, №1. - P.63-65. 4. Ito A. Nakao M., Ito M. et al // 14th Int. Conf. of the WAAVP. Progr. and Abstr. 8 - 10 Aug. - 1993. - Cambridge, UK. - 1993. -P.168. 5. Pozzuoli R., Musiani P., Arm E. et al. // Exp. Parasitol. - 1972. - V. 32. -P. 45-55. 6. Pozzuoli R., Piantelli M., Perucci C. et al. // J. Immunol. - 1975. -V.115. - P.1459 - 1463. 7. Rafiei A., Craig P. S.// Ann. Trop. Med and Parasitol. -2002. - V. 96, № 4. - P. 383-389. 8. Wen H., Craig P.S., Ito A., et al. // Ann. Trop.
60
Med and Parasitol. - 1995(a). - V. 89, № 5. - P. 485-495.9. Wen H., Craig P.S., Vuitton D.A. et. al. // 17th Int. Congr. Hydatidol. - 1995(b). Limassol-Cyprus, Abstracts. - 1995. - P. 184.10. Zhang L. H., Mc Manus D.P. // Parasite Immunology. - 1996. - V. 18, № 2. - P. 597-606.
Comparative physicochemical characteristics of Echinococcus granulosus and E. multilocularis protoscolices cell metabolites. Berezhko V.K., Thakachova A.A., Sasikova M.R. All-Russian K.I. Skryabin Institute of Helminthology.
Summary. One represented the results of electrophoretic analysis of E. granulosus and E. multilocularis protoscolices cell antigens. 9 and 8 components were found in the protein spectrum of biological material originated from E. granulosus and E. multilocularis respectively located in zone of proteins with molecular weight of 31,0-200,0 kDa. The most clearly developed protein components at the electrophoregrams of both Echinococcus species located in zone of proteins with molecular weight of 45-66 kDa. The obtained data evidenced about that E. granulosus and E. multilocularis protoscolices cell during cultivation excreted to medium the metabolism products of protein nature which were mostly identical according to the electrophoretic mobility and molecular weight.
ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТА
АФАСЦИЛ ПРОТИВ ТРЕМАТОДОЗОВ И НЕМАТОДОЗОВ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА ЖВАЧНЫХ
Березкина С.В. *, Шемякова С.А. **
*ООО НПФ «Агроветсервис»
**ФГОУ ВПО МГАВМиБ
Введение. Оптимальное регулирование эпизоотического процесса, парциальная девастация при трематодозах животных, основываются на плановых профилактических дегельминтизациях. В последние 15 лет отсутствие на отечественном рынке ветеринарных препаратов высоко эффектвных антигельминтиков способствовало активизации научнопроизводственной деятельности ряда российских фармакологических предприятий, НПО и др.
Так, ООО НПФ «Агроветсервис» синтезировала отечественный антигельминтный лекарственный препарат в форме раствора для инъекций, предназначенного для лечения и профилактики острого и хронического фасциолеза и нематодозов желудочно-кишечного тракта у крупного и мелкого рогатого скота.
Афасцил в качестве действующего вещества содержит 10% рафоксанида (3,5-дийод-З' хлор-4-{п-хлорфенокси}салициланилид) и
61
