CC BY
20
УДК 547.856.1+547.856.7+579.66
Сравнение цитотоксической активности соединений рядов бензимидазолохиназолина и пиридопиримидина
М. А. Ивонин, А. С. Фомин, Г. Л. Бурыгин, В. В. Сорокин
Ивонин Максим Андреевич, аспирант кафедры органической и биоорганической химии Института химии, Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского, [email protected]
Фомин Александр Сергеевич, научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, [email protected]
Бурыгин Геннадий Леонидович, старший научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, [email protected]
Сорокин Виталий Викторович, профессор кафедры органической и биоорганической химии Института химии, Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского, [email protected]
Колориметрически с помощью МТТ-теста проведен скрининг цитотоксической активности 5-арил-1,2,3,4,5,6-гексагидро-бенз[4,5]имидазоло[1,2-а]хиназолинов и таутомерной смеси 4-амино-2-фенил-6Н-пиридо[1,2-а]пиримидин-3-карбонитрила c 2-(фенил(пиридин-2-иламино)метил)-малононитрилом, полученных трехкомпонентной конденсацией ароматических альдегидов (бензальдегид, 3-бромбензальдегид, 4-метоксибен-зальдегид), гетероциклических аминов (2-аминобензимидазола либо 2-аминопиридина) и циклогексанона либо динитрила малоновой кислоты, в сравнении с исходными аминами. Соединения исследованы в концентрациях 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12 и 1,61 мкг/мл на монослойных клеточных линиях почки африканской зеленой мартышки (Vero). Наибольшую активность проявили 5-(4-метоксифенил)-1,2,3,4,5,6-гексагидробенз[4,5] имидазоло[1,2-а]хиназолин и таутомерная смесь 4-амино-2-арил-6H-пиридо[1,2-a]пиримидин-3-карбонитрила c 2-(фе-нил(пиридин-2-иламино)метил)-малононитрилом, Ю50 которых составила соответственно 75 и 50 мкг/мл. Для 5-фенил-1,2,3,4,5,6-гексагидробенз[4,5]имидазоло[1,2-а]хиназолина Ю50 составила 100 мкг/мл. Для остальных соединений Ю50 не выявлена, а исходные 2-аминобензимидазол и 2-аминопиридин ингибировали метаболическую активность лишь на 20-30% при максимальных концентрациях. Значения полуингибирующей концентрации, определенные с помощью МТТ-теста, схожи с данными по цитотоксичности подобных гетероциклов, полученными ранее с применением AlamarBlue-теста. Ключевые слова: бензимидазолохиназолины, пиридопири-мидины, цитотоксическая активность, AlamarBlue-тест, МП-тест, Vero.
DOI: https://doi.org/10.18500/1816-9775-2019-19-4-396-400
Цитотоксическое действие - это прямое или косвенное поражение внутриклеточной структуры и генетического аппарата клетки, процессов дыхания и других видов пластического обмена. Исследование цитотоксической активности синтетических соединений является важным этапом поиска новых лекарственных препаратов, пестицидов и гербицидов. Известно, что среди производных бензимидазолозиназолинов и пиридопиримидинов находят соединения, обладающие противоаллергической, противо-микробной, антигипертензивной, фунгицидной и иной активностью [1-7]. В связи с широким спектром потенциального применения внимание могут заслуживать соединения, как показавшие высокие значения цитотоксической активности, так и не проявившие таковой.
Материалы и методы
Ранее нами колориметрически с использованием индикатора AlamarBlue была изучена цито-токсическая активность по отношению к клеткам почки африканской зеленой мартышки (Vero) для новых гетероциклических соединений ряда пи-разолокарбонитрила, бензимидазолохиназолина и пиридопиримидинкарбонитрила, полученных на основе трехкомпонентной конденсации гетероциклических аминов (2-аминобензимидазола либо 2-аминопиридина) либо гидразинов (гидразин, фенилгидразин, 4-нитрофенилгидразин) с ароматическими альдегидами (бензальдегид, 3-бромбензальдегид, 4-метоксибензальдегид), ци-клоалканонами (циклогексанон, циклопентанон) и динитрила малоновой кислоты [8, 9]. Первичный скрининг цитотоксичности выявил карбонитрилы и бензимидазолохиназолин, проявляющие активность в концентрациях 50-120 мкг/мл.
В настоящей работе с помощью колориметрического МТТ-теста изучены бензимидазолохиназолины, различающиеся заместителями в фенильном кольце, а также новый представитель пиридопиримидина. МТТ-тест является стандартным методом проверки ци-тотоксичности различных соединений и основывается на способности бесцветной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-
© Ивонин М. А., Фомин А. С., Бурыгин Г. Л., Сорокин В. В., 2019
дифенилтетразолия бромид, МТТ) восстанавливаться до окрашенного формазана в присутствии митохондриальных ферментов живых клеток.
Протестированы следующие соединения: 5-фенил-1,2,3,4,5,6-гексагидробенз[4,5] имидазоло[1,2-а]хиназолин 1, 5-(4-метоксифенил)-1,2,3,4,5,6-гексагидробенз[4,5]имидазоло[1,2-а]
хиназолин 2, 5-(3-бромфенил)-1,2,3,4,5,6-гексагидробенз[4,5]имидазоло[1,2-а]хиназо-лин 3 и 4-амино-2-фенил-6Л-пиридо[1,2-а] пиримидин-3-карбонитрил 4 (в виде смеси с таутомерным 2-(фенил(пиридин-2-иламино) метил)-малононитрилом), а также исходные амины - 2-аминобензимидазол 5 и 2-аминопиридин 6.
N н
Соединения 1—4 получены нами путем one-pot взаимодействия ароматических альдегидов (бензальдегид, 3-бромбензальдегид, 4-меток-
nnh nh/ О
R = H (1), 4-OCH3 (2), 3-Br (3)
C6H4OCH3-4 /^CeH4Br-3
сибензальдегид), гетероциклических аминов и циклогексанона либо динитрила малоновой кислоты:
CHO
Ох
1-3
NH
CH2
nh2
CN Ph-CHO ) ^^
CN
NNC
N
CN h
4
Сравнительный анализ цитотоксической активности соединений 1—6 проводился на моно-слойных клеточных линиях Vero, представленных сотрудниками лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН. Клетки культивировали в питательной среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Лиофильно высушенные соединения 1-6 перед исследованием ре-суспендировали в диметилсульфоксиде (ДМСО). Определение дыхательной активности проводили по способности клеток восстанавливать нитроте-тразолевый синий (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-
2,5-дифенилтетразолия бромид) до формазана по общепринятому методу [10] на базе ЦКП «Симбиоз» ИБФРМ РАН.
В лунки 96-луночного планшета вносили клетки, по достижении клеточного монослоя 70-90% удаляли старую питательную среду и вносили новую, содержащую раствор исследуемого препарата в концентрациях от 1,6 до 100 мкг/мл. В качестве контрольного препарата использовали ДМСО в концентрации, соответствующей содержанию растворителя в исследуемых образцах. Клетки инкубировали при
R
R
Н
+
37° С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Через 24 часа удаляли питательную среду и вносили раствор нитротетразолевого синего (0,5 мг на 100 мл забуференного физиологического раствора), культивировали 1 час. Содержимое лунок удаляли и вносили ДМСО. Далее измеряли оптическую плотность раствора в лунках при длине волны 540 нм на планшетном анализаторе Multiscan Ascent (Thermo Scientific, Финляндия). Препараты вносились в 5 повторах, эксперимент независимо повторяли 3 раза.
Результаты и их обсуждение
Соединение 1 (5-фенил-1,2,3,4,5,6-гексагидробенз[4,5]имидазоло[1,2-а]хиназолин) в концентрациях 12,5 мкг/мл и менее не оказывало достоверного изменения метаболической активности (p > 0,08) относительно контроля. Угнетение метаболической активности клеток линии Vero до 50,3% ± 3,8% отмечалось при концентрации 100 мкг/мл (p < 0,01). Соответственно, IC50 для соед. 1 составило 100 мкг/мл.
Соединение 2 (5-(4-метоксифенил)-1,2,3,4,5,6-гексагидробенз[4,5]имидазоло[1,2-а] хиназолин) в концентрации 1,6 мкг/мл не оказывало достоверного изменения метаболической активности (p = 0,49). Угнетение метаболической активности до 42,7% ± 7,8% было выявлено при концентрации 100 мкг/мл (p < 0,01). 1С50 для соед. 2 составило 75 мкг/мл.
Соединение 3 (5-(3-бромфенил)-1,2,3,4,5,6-гексагидробенз[4,5]имидазоло[1,2-а]хиназолин) в концентрациях 25 мкг/мл и меньше не оказывало влияния на метаболическую активность клеток (p > 0,12). Снижение метаболической активности до 63,5% ± 4,8% было отмечено при концентрации 100 мкг/мл (p < 0,01). 1С50 для соед. 3 нами не была выявлена.
Соединение 4 (таутомерная смесь 4-амино-2- арил -6 Л - пиридо [1,2- а] пиримидин-3- карбо -
нитрила с 2-(фенил(пиридин-2-иламино)метил)-малононитрилом в концентрации менее 6,3 мкг/мл не оказывало достоверного изменения метаболической активности относительно контрольного препарата. Угнетение метаболической активности клеток линии Vero до 43,3 ± 6,2% было установлено при концентрации 100 мкг/ мл (p < 0,01). Рассчитано, что 1С50 для соед. 4 составляло 50 мкг/мл.
Соединение 5 (2-аминобензимидазол) в концентрациях 25 мкг/мл и меньше не оказывало влияния на метаболическую активность клеток (p = 0,65). Подавление метаболической активности до 69,1% ± 0,8% относительно контроля отмечалось при концентрации 100 мкг/мл (p < 0,01). IC50 для соед. 5 не был выявлен.
Соединение 6 (2-аминопиридин) в концентрации менее 50 мкг/мл не вызывало изменений в метаболической активности клеток. Угнетение метаболической активности до 77,3% ± 13,4% относительно активности в контроле отмечалось при концентрации 100 мкг/мл (p = 0,01). IC50 для соед. 6 также не был нами выявлен.
По результатам проведенных тестов (таблица) можно утверждать, что среди бензими-дазолохиназолинов наиболее активными являются представители с 4-метоксифенильным заместителем (соединение 2, 1С50 = 75 мкг/мл) и фенильным заместителем (соединение 1, 1С50 = 100 мкг/мл), а среди всех протестированных образцов наиболее активным является таутомерная смесь пиридопиримидина с его открытой формой (соединение 4, IC5Q = 50 мкг/мл). Для остальных соединений 1С50 нами выявлен не был. Тем не менее по угнетению метаболической активности клеток линии Vero соединениями 3, 5 и 6 при концентрации в среде, равной 100 мкг/мл, и характеру зависимости ингибирования активности от концентрации можно предположить, что IC50 для них составляло немногим более 100 мкг/мл.
Изменение метаболической активности клеточной линии Vero в зависимости от концентрации соединений 1-6 Change in metabolic activity of the Vero cell line depending on the concentration of compounds 1-6
Клеточная линия Vero, концентрация мкг/мл / Vero cell line concentration, ^g/ml
Контроль/ Control 1 2 3 4 5 6
100 ± 5,1 100 ± 9,7 100 ± 4,2 100 ± 7,7 100 ± 7,4 100 ± 3,4
100 50,3 ± 3,8 42,7 ± 7,8 63,5 ± 4,8 43,3 ± 6,2 69,1 ± 0,8 77,3 ± 13,4
50 72,4 ± 11,4 57,1 ± 13,9 79,6 ± 8,9 49,7 ± 7,8 74,2 ± 7,9 86,5 ± 5,1
25 74,2 ± 8,9 61,5 ± 5,4 91,9 ± 9,7 55,3 ± 8,7 83,5 ± 7,9 87,4 ± 7,3
12,5 91,6 ± 11,5 64,8 ± 7,9 99,1 ± 8,5 67,9 ± 4,7 82,4 ± 6,9 92,9 ± 7,8
6,25 105 ± 3,7 79,1 ± 5,4 102,7 ± 5,9 80,7 ± 4,8 90,9 ± 6,7 94,3 ± 3,4
3,12 107,8 ± 3,2 81,4 ± 7,3 99,1 ± 2,4 89,7 ± 5,4 93,1 ± 3,8 93,5 ± 1,8
1,61 101,1 ± 5 103 ± 6,0 101,7 ± 4,4 96,9 ± 6,2 98,1 ± 8,8 99,3 ± 9,2
Таким образом, результаты цитотоксичности (выраженные в показателе полуингибирования 1С50) при использовании двух разных колориметрических тестов (AlamarBlue-тест, МТТ-тест) позволяют констатировать цитотоксическую активность для бензимидазолохиназолинов и пи-ридопиримидинкарбонитрилов в концентрациях 50-100 мкг/мл. Полученные данные позволяют прогнозировать перспективность дальнейших прикладных исследований указанных соединений.
Список литературы
1. Hermecz I., Horvath A., Rodriguez L., Meszaros Z. Nitrogen bridgehead compounds. 44. New antiallergic 4H-pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-ones // Journal of Medicinal Chemistry. 1984. Vol. 27, №. 10. P. 1253-1259. DOI: https://doi.org/10.1021/jm00376a003
2. Donkor I. O., Klein C. L., Liang L., Zhu N. Synthesis and antimicrobial activity of 6,7-annulated pyrido[2,3-d] pyrimidines // Journal of Pharmaceutical Sciences. 1995. Vol. 84, № 5. P. 661-664. DOI: https://doi.org/10.1002/ jps.2600840526
3. Thompson A.M., Bridges A. J., Fry D. W. Tyrosine kinase inhibitors. 7-Amino-4-(phenylamino)-and 7-amino-4-[(phenylmethyl)amino]pyrido[4,3-d]pyrimidines: a new class of inhibitors of the tyrosine kinase activity of the epidermal growth factor receptor // Journal of Medicinal Chemistry. 1995. Vol. 38, № 19. P. 3780-3788. DOI: https://doi.org/10.1021/jm00019a007
4. Bansal Y., SilakariO. The therapeutic journey of benzimid-azoles : a review // Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2012. Vol. 20, № 21. P. 6208-6236. DOI: https://doi. org/10.1016/j.bmc.2012.09.013
5. Pastor A., Alajarin R., Vaquero J. J. Synthesis and structure of new pyrido[2,3-d]pyrimidine derivatives with calcium channel antagonist activity // Tetrahedron. 1994. Vol. 50, № 27. P. 8085-8098. DOI: https://doi.org/10.1016/ S0040-4020(01)85291-1
6. Bennett L. R., Blankley C. J., Fleming R. W. Antihypertensive activity of 6-arylpyrido[2,3-d]pyrimidin-7-amine derivatives // Journal of Medicinal Chemistry. 1981. Vol. 24, № 4. P. 382-389. DOI: https://doi.org/10.1021/ jm00136a006
7. Quiroga J., Cisneros C., Insuasty B. Microwave-assisted three-component synthesis and in vitro antifungal evaluation of 6-cyano-5,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-4-(3H)-ones // Journal of Heterocyclic Chemistry. 2006. Vol. 43, № 2. P. 299-306. DOI: https://doi.org/10.1002/ jhet.5570430208
8. Ивонин М. А., Бурыгин Г. Л., Мещерякова А. А., Тюль-кинаИ. Р., Сорокин В. В. Цитотоксическая активность некоторых представителей ряда бензимидазоло [1,2-а] хиназолина, пиридо[1,2-а]пиримидина и пиразоло-карбонитрилов // Межвуз. сб. науч. тр. XIII Вcерос. конф. молодых ученых с междунар. участием. Саратов : Саратовский источник, 2018. С. 37-39.
9. Ивонин М. А., Дымолазова Д. К., Сорокин В. В., Кривенько А. П. Синтез орто-Я-фенил бензимидазо-ло-гексагидрохиназолинов с угловым сочленением колец // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2016. Т. 16, вып. 4. С. 370-371. DOI: 10.18500/1816-9775-2016-16-4-370-371
10. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival : application to proliferation and cytotoxicity assays // Journal of Immunological Methods. 1983. Vol. 65, № 1-2. P. 55-63. DOI: https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90303-4
Образец для цитирования:
Ивонин М. А., Фомин А. С., Бурыгин Г. Л., Сорокин В. В. Сравнение цитотоксической активности соединений рядов бензимидазолохиназолина и пиридопиримидина // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2019. Т. 19, вып. 4. С. 343-349. DOI: https://doi.org/10.18500/1816-9775-2019-19-4-396-400
Comparison of Cytotoxic Activity of Compounds from the Benzimidazolequinazoline and Pyridopyrimidine Series
M. A. Ivonin, A. S. Fomin, G. L. Burygin, V. V. Sorokin
Maxim A. Ivonin, https://orcid.org/0000-0003-1379-704X, Saratov State University, 83 Astrakhanskaya St., Saratov 410012, Russia, [email protected]
Alexander S. Fomin, https://orcid.org/0000-0001-5766-3583, Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences (IBPPM RAS), 13 Entuziastov Ave., Saratov 410049, Russia, [email protected]
Gennady L. Burygin, https://orcid.org/0000-0001-8031-9641, Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms,
Russian Academy of Sciences (IBPPM RAS), 13 Entuziastov Ave., Saratov 410049, Russia, [email protected]
Vitaliy V. Sorokin, http://orcid.org/0000-0002-5861-3307, Saratov State University, 83 Astrakhanskaya St., Saratov 410012, Russia, [email protected]
Colorimetrically using the MTT assay the cytotoxic activity of 5-aryl-1,2,3,4,5,6-hexahydrobenz[4,5]imidazolo[1,2-a]quinazolines and a tautomeric mixture of 4-amino-2-phenyl-6H-pyrido[1,2-a] pyrimidin-3-carbonitrile with 2-(phenyl(pyridin-2-ylamino)methyl)-malononitrile was screened. These compounds were obtained by the three-component condensation of aromatic aldehydes (benzaldehyde, 3-bromobenzaldehyde, 4-methoxybenzaldehyde), heterocyclic amines (2-aminobenzimidazole or 2-aminopyridine) and cyclohexanone or malonic acid dinitrile in comparison with the starting amines. Compounds were tested at concentrations of 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, and 1.61 pg/ml on monolayer cell
lines of the African green monkey kidney (Vero). IC50 values for the most active compounds (5-(4-methoxyphenyl)-1,2,3,4,5,6-hexahydrobenz[4,5]imidazolo[1,2-a]quinazoline and a tautomeric mixture of 4-amino-2-aryl-6H-pyrido[1,2-a]pyrimidine-3-carbonitrile with 2-(phenyl(pyridin-2-ylamino)methyl)-malononitrile were 75 and 50 pg/ml, respectively. For 5-phenyl-1,2,3,4,5,6-hexahydrobenz[4,5] imidazolo[1,2-a]quinazoline, the IC50 value was 100 pg/ml. For the remaining compounds, IC50 was not detected, and the starting 2-aminobenzimidazole and 2-aminopyridine inhibited the metabolic activity by only 20-30% at maximum concentrations. The values of the half-inhibitory concentration determined using the MTT assay are similar to the values, which were obtained earlier in the cytotoxic studies of similar heterocyclic compounds by AlamarBlue assay. Keywords: benzimidazoloquinazolines, pyridopyrimidines, cytotoxic activity, AlamarBlue assay, MTT assay, Vero.
References
1. Hermecz I., Horvath A., Rodriguez L., Meszaros Z. Nitrogen bridgehead compounds. 44. New antiallergic 4H-pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-ones. Journal ofMedicinal Chemistry, 1984, vol. 27, no. 10, pp. 1253-1259. DOI: https://doi.org/10.1021/jm00376a003
2. Donkor I. O., Klein C. L., Liang L., Zhu N. Synthesis and antimicrobial activity of 6,7-annulated pyrido[2,3-d] pyrimidines. Journal of Pharmaceutical Sciences, 1995, vol. 84, no. 5, pp. 661-664. DOI: https://doi.org/10.1002/ jps.2600840526
3. Thompson A. M., Bridges A. J., Fry D. W. Tyrosine kinase inhibitors. 7-Amino-4-(phenylamino)-and 7-amino-4-[(phenylmethyl)amino]pyrido[4,3-d]pyrimidines: a new class of inhibitors of the tyrosine kinase activity of the epidermal growth factor receptor. Journal ofMedicinal Chemistry, 1995, vol. 38, no. 19, pp. 3780-3788. DOI: https://doi.org/10.1021/jm00019a007
4. Bansal Y., Silakari O. The therapeutic journey of benzi-midazoles : a review. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2012, vol. 20, no. 21, pp. 6208-6236. DOI: https://doi. org/10.1016/j.bmc.2012.09.013
5. Pastor A., Alajarin R., Vaquero J. J. Synthesis and structure of new pyrido[2,3-d]pyrimidine derivatives with calcium channel antagonist activity. Tetrahedron, 1994, vol. 50, no. 27, pp. 8085-8098. DOI: https://doi. org/10.1016/S0040-4020(01)85291-1
6. Bennett L. R., Blankley C. J., Fleming R. W. Antihypertensive activity of 6-arylpyrido[2,3-d]pyrimidin-7-amine derivatives. Journal of Medicinal Chemistry, 1981, vol. 24, no. 4, pp. 382-389. DOI: https://doi.org/10.1021/ jm00136a006
7. Quiroga J., Cisneros C., Insuasty B. Microwave-assisted three-component synthesis and in vitro antifungal evaluation of 6-cyano-5,8-dihydropyrido[2,3-d]pyrimidin-4-(3H)-ones. Journal of Heterocyclic Chemistry, 2006, vol. 43, no. 2, pp. 299-306. DOI: https://doi.org/10.1002/ jhet.5570430208
8. Ivonin M. A., Burygin G. L., Meshcheryakova A. A., Tyul'kina I. R., Sorokin V. V. Citotoksicheskaya aktivnost' nekotoryh predstavitelej ryada benzimidazolo[1,2-a]hi-nazolina, pirido[1,2-a]pirimidina i pirazolokarbonitrilov [Cytotoxic activity of some representatives of a number of benzimidazolo [1,2-a] quinazoline, pyrido [1,2-a] pyrimidine and pyrazolocarbonitriles]. Mezhvuz. sb. nauch. tr. XIII Vceros. konf. molodykh uchenykh s mezhdunar. uchastiem [Interuniv. Coll. of Sci. Papers of XIII All-Russia Conf. for Young Scientists with Intern. participation]. Saratov, Saratovskiy istochnik, 2018, pp. 37-39 (in Russian).
9. Ivonin M. A., Dymolazova D. C., Sorokin V. V. Synthesis of orto-R-phenyl benzimidazolo-heksahydroquinazoline with angular articulation rings. Izv. Saratov Univ. (N. S.), Ser. Chemistry. Biology. Ecology, 2016, vol. 16, iss. 4, pp. 370-371. DOI: https://doi.org/10.18500/1816-9775-2016-16-4-370-371
10. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods, 1983, vol. 65, no. 1-2, pp. 55-63. DOI: https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90303-4
Cite this article as:
Ivonin M. A., Fomin A. S., Burygin G. L., Sorokin V. V. Comparison of Cytotoxic Activity of Compounds from the Benz-imidazolequinazoline and Pyridopyrimidine Series. Izv. Saratov Univ. (N. S.), Ser. Chemistry. Biology. Ecology, 2019, vol. 19, iss. 4, pp. 396-400 (in Russian). DOI: https://doi.org/10.18500/1816-9775-2019-19-4-396-400
