CC BY
58
УДК 619:616-097:576.895.1
БЕЛКОВЫЙ СПЕКТР ТРЕХДНЕВНЫХ ЭКСКРЕТОРНОСЕКРЕТОРНЫХ ПРОДУКТОВ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ
ПРОТОСКОЛЕКСОВ Echinococcus granulosus и E. multilocularis
В.К. БЕРЕЖКО доктор биологических наук А.А. ТХАКАХОВА аспирант М.Р. САСИКОВА кандидат биологических наук
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии
им. К.И. Скрябина,
117218, Москва, Б. Черемушкинская, 28, тел. (499)124-56-55, e-mail: vigis@ncport. ru
Приведены результаты исследований белкового спектра трехдневных метаболитов, культивируемых в искусственной питательной среде RPMI-1640, протос-колексов Echinococcus granulosus и E. multilocularis методом денатурирующего диск-электрофореза в полиакриламидном геле с SDS. В исследуемых биоматериалах определено соответственно 18 и 16 белковых компонентов, отличающихся по электрофоретической подвижности, степени проявления и молекулярной массе. Наиболее четко выраженные компоненты экскреторно-секреторных продуктов протосколексов E. granulosus и E. multilocularis проявлялись на электро-фореграмме в области подвижности белков молекулярной массы 200 и 66-45 кДа.
Ключевые слова: Echinococcus granulosus, Echinococcus multilocularis, протосколексы, метаболиты, электрофорез в полиакриламидном геле, белковый спектр.
Источником антигенов эхинококков могут быть как жидкость паразитарных цист, так и ткани самих паразитов и их личиночных стадий. Полученные из разных морфологических структур эхинококков антигены, как правило, имеют значительное сходство, поскольку в их спектре содержатся одни и те же компоненты в разных сочетаниях и количествах, большинство из которых могут иметь диагностическое значение. В практическом плане наиболее доступным и безопасным источником антигенного материала является мембрана эхинококковой цисты и протосколексы, диагностическую эффективность которых при эхинококкозах отмечали многие исследователи [3, 7, 8, 10,
15, 16, 18-20].
Реакцией иммунофлуоресценции установлено, что основная масса паразитарных антигенов эхинококков локализуется во внутренней выводковой зоне герминативной оболочки и протосколексах [1]. Причем, препараты из зародышевых сколексов содержали больше специфических белков и имели наибольшее диагностическое значение.
Антигены гельминтов независимо от источника их получения имеют многокомпонентный состав, включающий белки различной молекулярной массы, электрофоретической подвижности и специфичности.
Используя метод электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) можно охарактеризовать различные белковые препараты не только по числу входящих в их состав компонентов, но по степени и четкости проявления судить об их количественном содержании в исходном биоматериале.
Целью наших исследований было получить трехдневные метаболиты культивируемых протосколексов Echinococcus granulosus и E. multilocularis и провести их физико-химическую характеристику.
Материалы и методы
Источником получения трехдневных метаболитов эхинококков служили протосколексы E. granulosus, выделенные из цист паразита от естественно инвазированных овец, и протосколексы E. multilocularis, полученные из вторичных ларвоцист от крыс-доноров, предварительно зараженных E. multilocu-laris в дозе 750±50 протосколексов и ацефалоцист на животное. Отмытые протосколексы помещали в питательную среду RPMI-1640 с добавлением 2 мл глутанина, 8 мг гентамицина (4 %) и 0,5 мл амфотерицина В на 100 мл среды и 5%-ной эмбриональной сыворотки плода крупного рогатого скота. Жизнеспособность протосколексов в течение 3 сут поддерживали в СО2 инкубаторе с заданными параметрами температуры (37 оС), поступления газов (СО2 - 5 %) и влажности (70 %). Соблюдая правила работы с клеточными культурами, с целью сохранения стерильности проводили отбор экскреторносекреторных продуктов протосколексов обоих видов эхинококков в разные емкости автоматическими пипетками и исследовали методом электрофореза в ПААГ. Разделение полученных биоматериалов проводили денатурирующим диск-электрофорезом в вертикальной камере «Хеликон» (Россия) в стеклах 10^8 см по методу Laemmli [9] в градиенте концентрации полиакриламидного геля 10-15 % в присутствии додецилсульфата натрия.
Электрофорез проводили при силе тока 25 мА на один гель, разделение контролировали по выходу красителя (бромфенолового синего) из геля. По окончании электрофореза электрофореграммы окрашивали 1%-ным раствором амидочерного 10 В на 7%-ной уксусной кислоте в течение 15-20 мин и отмывали 7%-ной уксусной кислотой.
В качестве маркеров для определения молекулярной массы белковых компонентов в составе исследуемых биоматериалов использовали: апротинин (6500 Da); лизоцим (14400 Da); ингибитор трипсина (21500 Da); углекислую ангидразу (31000 Da); овальбумин (45000 Da); бычий сывороточный альбумин (66000 Da); фосфорилазу (97400 Da); Р-галактозидазу (116000 Da); миозин (200000 Da).
Результаты и обсуждение
В белковом спектре трехдневных метаболитов культивируемых протос-колексов E. granulosus (рис. 1) и E. multilocularis (рис. 2) регистрировали соответственно 18 и 16 компонентов, отличающихся по электрофоретической подвижности, степени окрашивания и молекулярной массе.
Белковые компоненты трехдневных экскретов и секретов протосколек-сов E. granulosus проявлялись на электрофореграмме в диапазоне белков молекулярной массы от 14,4 до 200,0 кДа. Наиболее четко выраженные и интенсивно окрашенные 5 компонентов располагались в области подвижности белков, имеющих молекулярную массу 200,0 кДа - 1; 116,0 кДа - 1; 66,0 кДа
- 2 и один компонент - в диапазоне белков молекулярной массы 45,0 и 66,0 кДа (табл.).
В области белков молекулярной массы 45,0 и 14,4 кДа проявились довольно хорошо выраженные, но диффузного характера полосы. Остальные компоненты приведены на электрофореграмме более слабо выраженными полосами в области белков молекулярной массы 116,0; 97,0; 31,0 и 21,5 кДа.
Аналогичный электрофоретический анализ трехдневных продуктов метаболизма протосколексов E. multilocularis позволил определить не менее 16 компонентов, проявившихся в диапазоне белков молекулярной массы 21,5200,0 кДа. Однако необходимо отметить, что в этом биоматериале мажорные компоненты располагались, в основном, в области белков молекулярной массы между 66,0 и 45,0 кДа.
Четкие различия между исследуемыми биоматериалами из E. granulosus и E. multilocularis отмечали в области подвижности белков молекулярной массы 200,0 кДа, а также в диапазоне белков молекулярной массы от 45,0 до 21,5 кДа. В этой области наиболее четко проявились белковые компоненты трехдневных продуктов метаболизма протосколексов E. multilocularis. В то же время на этой электрофореграмме не регистрировали компонент в области подвижности белков молекулярной массы 14,4 кДа, который довольно четко проявился в биоматериале из E. granulosus.
Анализ трехдневных экскреторно-секреторных продуктов протосколексов обоих видов эхинококков электрофорезом в ПААГ достаточно убедительно показал, что все они являются продуктами белковой природы, большинство из которых сопоставимы по электрофоретической подвижности и молекулярной массе.
Однако при детальном анализе были установлены некоторые различия в молекулярной массе и электрофоретической подвижности наиболее четко выраженных и интенсивно окрашенных белковых компонентов. В биоматериале из E. granulosus регистрировали 5 таких компонентов, которые располагались в области подвижности белков молекулярной массы 200,0; 116,0; 66,0 и 45,0 кДа, в то время как в аналогичных биопродуктах протосколексов E. multilocularis мажорные компоненты проявлялись в диапазоне белков молекулярной массы 66,0-45,0 кДа.
Белковый спектр трехдневных экскреторно-секреторных продуктов протосколексов E. multilocularis и E. granulosus
Исследуемый биоматериал Результаты исследований в ПААГ
выявлено белковый компонен- тов молекулярная масса белковый компонентов, кДа
14,4- 21,5 21,5- 31,0 31,0- 45,0 45,0- бб,0 бб,0- 97,0 11б,0- 200,0
Трехдневные экскреторно-секреторные продукты про-тосколексов E.multilocularis 1б - 3 б 3 2 2
Трехдневные экскреторносекреторные продукты про-тосколексов E. granulosus 18 2 2 4 4 2 4
Полученные данные в основном согласуются с исследованиями других авторов, хотя имеются и определенные различия в числе выявляемых белковых компонентов, которые, на наш взгляд, могут быть причиной разного подхода в получении и электрофоретическом разделении исследуемых биоматериалов.
Так, выделенный из цистной жидкости E. granulosus АГ 4 при электрофоретическом анализе в ПААГ с SDS проявился на фореграмме одной поло-
s5
сой в зоне белков молекулярной массы 67 кДа, а AГ 5 - тремя полосами в области подвижности белков молекулярной массы 20 и 10,5 кДа [11-13].
По результатам другиx авторов, аналогичный анализ AГ 5 цистной жидкости E. granulosus выявил одну полосу на уровне белков молекулярной массы 69 кДа [4, 5)].
В экскретаx и секретаx герминативные клеток цист E. granulosus электрофоретическим исследованием зарегистрировано два компонента молекулярной массы 52 и 38 кДа, причем наибольшую специфичность в иммуноло-гическиx реакцияx проявил компонент молекулярной массы 52 кДа [б].
По мнению другиx исследователей специфическими антигенами E. granulosus являются белковые компоненты молекулярной массы 38 кДа [22], 20 кДа [2], 37 кДа [14].
Несколько различается также белковый спектр экстрактов из протоско-лексов и тканей метацестод E. multilocularis, в которые электрофоретическим анализом регистрировали белковые фракции молекулярной массы 44, 35, 27,
21, 17,5 и 16,5 кДа. Эти белки распознавались антителами класса IgG, IgG1 и IgG4. Белковые компоненты молекулярной массы 44 и 35 кДа регистрировали как в белковом спектре экстракта из протосколексов, так и тканевые экстрак-таx из метацестод. Эти белковые компоненты давали более 30 % перекрестные реакций с сыворотками больные цистной формой эxинококкоза и цисти-церкоза (C. cellulosae).
Наиболее специфичными были антигены протосколексов молекулярной массы 27; 21 и 17,5 кДа, которые с сыворотками больные альвеолярной формой эxинококкоза реагировали соответственно в 73, 88 и 93 %. Причем наибольшую специфичность при альвеолярном эxинококкозе проявил белковый компонент молекулярной массы 17,5 кДа [17, 1s].
А Б
Рис. 1. Белковый спектр треxдневныx метаболитов культивируемыи протосколексов
E. granulosus (А) и E. multilocularis (Б)
Несмотря на установленные некоторые различия в белковом спектре метаболитов культивируемые протосколексов обож видов эxинококков коли-
чественного и качественного характера, входящие в их состав белковые компоненты оказались диагностически активными антигенами и выявляли антитела как в сыворотках больных цистной и альвеолярной формой эхинококко-за, так и в сыворотках естественно инвазированных животных.
Литература
1. Адельшин Ф.К., Адельшина Г.А., Тихонов Н.Г. и др. Диагностические свойства антигенных компонентов ларвоцист альвеококка и их экспериментальная оценка в микрогранулированной тест-системе с магнитными сорбентами в РИФ // Матер. докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М., 1999. - С. 4-6.
2. Al-Yaman F.M., Knobloch J. Isolation and partial characterization of species-specific and cross-reactive antigenc of Echinococcus granulosus cyst fluid // Mol. and Biochem Parasitol. - 1989. - V. 37, № 1. - Р. 101-107.
3. Auer L., Aspock H. Studies on antigens from in vitro cultivated protoscolic-es of Ecinococcus multilocularis and their possible use in the serodiagnosis of human echinococcosis // 2-nd Int.Symp. Taeniasis/Cysticercosis and Hydatidosis/ Echinococcosis., Ceske Budejovice. - 2-7dec. - 1985, Praga, Ceske Budejovice. -1986. - P. 7-15.
4. Dottorini S., Tassi C. Echinococcus granulosus: characterisation of the main antigenic component (Arc 5) of hydatid fluid // Exp. Parasitol. - 1977. - V. 43, № 2. - P.307-314.
5. Dottorini S., Tassi C. Echinococcus granulosus: comparison between antigens in scolices and hydatid fluid // Int. J. Parasitol. - 1978. - V. 8. - P. 259-265.
6. Feng J.J., Wang J.Y., Qu J.A. et al. ELIB of specific antigens in vitro cultivated cultivated germinal cells of Echinococcus granulosus // Chin. J. Parasitol. and Parasit. Diseases. - 1993. - V. 11, №1. - P. 63-65.
7. Irabuena O., Nieto A., Ferreira A. M. et al. Characterization and optimization of bovine Echinococcus granulosus cyst fluid to be used in immunodiagnosis of hydatid disease by ELISA // Rev. Inst. Med. Trop. San Paulo. - 2000. - V. 42, № 5. - Р. 255-262.
8. Kagan I., Agosin M. Echinococcus Antigens // Bull. WHO. - 1968. - V. 39, № 1. - Р. 13-24.
9. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T 4. // Nature. - 1970. - V. 16, № 1. - P. 7-13.
10. Oriol R., Williams J.F., Perez Esandi M.V. et al. Purification of lipoprotein antigens of Echinococcus granulosus from sheep hydatid fluid // Amer. J. Trop. Med. and Hyg. - 1971. - V. 20. - P. 569-574.
11. Pozzuoli R., Musiani P., Arm E. et al. Echinococcus granulosus: Isolation and characterization of sheep hydatid fluid antigens // Exp. Parasitol. - 1972. - V. 32. - P. 45-55.
12. Pozzuoli R., Musiani P., Arm E. et al. Echinococcus granulosus: evaluation of purified antigens' immunoreactivity // Exp.Parasitol. - 1974. - V. 35. - P. 52-60.
13. Pozzuoli R., Piantelli M., Perucci C. et al. Isolation of the most immuno-reactive antigens of Echinococcus granulosus from sheep hydatid fluid // J. Immunol. - 1975. - V. 115. - P. 1459-1463.
14. Queralt R., Madico A. Mercader M. et al. Purification de antigenos parasi-tarios a partir de liquid hydatidico. Estudio de su reactividad por «immunoblot» // Rev. iber. parasitol. - 1989. - V. 49, № 4. - P. 313-319.
15. Rafiei A., Craig P.S. The immunodiagnostic potential of protoscolex antigens in human cystic echinococcosis and the possible influence of parasitic strain // Ann. Trop. Med and Parasitol. - 2002. - V. 96, № 4. - P. 383-389.
16. Su D.M., Cao H.X., Wen B.I. Immunochemical analysis of hydatid fluid from different sources as diagnostic antigen in human hydatidosis // Chinese Journal of Parasitic Diseasen Control. - 1988. - V. 1, № 1. - P. 29-31.
17. Wen H., Craig P.S., Ito A. et al. Immunoblot evaluation of IgG and IgG-subclass antibody responses for immunodiagnosis of human alveolar echinococcosis // Ann. Trop. Med and Parasitol. - 1995. - V. 89, № 5. - P. 485-495.
18. Wen H., Craig P.S., Vuitton D.A. et al. IgG subclass antibody responses in human cystic and alveolar echinococcosis, and application for serologic follow-up of alveolar echinococcosis patients after surgical treatment and chemeotherapy // 17th Int. Congr. Hydatidol., 6-10 nov. 1995(b). Limassol-Cyprus, Abstracts. -1995. - P. 184.
19. Yarzabal L.A., Dipas H., Bout D.T. et al. Echinococcus granulosus: distribution of hydatid fluid antigens in tissues of the larval stage. I Localization of the specific antigen of hydatid fluid (antigen 5) // Exp. Parasitol. - 1976. - V. 40, № 3.
- P.391-396.
20. Yarzabal L.A., Bout D.T., Naguira F.R. et al. Further observation on the specificity of antigen 5 of Echinococcus granulosus // J. Parasitol. - 1977. - V. 63, № 3. - P. 495-499.
21. Yarzabal L.A., Dipas H., Bout D.T. et al. Echinococcus granulosus: the distribution of hydatid fluid antigens in the Tissues of the larval stage. II Localization of the thermostable lipoprotein of parasitic origin (antigen B) // Exp. Parasitology. - 1977. - V. 42, № 1. - P. 115-120.
22. Zhang L.H., Mc Manus D.P. Purification and N-Terminal amino acid sequencing of Echinococcus granulosus antigen 5 // Parasite Immunology. - 1996. -V. 18, № 12. - P. 597-606.
Albuminous spectrum of three-day excretory-secretory products of cultivated
Echinococcus granulosus and E. multilocularis protoscolexes
V.K. Berezhko, A.A. Thakahova, M.R. Sasikova
Results of researches of albuminous spectrum of three-day metabolites cultivated in artificial nutrient medium RPMI-1640, Echinococcus granulosus and E. multilocularis protoscolexes by the method denaturing disk-electroforesis in polya-crylamid gel with SDS are given. In researched biomaterials it is determined respectively 18 and 16 albuminous components distinguished on electroforetic mobility, degree of display and molecular weight. The most well defined components of excretory-secretory products of E. granulosus and E. multilocularis protoscolex-es were shown on electroforegramme in the field of mobility of protein of molecular weight 200 and 66-45 KDa.
Keywords: Echinococcus granulosus, E. multilocularis, protoscolexes, metabolites, electroforesis in polyacrylamid gel, albuminous spectrum.
