CC BY
51
УДК 619:616.995.1-07
ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТАБОЛИТОВ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ПРОТОСКОЛЕКСОВ ЕСНШОСОССШ МиЬТ1ШСиЬАМ8 В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ТИПА КЛЕТОК В КУЛЬТУРЕ
В.К. БЕРЕЖКО доктор ветеринарных наук И.Б. ДАЛАЕВА, М.Р. САСИКОВА аспиранты
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии
им. К. И. Скрябина
Представлены результаты исследований сравнительной диагностической эффективности в ИФР трех серий (А-1; В-2 и С-3) клеточных метаболитов протосколексов Echinococcus muШlocularis в зависимости от типов и количественного соотношения клеток в культуре. В клеточной культуре определено 4 типа клеток, различающихся по форме, величине и окраске. Наилучшие показатели чувствительности и специфичности ИФР регистрировали с антигенноактивной серией А-1, полученной от клеточной культуры, содержащей не менее 5559% клеток 4-го типа.
Культуры клеток стали неотъемлемой частью биотехнологии и с успехом используются для решения научных проблем в различных областях. Всемирная организация здравоохранения придает большое значение разработке более совершенных методов культивирования возбудителей зоонозов, к числу которых относятся и эхи-нококкозы, с целью изучения особенностей развития и роста in vitro, диагностики, использования их в качестве рациональных моделей для испытания новых средств, а также для получения специфических антигенов. При эхино-коккозах наиболее приемлемым в антигенном отношении и безопасным
источником для получения первичной клеточной культуры является протосколекс.
Однако протосколекс - это сложный биологический объект, состоящий из клеток различного типа и назначения, что безусловно будет влиять как на процесс их культивирования, так и на активность получаемых при этом клеточных метаболитов.
Целью настоящей работы была оценка диагностической эффективности клеточных метаболитов протосколексов E. muШlocularis в зависимости от типа клеток в культуре и их количественного содержания.
Материалы и методы
Материалом исследования служили клеточные культуры и метаболиты культивируемых клеток протос-колексов E. multilocularis, выделенных из вторичных ларвоцист паразита от предварительно зараженных этим инвазионным материалом крыс в дозе 68 тыс. экземпляров/животное. Работа по выделению протосколексов, их отмывке, приготовлению клеточной культуры проводилась в стерильных условиях. Культивирование клеток осуществляли в СО2-инкубаторе с заданными параметрами температуры (37°С) и поступлении газов (СО2 - 5%) при влажности 70%.
В отобранных через каждые 7-10 дней культивирования клеточных метаболитах протосколексов устанавливали наличие антигенов паразита ИФР с использованием положительных и отрицательных контрольных сывороток (2). Одновременно, клетки в культуре исследовали на мазках после фиксации и окрашивания с целью их морфологической характеристики, определения типов клеток и их количественного соотношения (3).
Антигеноактивные серии клеточных метаболитов распределяли по степени активности в зависимости от показателей оптической плотности в ИФР с контрольными сыворотками и оценивали их диагностическую эффективность с 73 пробами сывороток людей, в том числе 25 - от пациентов с подтвержденным диагнозом цистной и 3 -альвеолярной формы эхинококко-за, 3 - трихинеллеза, 7 - токсокароза «larva migrans» и 35 - клинически здоровых, а также с 90 пробами сывороток свиней, включая 42 с подтвержденным при вскрытии диагнозом ци-
стного эхинококкоза и 48 - инвази-рованных другими гельминтами и клинически здоровых. ИФР осуществляли по методике Voller et al. (9) с модификациями применительно к нашим условиям, предварительно установив оптимальное разведение исследуемых метаболитов и титр видоспецифических конъюгатов.
Результаты и обсуждение
В результате культивирования клеток протосколексов E. multilocula-ris было получено 27 серий клеточных метаболитов, в 23 (85,2%) из них была установлена антигенная активность. На основании показателей оптической плотности (ОП) в ИФР с контрольными положительными и отрицательными сыворотками антигеноактивные клеточные метаболиты были распределены на 3 серии: А-1 (наиболее активная, ОП в ИФР 1,2361,320 и 0,182-0,191); В-2 (средней активности, ОП 0,768-0,804 и 0,1980,201); С-3 (слабой антигенной активности, ОП 0,350-0,362 и 0,219-
0,225). Цитологическим анализом ранее в культуре клеток протосколек-сов было определено 4 типа клеток, различающихся по размерам, форме и окраске ядра (3). Аналогичный анализ, проведенный в культурах с неодинаковой антигенной активностью клеточных метаболитов, показал в них различия в процентном соотношении типов клеток. Так, наиболее активная в антигеном отношении серия А-1 независимо от времени культивирования содержала в культуре больше клеток 4 типа (55-59%). Процентное соотношение клеток этого типа в двух других сериях В-2 и С-3 со средней и низкой активностью ан-
тигенов было 45-48 и 35-38, соответственно (табл. 3).
Что касается клеток других типов, то их соотношение в процессе культивирования изменялось в меньшей степени. Так, процентное соотношение клеток 1 типа варьировало в пределах 27-30 (серия А-1); 32-35 (се-
рия В-2) и 31-34 (серия С-3); 2-го типа-12-14; 19-21 и 17-24 соответственно. Диагностическая эффективность серий клеточных метаболитов (А-1; В-2 и С-3) была оценена в ИФР с сыворотками людей и свиней (таб. 1-2) и полученные данные были сопоставлены с типом клеток в культуре.
Таблица 1
Диагностическая эффективность ИФР* с клеточными метаболитами различной степени антигенной активности при эхинококкозах (гидати-
№ п/п Группы людей, пробы сывороток Кол- во проб Серии клеточных метаболитов протосколексов E. multilocularis
результаты ИФР
серия А-1 серия В-2 серия С-3
+ — Ч,% С,% + — Ч,% С,% + — Ч,% С,%
1 Эхинококкоз цистный 25 22 3 88,0 86,7 19 6 76,0 77,8 14 11 56,0 57,8
2 Эхинококкоз альвеолярный 3 3 — 100 2 1 66,7 1 2 33,3
3 Трихинеллез 3 1 2 1 2 1 2
4 Токсокароз «Larva migrans» 7 1 6 2 5 4 3
5 Клинически здоровые доноры 35 4 31 7 28 14 21
Итого: 73 31 39 31 42 34 39
Примечание: ИФР - иммуноферментная реакция, «+» - положительный; «-» - отрицательный результаты; «Ч» - чувствительность; «С» - специфичность.
Таблица 2
Диагностическая эффективность ИФР* с клеточными метаболитами различной степени антигенной активности при цистном эхинококкозе
свиней
№ п/п Пробы сывороток свиней Кол- во проб Серии клеточных метаболитов протосколексов E. multilocularis
результаты ИФР
серия А-1 серия В-2 серия С-3
+ — Ч,% С,% + — Ч,% С,% + — Ч,% С,%
1 Эхинококкоз цистный 42 32 9 76,2 70,8 28 14 66,6 62,5 22 20 52,4 47,9
2 Инвазии другими гельминтами и клинически здоровые животные 48 14 34 18 30 25 23
Итого: 90
Примечание: ИФР - иммуноферментная реакция, «+» - положительный результат; «-» - отрицательный результат; «Ч» - чувствительность; «С» - специфичность.
Таблица 3
Результаты ИФР и процентное соотношение типов клеток в клеточных
метаболитах различной степени антигенной активности
№ п/п Серии клеточных метаболитов Показатели ИФР* Типы клеток в культуре, %
с сыворотками людей с сыворотками свиней
1 2 3 4
Ч, % С, % Ч, % С, %
1 А-1 (наиболее активная) 88,0 86,7 76,2 70,8 27-30 12-14 6-8 55-59
2 В-2 (средней антигенной активности) 76,0 77,8 66,6 62,5 32-35 19-21 8-11 45-48
3 С-3 (слабой антигенной активности) 56,0 57,8 52,4 47,9 31-34 17-24 5-7 35-38
Примечание: ИФР - иммуноферментная реакция; «Ч» - чувствительность; «С» - специфичность.
Результаты исследований показали, что чувствительность и специфичность иммунотеста была выше с антигенами клеточных метаболитов серии А-1 независимо от вида сывороток, с двумя другими сериями В-2 и С-3, отличающимися меньшей активностью антигенов, показатели реакции были ниже (табл.3).
Так, с сыворотками людей чувствительность ИФР с сериями А-1, В-2 и С-3 была 88,0, 76,0 и 56,0%, а специфичность - 86,7; 77,8 и 57,8%, с сыворотками свиней - 76,2, 66,6 и 52,4% и 70,8, 62,5 и 47,9%, соответственно.
При сопоставлении результатов ИФР в испытанных сериях клеточных метаболитов с типами клеток в культуре установили, что антигенная активность, в основном, зависела от
количественного содержания в них клеток 4-го типа, многогранной формы с цитоплазматическими отростками, образующими синтици-альные связи.
По данным Feng et al. (4, 5) специфическая антигенная активность была установлена ИФР и НРИФ на поверхности культивируемых зародышевых клеток E. granulosus и в питательной среде, где они росли и размножались. Рост клеток герминативного слоя и протосколексов E. granulosus в модифицированной среде ДМЕМ с последующим определением специфического антигена в экскреторно-секреторных продуктах клеточной линии из личинок паразита отмечали (7, 8). Ранее о присутствии в метаболитах клеточных культур метацестоды Taenia crassi-
ceps специфических антигенов сообщали Бережко, Бессонов (1). Имеются также данные о получении клеточной линии из тканей альвеолярного эхинококка, где авторы при первых пассажах наблюдали в культуре веретеновидные, а в дальнейшем - полигональные, звездовидные клетки. При введении этих клеток хлопковым крысам у них развивались цисты с протосколексами, что
свидетельствует об их герминативной природе (6).
Результаты наших исследований показали, что антигенная активность клеточных метаболитов протосколексов Е. ти1Шоси1апв находится до определенного времени (срок наблюдений - 3 мес.) в прямой зависимости от количества в культуре клеток 4-го типа.
Литература
1. Бережко В.К., Бессонов А.С. // Тр. Всерос. ин-та гельминтол. - 1996. -Т. 32. - С. 18-22.
2. Бережко В.К., Сивкова Т.Н. // Тез. научн. конф. «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». - М., 2000. - С. 21-22.
3. Далаева И.Б. // Матер. докл. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - 2006. - Вып. 7. - С. 127-130.
4. Feng J., Xiao S.-H., Shen B.G., Xue H.-C. // Chin. J. Parasitol. and Para-sit. Diseases. - 1992. - V.10, № 2. - P. 86-89.
5. Feng J., Wang J.Y., Qu J.A., Xiao S.H. // Chin. J. Parasitol. and Parasit. Diseases. - 1993. - V. 11, № 1. - P. 63-65.
6. Furuya K., Honnra H., Kumagai M. // Bull. Soc. Parasitol. - 1990. - V. 8, N 1. - P. 159.
7. Lu J.H., Li D.Ch., Guo Z. et al. // Chin. J. Vet. Sci. - 1999. - V. 19, № 6. -P. 566-568.
8. Lu J.H., Guo Z.M., Yu X.B. et al.// Acad. J. Sun Yat - Sen. Univ. Med. Sci. - 2001. - V. 22, № 2. - P. 81-84.
9. Voller A., Bidwell D., Huldt G., Engvall E. // Bull. Wld. Hlth. Org. -1974. - V. 1, № 2. - P. 209-211.
Diagnostic efficiency of metabolites from Echinococcus multilocularis
protoscolexes cultivated cells depending on type of cells in culture
V.K. Berezhko, I.B. Dalaeva, M.R. Sasikova
Results of researches of comparative diagnostic efficiency in IFR three series (А-1, В-2 and С-3) cellular metabolites of Echinococcus multilocularis protoscolexes depending on types and a quantitative ratio of cells in culture are submitted. It is determined 4 types of the cells in cellular culture differing under the form, size and coloring. The best parameters of sensitivity and specificity of IFR registered with antigen active series А-1 received from cellular culture containing 5559% of 4-th type cells.
