СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ А2 В KOMAGATAELLA PHAFFII В ЗАВИСИМОСТИ ОТ МОДИФИКАЦИИ СИГНАЛЬНОГО ПЕПТИДА АЛЬФА-ФАКТОРА

Бытяк Д.С.; Гладченко Ю.А.; Ряполова А.В.; Корнеева О.С.; Мотина Е.А.

ВестнщФТУМт:/Proceedings of VSUET ISSN 2226-910X E-ISSN 2310-1202

DOI: http://doi.org/1Q.2Q914/231Q-1202-2Q21-1-263-269_Оригинальная статья/Research article

УДК 577.21_Open Access Available online at vestnik-vsuet.ru

Сравнительная экспрессия рекомбинантной фосфолипазы А2 в Komagataellaphaffii в зависимости от модификации сигнального _пептида альфа-фактора_

Денис С. Бытяк 1

Юрий А. Гладченко 2 Анастасия В. Ряполова 1 Ольга С. Корнеева 1 Екатерина А. Мотина 1

bytyak.denis@mail.ru dngfv5@gmail .com anac 142009@yandex.ru korneeva-olgas@yandex.ru emotina18@mail .ru

0000-0002-4281-2758 0000-0002-5895-9463 0000-0002-7784-9892 0000-0002-2863-0771 0000-0002-3433-2754

1 Воронежский государственный университет инженерных технологий, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, Россия

2 ООО Инновационный Центр «Бирюч - новые технологии»

Аннотация. В настоящее время Российский рынок ферментных препаратов фосфолипазы А2 представлен коммерческими препаратами иностранных производителей: Nagase (Япония) и Махара1 (Нидерланды). Однако растущий спрос и необходимость снижения себестоимости производства фосфолипазы А2 требуют разработки новых суперпродуцентов фосфолипазы А2. В связи с чем целью работы является сравнительная экспрессия рекомбинантной фосфолипазы А2 в Komagataella phaffii в зависимости от модификации сигнального пептида альфа-фактора. Объектом исследования является дрожжевой штамм-реципиент Komagataella phaffi Х-33. Исследования проводились в соответствии с общепринятыми нормами и подходами. Для работы использованы гены фосфолипазы А2 из Streptomyces уюШсеогиЬег. Целевые последовательности синтезированы в компании «Евроген» (Россия) и заклонированы в составе ТЕ-вектора риС57. В ходе выполнения работы проведена сборка генетических конструкций pPICZaA-Pla2 и PPICZmf4iA-Pla2, содержащих ген фосфолипазы А2 Streptomyces уюШсеогиЬег под нативным сигналом a-MF и его модификацией mf4i. Также проведена трансформация дрожжей KomagataeUaphaffiХ-33 полученными генетическими конструкциями. В результате проведенных исследований показано, что в среднем достоверных отличий в уровне экспрессии и удельной активности рекомбинантной фосфолипазы А2 метилотрофными дрожжами K. Phaffii X-33 при использовании нативного сигнала секреции a-MF и его модифицированного варианта mf4i не обнаружено. Однако использование фактора секреции mf4i позволяет получить более высокую продукцию фосфолипазы А2 у отдельных клонов (трансформантов). Полученные данные указывают на перспективность использования фактора секреции mf4i для создания сверхпродуцентов ферментов на основе дрожжей K. Phaffi X-33. Ключевые слова: Komagataella phaffii, фосфолипаза А2, Streptomyces ую1асеотЬег, генная инженерия, биотехнология ферментов, экспрессия, АОХ промотор, сигнальный пептид

Comparative expression of recombinant phospholipase A2 in Komagataella phaffii depending on the modification of the alpha_factor signaling peptide_

Denis S. Bytyak 1

Yuri A. Gladchenko 2 Anastasia V. Ryapolova 1 Olga S. Korneeva 1 Ekaterina A. Motina 1

bytyak.denis@mail.ru dngfv5@gmail .com anac 142009@yandex.ru korneeva-olgas@yandex.ru emotina18@mail.ru

0000-0002-4281-2758 0000-0002-5895-9463 0000-0002-7784-9892 0000-0002-2863-0771 0000-0002-3433-2754

1 Voronezh State University of Engineering Technologies, Revolution Av., 19 Voronezh, 394036, Russia

2 Innovation Center Biryuch-New Technologies

Abstract. Currently, the Russian market of phospholipase A2 enzyme preparations is represented by commercial preparations of foreign manufacturers: Nagase (Japan) and Maxapal (the Netherlands). However, the growing demand and the need to reduce the cost of production of phospholipase A2 require the development of new super-producers of phospholipase A2. In this connection, the aim of the work is to compare the expression of recombinant phospholipase A2 in Komagataella phaffii depending on the modification of the alpha-factor signaling peptide. The object of the study is the recipient yeast strain Komagataella phaffii X-33. The studies were conducted in accordance with generally accepted norms and approaches. Phospholipase A2 genes from Streptomyces violaceoruber were used for this worK. The target sequences were synthesized in the company "Eurogen" (Russia) and cloned as part of the TE vector pUC57. In the course of the work, the genetic constructs pPICZaA-Pla2 and PPICZmf4iA-Pla2 containing the Streptomyces violaceoruber phospholipase A2 gene were assembled under the native signal a-MF and its modification mf4i. The transformation of the yeast Komagataella phaffii X-33 with the obtained genetic constructs was also carried out. As a result of the conducted studies, it was shown that on average, there were no significant differences in the level of expression and specific activity of recombinant phospholipase A2 in methylotrophic yeast K. Phaffii X-33 when using the native a-MF secretion signal and its modified version mf4i. However, the use of the secretion factor mf4i allows for higher production of phospholipase A2 in individual clones. The obtained data indicate the prospects of using the secretion factor mf4i to create super-producers of enzymes based on yeast K. Phaffii X-33.

Keywords: Komagataella phaffii, phospholipase A2, Streptomyces violaceoruber, genetic engineering, enzyme biotechnology, expression, AOX promoter, signal peptide

Для цитирования For citation

Бытяк Д.С., Гладченко Ю.А., Ряполова А.В., Корнеева О.С., Мотина Е.А. Bytyak D.S., Gladchenko Yu.A., Ryapolova A.V., Korneeva O.S., Motina E.A. Сравнительная экспрессия рекомбинантной фосфолипазы А2 в Comparative expression of recombinant phospholipase A2 in Komagataella Komagataella phaffii в зависимости от модификации сигнального phaffii depending on the modification of the alpha-factor signaling peptide. Vestnik пептида альфа-фактора // Вестник ВГУИТ. 2021. Т. 83. № 1. С. 263-269. VGUIT [Proceedings of VSUET]. 2021. vol. 83. no. 1. pp. 263-269. (in Russian).

doi:10.20914/2310-1202-2021-1-263-269_doi:10.20914/2310-1202-2021-1-263-269_

Введение

Фосфолипазы А2 (PLA2) - одни из самых изученных фосфолипаз, представляют собой липолитические ферменты, катализирующие гидролиз ацильной связи sn-2 в молекуле гид-рофосфолипида, что ведет к освобождению свободных жирных кислот и лизофосфолипидов [1]. В ряде работ у PLA2 доказаны антибактериальные [2], противовирусные [3-5], противопара-зитарные [6, 7], антитромбоцитарные [8], гипотензивные [8], противоопухолевые свойства [9]. Кроме того, PLA2 применяются в одном из важнейших этапов рафинирования масла - его гидратации [10]. Особое место PLA2 занимает в промышленном производстве майонеза при ферментативном гидролизе яичного лецитина до изолецитина. Это обеспечивает более высокую стойкость эмульсии и требуемые реологические характеристики майонеза [11, 12]. В настоящее время на рынке России представлено несколько коммерческих ферментных препаратов рекомби-нантной ФЛА2: «Nagase» (Япония), нативный штамм-продуцент Streptomyces violaceoruber; «Maxapal» (Нидерланды), ФЛА2 поджелудочной железы свиней, штамм-продуцент Aspergillus niger. Однако растущие потребности рынка в производстве продуктов питания требуют разработки новых суперпродуцентов PLA2.

Одним из наиболее перспективных продуцентов PLA2 считается представитель метило-трофных дрожжей Komagataella phaffii (ранее Pichia pastoris). Вид характеризуется высокой скоростью роста, способностью к оптимальному гликозилированию рекомбинантных белков, наличием механизмов эффективной секреции продуцируемых ферментов в культуральную среду, низкой секрецией протеаз и других собственных белков в культуральную среду, наличием регулируемого AOX-промотора [13, 14].

Ранее Liu et. el. был получен штамм-продуцент рекомбинантной PLA2 на основе K. phaffii GS115 с продукцией PLA2 из St. Violaceoruber на уровне 34,7 ± 0,2 ед./мл [15], что выше, чем у прокариотических штаммов-продуцентов PLA2 St. violaceoruber (0,5 ед./мл) и Escherichia coli (0,2 ед./мл) [16], однако все же не является достаточным для рентабельного промышленного производства.

Существует целый ряд факторов, определяющих эффективность экспрессии гетероло-гичных белков, в частности, оптимизация нуклеотидной последовательности целевого гена и повышение его копийности в геноме, оптимизация промотора, выбор сигнального пептида для секретируемых белков [17]. Для секреции гетерологичных белков в K. phaffii наиболее эффективен пре-про-пептид а-фактора (a-MF).

В настоящее время a-MF является наиболее широко распространенным сигнальным пептидом для секреции рекомбинантных белков и именно с ним удаётся добиться высокой экспрессии. Для улучшения вывода белка в настоящее время используют также разные модификации a-MF, полученные в результате направленной эволюции аминокислотного состава, мутаций, объединения с другими лидерными белками и т. д. Одним из перспективных вариантов a-MF может быть синтетический mf4i, с которым удалось повысить экспрессию рекомбинантной фитазы более чем в 3 раза относительно натив-ного альфа-фактора.

Цель работы - сравнение экспрессии PLA2 в Komagataella phaffii X-33 при использовании нативного a-MF и модифицированного синтетического сигнального пептида a-MF mf4i.

Материалы и методы

Для работы использованы гены фосфоли-пазы А2 (Р1а2) из Streptomyces violaceoruber (патент на изобретение RU 26763210), и модифицированного сигнала a - MF mf4i (GeneBank, No AY145833.1). Ген Р1а2 оптимизирован для эффективной экспрессии в K. phaffii в соответствии с частотой встречаемости кодонов [18].

Последовательность гена фосфолипазы А2, в соответствии с патентом на изобретение RU 26763210:

GATCCAGCAGATAAACCTCAAGTTTT GGCATCATTCACCCAGACATCCGCATCAT CCCAGAACGCATGGTTGGCCGCTAACAGA AACCAATCTGCTTGGGCTGCTTACGAATTT GATTGGTCTACTGATTTGTGTACTCAAGCT CCAGATAACCCTTTTGGTTTCCCATTCAAC ACTGCTTGTGCTAGACATGATTTCGGTTAC AGAAACTATAAGGCTGCTGGTTCTTTTGAT GCTAACAAGTCCAGAATTGATTCTGCTTTC TATGAGGATATGAAGAGAGTCTGCACTGG TTATACCGGAGAGAAGAACACTGCCTGTA ATTCCACTGCCTGGACCTACTATCAAGCCG

Целевые последовательности синтезированы в компании «Евроген» (Россия) и заклонированы в составе ТЕ-вектора риС57.

Далее рестрикционно-лигазным методом проводили вставку гена Р1а2 в состав векторов экспрессии рР1С2а^аА и рР1С2А (Invitrogen, USA). Для этого с плазмиды риС57-Р1а2 амплифицировали фрагмент ДНК, соответствующий гену Р1а2, праймерами Р1а2 for 5' -ATATGAATTCGCTCCAGCAGATAAACC-3' и Р1а2 rev 5' - ATATGTCGACTCAACCAAA AATC I T T ACG-3' на амплификаторе Т100 (BioRad, USA) с помощью полимеразы Phusion (NEB, England). Полученный фрагмент длиной 366 п.о. клонировали в состав векторов рР1С2аА и

pPICZA по сайтам EcoRI и NotI. Продуктами лигирования трансформировали химически компетентные клетки Escherichia coli Xl10Gold (Stratagen, USA). Корректность нуклеотидной последовательности гена Р1а2 в составе полученных конструкций рРIСZаlрhаА-Рlа2 и рРIСZА-Рlа2 выросших на селективных средах с зеоцином (25 мкг/мл) была подтверждена картированием и секвенированием ДНК в компании Евроген (Россия).

Для сборки конструкции рРIСZmf4iА-рlа2 TA-вектор, содержащий часть гена mf4i, и полученную конструкцию рРIСZА-Рlа2, обрабатывали эндонуклеазами рестрикции BstBI и XtoI (СибЭнзим, Россия). Очистку целевых фрагментов ДНК проводили в 1% агарозном геле с последующей элюцией набором CleanUp Mini (Евроген, Россия) и лигированием с использованием Т4 ДНК-лигазы (СибЭнзим, Россия). Продуктами лигирования трансформированы химически компетентные клетки E. coli Xl10Gold (Stratagen). Корректность нуклеотидной последовательности гена mf4i в составе полученной плазмиды рРIСZmf4iА-Рlа2 подтверждали се-квенированием.

Генетическая трансформация K. phaffii. Далее собранные генетические конструкции рРIСZаА-Рlа2 и рРIСZmf4iА-Рlа2 использовали для генетической трансформации штамма K. phaffii X-33 (Invitrogen, USA). На каждую трансформацию использовали по 10 мкг плазмид рРIСZаlрhаА-Р1а2 и рРIСZmf4iА-Рlа2, линеаризованных по сайту BstXI в области AOX-промотора. Трансформация линеаризованными плазмидами штамма K. phaffii X-33 осуществлялась согласно протоколу Invitrogen [19]. Отбор трансформантов проводился на среде YPD с зеоцином (250 мкг/мл). Экспрессионная кассета, интегрируемая в геном K. phaffii представлена на рисунке 1.

UC origin . ^^^

I АОХ1 pfw

/ \

Г-/ pPICZalphaA-Pla2

. ' 39«9 bp M ,

. ' 3919 bp [И

\ t

M *

» __- / M

noter

1 nrmnl» Vn/Ii девО

alpha-factor signal peptide

AOX1 transcription terminator

Рисунок 1. Карта вектора экспрессии pPICZalphaA-Pla2 Figure 1. Map of the pPICZalphaA-Pla2 expression vector

Экспрессия PLA2 в K phaffii X-33. Полученные в результате трансформации K. phaffii X-33 векторами pPICZalphaA-Pla2 и pPICZmf4iA-Pla2 клоны культивировали в колбах Эрленмейера объемом 100 мл, содержащих по 20 мл среде

YPGM. Культивирование осуществляли в орбитальном термошейкере (BioSan, Латвия) при + 30 °С, 250 об/мин. Каждые 24 часа в среду вносили 1% метанола от объема среды. После культивирования клетки осаждали центрифугированием при 4200 g в течение 5 мин. Супер-натант отбирали и использовали для анализа активности фосфолипазы А2. Всего проанализировано по 30 клонов K. phaffii с каждым типом сигнала секреции.

Анализ активности PLA2 проводился с использованием кислотно-щелочного метода титрования [15]. Активность PLA2 определялась как количество фермента, требуемое для высвобождения 1 мкг свободной жирной кислоты [20].

Далее образцы культуральной жидкости анализировали методом SDS-электрофореза в 15% ПААГ, а также качественным методом путем нативного электрофореза с последующей инкубацией пластин геля в агаризованном лецитине. по Леммли.

Для определения удельной активности рекомбинантной РLA2 и ферментного препарата «Nagase» проводили очистку фермента на препаративном хроматографе BUCHI на колонке Bio-Rad UNОsрhеrе Q (5 мл). В качестве буфера использовался 40 мМ Трис (рН = 10), в качестве элюента 1 М хлорид натрия в 40 мМ Трис буфере (рН = 10). Оценку активности фосфолипазы А2 в элюате проводили методом кислотно-щелочного титрования, содержание белка определяли по Бредфорду.

Результаты и обсуждение

Получены конструкции рР1С2а^аА-Р1а2 и рР1С2тР^А-Р1а2, проверенные секвенированием на корректность вставки и отсутствие мутаций в генах фосфолипазы А2 и модифицированного сигнала секреции mf4i. Линеаризованными конструкциями проведены трансформации компетентных клеток K. phaffii X-33. По 30 выросших на среде YPD c 250 мкг/мл зеоцина клонов с каждой конструкцией проиндуцированы при культивировании в жидкой питательной среде YPGM. Полученная культуральная жидкость от клонов проанализирована на наличие РLA2 методом гель-электрофореза в ПААГ (рисунок 2). Исходя из полученных данных, клоны с конструкциями рР1С2а^аА-Р1а2 и рРIСZmf4iA-Рlа2 продуцируют РLA2. Как и в работе Liu et. el. [18], нами установлено, что K. phaffii экспрессирует три формы PLA2 размером около 13 (А), 16 (В) и 20 (С) кДа. Лишь одна из них соответствует ожидаемому размеру целевой PLA2 в 13,6 кДа. Остальные, вероятно, являются гликозилиро-ванными вариантами фермента.

M I 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 II 12 13 14 15 16

Рисунок 2. Электрофореграмма белков культуральной жидкости клонов с разными вариантами сигнала a-MF. 1-8 -клоны рРЮ2а!рЬаА-Р!а2; 9-16 - клоны рРIСZmf4i-Рlа2; АВС - формы фосфолипазы А2; М - маркер размера белка

Figure 2. Electrophoregram of proteins of the culture fluid of clones with different signal variants a-MF. 1-8-clones of рРIСZаlрhаА-Рlа2; 9-16-clones of рРIСZmf4i-Рlа2; ABC-forms of phospholipase А2; M-marker of protein size

При этом нативный электрофорез образцов культуральной жидкости с последующим качественным проявлением РLА2 в среде с лецитином показал наличие двух активных форм РLА2 у всех полученных клонов (рисунок 3). Таким образом, одна гликозилированная форма РLА2 является интактной.

Рисунок 3. Результат нативного электрофореза белков культуральной жидкости клонов с разными вариантами сигнала a-MF. 1-4 - клоны рРIСZаlрhаА-РЫ; 5-7 - клоны рРIСZmf4i-Рlа2

Figure 3. The result of native electrophoresis of proteins of the culture fluid of clones with different signal variants a-MF. 1-4 - clones рРIСZаlрhаА-Рlа2; 5-7-clones рРIСZmf4i-Рlа2

Результаты определения фосфолипазной активности в культуральной жидкости скульти-вированных клонов K. phaffii с разными вариантами генетической конструкции приведены в таблице 1. Средний уровень экспрессии РLА2 под фактором mf4i достоверно не отличается от такового в случае нативного сигнала а - MF. Однако экспрессия единичных клонов K. phaffii оказалась выше при использовании модифицированного сигнала mf4i, что показано на рисунке 4.

'О

о

1 2 3 4 5 6 7 8

■ Активность фосфолипазы (клоны alpha-MF), ед/мл

■ Активность фосфолипазы (клоны mf4i), ед/мл

Рисунок 4. Активность фосфолипазы А2 в культуральной жидкости клонов с различными факторами секреции

Figure 4. Phospholipase А2 activity in the culture fluid of clones with different secretion factors

Таблица 1.

Активность фосфолипазы А2 в культуральной жидкости в зависимости от типа конструкции

Table 1.

Phospholipase А2 activity in the culture fluid, depending on the type of construction

Тип конструкции, трансформированной в K. Phaffii Type of construct transformed in K. phaffii Средние значения активности РLА2 в культуральной жидкости, ед./мл Average values of РLА2 activity in culture liquid, units/mL Максимальная активность РLА2 в культуральной жидкости клонов, ед./мл Maximum activity of РLА2 in culture liquid of clones, units/mL

рРIСZаlрhаА-Рlа2 44,7 ± 16,2 77,2

рРIСZmf4iА-Рlа2 59,3 ± 3,6 106,7

БытякЮ.С и dp. <Вестник,<ВГУИТ, 2G21, Т. 83, №. 1, С. 263-269

post@vestnik-vsuet. ru

Далее была проведена хромотографиче-ская очистка рекомбинантной PLA2 из культуральной жидкости клонов с разными вариантами генетической конструкции, а также ферментного препарата «Nagase». По нашим данным, удельная активность рекомбинантной PLA2, экспрессируемой различными клонами K. phaffii, достоверно не различается и составляет 4650 ед./мг. При этом удельная активность PLA2 из ферментного препарата «Nagase», экспрессируемого St. violaceoruber, составила 5220 ед./мг.

Таким образом, метилотрофные дрожжи K. phaffii вне зависимости от типа сигнала экс-прессируют рекомбинантные PLA2 со схожей активностью, сопоставимой с нативным ферментом St. violaceoruber.

Заключение

В результате проведенных исследований показано, что в среднем достоверных отличий в экспрессии, удельной активности рекомбинантной РLА2 метилотрофными дрожжами K. phaffii X-33 при использовании нативного сигнала секреции a - MF и его модифицированного варианта mf4i не обнаружено. Однако использование фактора секреции mf4i позволяет получить более высокую продукцию РLА2 у отдельных клонов K. phaffii.

Модифицированный фактор секреции mf4i имеет более высокий потенциал для экспрессии различных ферментов, что позволяет рассматривать его как перспективный фактор секреции для создания коммерческих экспрессионных систем на основе K. phaffii для синтеза гетеро-логичных белков.

Литература

1 Dennis E.A., Cao J., Hsu V.I.I., Magrioti V. et al. Phospholipase A2 enzymes: physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention // Chem Rev. 2011. V. 111. P. 6130-6185. doi:

10.1021/cr200085w

2 Samy R.P., Gopalakrishnakone P., Stiles B.G., Girish K.S. et al. Snake venom phospholipases A(2): a novel tool against bacterial diseases//Curr Med Chem. 2012. V. 19. P. 6150-6162. doi: 10.2174/092986712804485791

3 Muller V.D., Russo R.R., Cintra A.C., Sartim M.A. et al. Crotoxin and phospholipases A2 from Crotalus durissus terrificus showed antiviral activity against dengue and yellow fever viruses // Toxicon. 2012. V. 59. P. 507-515. doi: 10.1016/j.toxicon.2011.05.021

4 Muller V.D., Soares R.O., dos Santos N.N., Trabuco A.C. et al. Phospholipase A2 isolated from the venom of Crotalus durissus terrificus inactivates dengue virus and other enveloped viruses by disrupting the viral envelope // PLoS One. 2014. V. 9. №. 11. P. el 12351. doi: 10.1371/journal.pone.0112351

5 Russo R.R., Müller V.D.M., Cintra A.C.O., Figueiredo L.T.M. et al. Phospholipase A2 crotoxin B isolated from the venom of Crotalus durissus terrificus exert antiviral effect against dengue virus and yellow fever virus through its catalytic activity//J Virol Antivir Res. 2014. V. 3. P. 1. doi: 10.1016/j.toxicon.2011.05.021

6 Castillo J.C., Vargas L.J., Segura C., Gutiérrez J.M. et al. In vitro antiplasmodial activity of phospholipases A2 and a phospholipase homologue isolated from the venom of the snake Bothrops asper // Toxins (Basel). 2012. V. 4. P. 1500-1516. doi: 10.3390/toxins4121500

7 Nunes D.C., Figueira M.M., Lopes D.S., De Souza D.L. et al. BnSP-7 toxin, a basic phospholipase A2 from Bothrops pauloensis snake venom, interferes with proliferation, ultrastructure and infectivity of Leishmania (Leishmania) amazonensis // Parasitology. 2013. V. 140. P. 844-854. doi: 10.1017/S0031182013000012

8 Silveira L.B., Marchi-Salvador D.P., Santos-Filho N.A., Silva F.P. et al. Isolation and expression of a hypotensive and anti-platelet acidic phospholipase A2 from Bothrops mooj eni snake venom // J Pharm Biomed Anal. 2013. V. 73. P. 3 5-43. doi: 10.1016/j.jpba.2012.04.008

9 Rodrigues R.S., Izidoro L.F., de Oliveira R.J., Sampaio S.V. et al. Snake venom phospholipases A2: a new class of antitumor agents//Protein Pept Lett. 2009. V. 16. P. 894-898. doi: 10.2174/092986609788923266

Borrelli G.M., Trono D. Recombinant lipases and phospholipases and their use as biocatalysts for industrial applications // Int. J.N. Sei. 2015. V. 16. P. 20774-20840. doi: 10.3390/ijmsl60920774

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

11 Murakami M., Sato H., Miki Y., Yamamoto K. et al. A new era of secreted phospholipase A2 (sPLA2) // J Lipid Res. 2015. V. 56. P. 1248-1261. doi: 10.1194/jlr.R058123

12 Quach N.D., Arnold R.D., Cummings B.S. Secretory phospholipase A2 enzymes as pharmacological targets for treatment of disease. //Biochem Pharmacol. 2014. V. 90. P. 338-348. doi: 10.1016/j.bcp.2014.05.022

13 Ahmad M., Hirtz M., Pitcher H., Schwab H. Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous production//Appl Microbiol Biotechnol. 2014. V. 98. P. 5301-5317. doi: 10.1007/s00253-014-5732-5

14 Kang Z., Huang H., Zhang Y., Du G. et al. Recent advances of molecular toolbox construction expand Pichia pastoris m synthetic biology applications //World J Mcrobiol Biotechnol. 2017. V. 33. №. 1. P. 1-8. doi: 10.1007/sl 1274-016-2185-2

15 Liu A., Yu X.-W., Sha C., Xu Y. Streptomyces violaceoruber Phospholipase A2: expression in Pichia pastoris, properties, and application in oil degumming // Appl Biochem Biotechnol. 2015. V. 175. №. 6. P. 3195-3206. doi: 10.1007/s12010-015-1492-7

16 Takemori D., Yoshino K., Eba C., Nakano H. et al. Extracellular production of phospholipase A 2 from Streptomyces violaceoruber by recombinant Escherichia coli // Protein Expression and Purification. 2012. V. 81. №. 2. P. 145-150. doi: 10.1016/j.pep.20ll.10.002

1 7 Yu X.W., Sun W.H., Wang Y.Z., Xu Y. Identification of novel factors enhancing recombinant protein production in multi-copy Komagataella phaffii based on transcriptomic analysis of overexpression effects // Sci. Rep. 2017. V. 7. №. 1. P. 1-12. doi: 10.1038/s41598-017-16577-x

18 Codon Usage Database. URL: http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html.

19 EasySelect Pichia Expression Kit. For Expression of Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZa in Pichia pastoris. User manual // Invitrogen. 2010. 86 p.

20 Valli M., Tatto N.E., Peymann A., Gruber C. et al. Curation of the genome annotation of Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435 from gene level to protein function // FEMS yeast research. 2016. V. 16. №. 6. doi: 10.1093/femsyr/fow051

References

1 Dennis E.A., Cao J., Hsu V.I.I., Magrioti V. et al. Phospholipase A2 enzymes: physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chem Rev. 2011. vol. 111. pp. 6130-6185. doi: 10.1021/cr200085w

2 Samy R.P., Gopalakrishnakone P., Stiles B.G., Girish K.S. et al. Snake venom phospholipases A(2): a novel tool against bacterial diseases. Curr Med Chem. 2012. vol. 19. pp. 6150-6162. doi: 10.2174/092986712804485791

3 Muller V.D., Russo R.R., Cintra A.C., Sartim M.A. et al. Crotoxin and phospholipases A2 from Crotalus durissus terrificus showed antiviral activity against dengue and yellow fever viruses. Toxicon. 2012. vol. 59. pp. 507-515. doi: 10.1016/j.toxicon.2011.05.021

4 Muller V.D., Soares R.O., dos Santos N.N., Trabuco A.C. et al. Phospholipase A2 isolated from the venom of Crotalus durissus terrificus inactivates dengue virus and other enveloped viruses by disrupting the viral envelope. PLoS One. 2014. vol. 9. no. 11. pp. e112351. doi: 10.1371/journal.pone.0112351

5 Russo R.R., Müller V.D.M., Cintra A.C.O., Figueiredo L.T.M. et al. Phospholipase A2 crotoxin B isolated from the venom of Crotalus durissus terrificus exert antiviral effect against dengue virus and yellow fever virus through its catalytic activity. J Virol Antivir Res. 2014. vol. 3. pp. 1. doi: 10.1016/j.toxicon.2011.05.021

6 Castillo J.C., Vargas L.J., Segura C., Gutiérrez J.M. et al. In vitro antiplasmodial activity of phospholipases A2 and a phospholipase homologue isolated from the venom of the snake Bothrops asper. Toxins (Basel). 2012. vol. 4. pp. 1500-1516. doi: 10.33 90/toxins4121500

7 Nunes D.C., Figueira M.M., Lopes D.S., De Souza D.L. et al. BnSP 7 toxin, a basic phospholipase A2 from Bothrops pauloensis snake venom, interferes with proliferation, ultrastructure and infectivity of Leishmania (Leishmania) amazonensis. Parasitology. 2013. vol. 140. pp. 844-854. doi:10.1017/S0031182013000012

8 Silveira L.B., Marchi-Salvador D.P., Santos-Filho N.A., Silva F.P. et al. Isolation and expression of a hypotensive and anti-platelet acidic phospholipase A2 from Bothrops moojeni snake venom. J Pharm Biomed Anal. 2013. vol. 73. pp. 3543. doi: 10.1016/j.jpba.2012.04.008

9 Rodrigues R.S., Izidoro L.F., de Oliveira R.J., Sampaio S.V. et al. Snake venom phospholipases A2: a new class of antitumor agents. Protein Pept Lett. 2009. vol. 16. pp. 894-898. doi: 10.2174/092986609788923266

10 Borrelli G.M., Trono D. Recombinant lipases and phospholipases and their use as biocatalysts for industrial applications. Int. J.N. Sci. 2015. vol. 16. pp. 20774-20840. doi: 10.3390/ijms160920774

11 Murakami M., Sato H., Miki Y., Yamamoto K. et al. A new era of secreted phospholipase A2 (sPLA2). J Lipid Res. 2015. vol. 56. pp. 1248-1261. doi: 10.1194/jlr.R058123

12 Quach N.D., Arnold R.D., Cummings B.S. Secretory phospholipase A2 enzymes as pharmacological targets for treatment of disease. Biochem Pharmacol. 2014. vol. 90. pp. 338-348. doi: 10.1016/j.bcp.2014.05.022

13 Ahmad M., Hirtz M., Pitcher H., Schwab H. Protein expression in Pichia pastoris : recent achievements and perspectives for heterologous production. Appl Microbiol Biotechnol. 2014. vol. 98. pp. 5301-5317. doi: 10.1007/s00253-014-5732-5

14 Kang Z., Huang H., Zhang Y., Du G. et al. Recent advances of molecular toolbox construction expand Pichia pastoris in synthetic biology applications. World J Microbiol Biotechnol. 2017. vol. 33. no. 1. pp. 1-8. doi: 10.1007/s11274-016-2185-2

15 Liu A., Yu X.-W., Sha C., Xu Y. Streptomyces violaceoruber Phospholipase A2: expression in Pichia pastoris, properties, and application in oil degumming. Appl Biochem Biotechnol. 2015. vol. 175. no. 6. pp. 3195-3206. doi: 10.1007/s12010-015-1492-7

16 Takemori D., Yoshino K., Eba C., Nakano H. et al. Extracellular production of phospholipase A 2 from Streptomyces violaceoruber by recombinant Escherichia coli. Protein Expression and Purification. 2012. vol. 81. no. 2. pp. 145-150. doi: 10.1016/j.pep.2011.10.002

17 Yu X.W., Sun W.H., Wang Y.Z., Xu Y. Identification of novel factors enhancing recombinant protein production in multi-copy Komagataella phaffii based on transcriptomic analysis of overexpression effects. Sci. Rep. 2017. vol. 7. no. 1. pp. 1-12. doi: 10.1038/s41598-017-16577-x

18 Codon Usage Database. URL: http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html.

19 EasySelect Pichia Expression Kit. For Expression of Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZa in Pichia pastoris. User manual. Invitrogen. 2010. 86 p.

20 Valli M., Tatto N.E., Peymann A., Gruber C. et al. Curation of the genome annotation of Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435 from gene level to protein function. FEMS yeast research. 2016. vol. 16. no. 6. doi: 10.1093/femsyr/fow051

Сведения об авторах

Денис С. Бытяк магистр, кафедра биохимии и биотехнологии, Воронежский государственный университет инженерных технологий, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, Россия, bytyak.denis@mai1.ru

https://orcid.org/0000-0002-4281-2758 Юрий А. Гладченко генный инженер, Центр биотехнологий, ООО «Инновационный центр «Бирюч-Новые Технологии», Белгородская область, Красногвардейский р-н, с. Малобыково, ул. Белая Вежа, д. 1, 309927, Россия, dngfv5@gmai1.com

https://orcid.org/0000-0002-5895-9463 Анастасия В. Ряполова студент, кафедра медицинской биохимии и микробиологии, Воронежский государственный университет инженерных технологий, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, anac142009@yandex.ru

https://orcid.org/0000-0002-7784-9892 Ольга С. Корнеева д.б.н., профессор, кафедра биохимии и биотехнологии, Воронежский государственный университет инженерных технологий, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, Россия, korneeva-o1gas@yandex.ru

https://orcid.org/0000-0002-2863-0771 Екатерина А. Мотина к.т.н., доцент, кафедра биохимии и биотехнологии, Воронежский государственный университет инженерных технологий, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, Россия, ето1та18(й!таП.га https://orcid.org/0000-0002-3433-2754

Вклад авторов Денис С. Бытяк предложил методику проведения эксперимента и организовал производственные испытания. Юрий А. Гладченко, Анастасия В. Ряполова обзор литературных источников по исследуемой проблеме, проведение эксперимента, выполнение расчётов Ольга С. Корнеева консультация в ходе исследования Екатерина А. Мотина написала рукопись, корректировала её до подачи в редакцию и несет ответственность за плагиат Конфликт интересов Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Information about authors Denis S. Bytyak master student, biochemistry and biotechnology department, Voronezh State University of Engineering Technologies, Revolution Av., 19 Voronezh, 394036, Russia, bytyak.denis(S!mail.ru https://orcid.org/0000-0002-4281-2758

Yuri A. Gladchenko genetic engineer, Center for Biotechnology, Innovation Center Biryuch-New Technologies, Belgorod Region, Krasnogvardeysky district, Malobykovo village, Belaya Vezha str., 1, 309927, Russia, dngfv5@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-5895-9463

Anastasia V. Ryapolova student, medical biochemistry and microbiology department, Voronezh State University of Engineering Technologies, Revolution Av., 19 Voronezh, 394036, Russia, anacl42009(S>yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-7784-9892 Olga S. Korneeva Dr. Sci. (Biol.), professor, biochemistry and biotechnology department, Voronezh State University of Engineering Technologies, Revolution Av., 19 Voronezh, 394036, Russia, korneeva-olgas@yandex.ru

https://orcid.org/0000-0002-2863-0771 Ekaterina A. Motina Cand. Sci. (Engin.), biochemistry and biotechnology department, Voronezh State University of Engineering Technologies, Revolution Av., 19, Voronezh, 394036, Russia, emotina18@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-3433-2754 Contribution

Denis S. Bytyak proposed a scheme of the experiment and organized production trials

Yuri A. Gladchenko, Anastasia V. Ryapolova review of the literature on an investigated problem, conducted an experiment, performed computations Olga S. Korneeva consultation during the study Ekaterina A. Motina wrote the manuscript, correct it before filing in editing and is responsible for plagiarism Conflict of interest The authors declare no conflict of interest.

Поступила 18/01/2021_После редакции 16/02/2021_Принята в печать 03/03/2021

Received 18/01/2021_Accepted in revised 16/02/2021_Accepted 03/03/2021

Аннотация научной статьи по промышленным биотехнологиям, автор научной работы — Бытяк Д.С., Гладченко Ю.А., Ряполова А.В., Корнеева О.С., Мотина Е.А.

Похожие темы научных работ по промышленным биотехнологиям , автор научной работы — Бытяк Д.С., Гладченко Ю.А., Ряполова А.В., Корнеева О.С., Мотина Е.А.

COMPARATIVE EXPRESSION OF RECOMBINANT PHOSPHOLIPASE A2 IN KOMAGATAELLA PHAFFII DEPENDING ON THE MODIFICATION OF THE ALPHA-FACTOR SIGNALING PEPTIDE