CC BY
108
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2015 БИОЛОГИЯ Вып. 4
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.22
М. А. Петерс% Н. Г. Музыка", О. И. Октябрьский1 ь, Г. В. Смирнова'1
1 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия Пермский национальный исследовательский политехнический университет Пермь, Россия
СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI ПРИ ДЕЙСТВИИ ЦИПРОФЛОКСАЦИНА
11роведено сравнение различных методов оценки жизнеспособности бактерий К. colt, обработанных. фюрхинолоном циирофлоксацином. Показано отсутствие полной корреляции между результатами, полученными в тсстах по определению удельной скорости роста, способности к образованию колоний и поддержанию мембранного потенциала (Ду), а также в тесте «live-dead», В частности, только 0.04% клеток в популяции сохраняли способность к образованию колоний через 2 ч. экспозиции к 0.3 мкг/мл ципрофлоксацина, в то время как доля «живых» клеток в тосте «live/dead» составляла 83% от их общего числа. При обработке 3 мкг/мл ципрофлоксацина способность к образованию колоний демонстрировали 0,13% клеток, тогда как в этих же условиях в тесте «live/dead» практически всс клетки имели интакгные мембраны и не окрашивались пропидиум иодидом. В отличие от колониеобразующей способности и теста «live/dead», в тесте с DiBACjiT) наблюдалась прямая зависимость числа флуоресцирующих (деполяризованных) клеток от концентрации ципрофлоксацина. Через 2 ч. инкубации доля клеток, утративших мембранный потенциал» составляла 30% в случае обработки 0,3 мкг/мл ципрофлоксацина и 70% - при обработке 3 мкг/мл этого антибиотика. За 2.5 ч. экспозиции экспрессия $ulA(sfiA)::lacZ возрастала в 12 раз при действии 0.3 мкг/мл ципрофлоксацина и в 3 раза при обработке клеток 3 мкг/мл этого антибиотика. Обнаружена обратная зависимость между уровнем экспрессии гена sulA* принадлежащего SOS-регулону, и количеством колониеобразующих единиц (КОЕ),
Ключевые снова; цинрофлоксацин; «live-dead» i^cr; мембранный потенциал (Ду); SOS-ответ.
М. A. Peters', N. G. Muzyka\ О. N. Oktyabrsky* \ G. V. Smirnova*
Institute of Ecology and Gcnctics of Microorganisms of the Ural Branch RAS, Perm, Russian Federation
b Perm National Research Polytechnic University, Perm, Russian Federation
COMPARISON OF THE METHODS OF VIABILITY DETERMINATION IN ESCHERICHIA COLI CULTURES TREATED WITH CIPROFLOXACIN
Different methods of viability determination in E. coli treated with ciprofloxacin were compared. There w as no complete correlation between the results obtained under determination of the specific growth rate, colony forming ability , membrane potential (Д\|/) and in the "live-dead" test. In particular, only 0.04% of cells in the population retain the ability to form colonies after two horns of exposure to 0.3 pg/ml ciprofloxacin , w hile the proportion of the "live" cells in the test "live/dead" was 83% Under treatment with 3 pg/ml ciprofloxacin, ability to form colonies were showed 0.13% of the cells, whereas in the same conditions in the test «live/dead» almost all cells were not stained with propidium iodide. Unlike colony fanning and «live/dead» test, in the test with DiBAC4(3) there was a direct correlation between the number of fluorescent (depolarized) cells and concentration of ciprofloxacin: 30% of cells lost membrane potential under treatment with 0.3 (.ig/ml ciprofloxacin and 70% under exposure to 3 pg/ml of antibiotic. Expression of sitlA::lacZ fusion increased 12 rimes and 3 times by the action of 0.3 jig/ml and 3 pg/ml of ciprofloxacin, respectively. A reverse correlation between the expression of the sulA gene and the number of colony forming units was found.
Key words: ciprofloxacin; «live-dead» test; membrane potential (Дхр); SOS-response.
Ципрофлоксацин является высокоэффективным и широко используемым антибиотиком, входящим в группу фторхинолонов. Эти антибиотики инги-бируют синто ДНК путем взаимодействия с бак-
териальными топоизомеразами - ДНК-гиразой и топоизомеразой IV. Тоиоизомеразы играют важную роль в процессе репликации, релаксируя свсрхспирализованныс молекулы ДНК посрсдст-
С, Петере М А.; Музыка Н. Г, Октябрьский О. Н, Смирнова Г В., 2015
ззз
вом внесения одно- или дву цепочечных разрывов с последующим их восстановлением (лигировани-см), Хинолоны быстро связываются с комплексом ДНК-фермент, препятствуя восстановлению разрывов в молекуле ДНК, что приводит к фрагментации хромосом и. в конечном итоге, к гибели клеток IDrlica et al.7 2008]. Экспозиция к ципрофлок-сацину, как и к другим агентам, повреждающим ДНК, индуцирует SOS-ответ, контролирующий репарацию ДНК и филаментацию клеток [Friedberg. Walker. Siede. 1995], Ципрофлоксацин оказывает бактерицидный эффект как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Предполагается, что в аэробных условиях в механизм бактерицидного действия хинолонов вовлечены активные формы кислорода (АФК): супероксид, перекись водорода и гидроксильные радикалы, продуцируемые с участием дыхательной цепи [Wang et al., 2010],
Традиционным способом определения степени бактерицидного эффекта различных антибактериальных препаратов является подсчёт числа видимых колоний (КОЕ) после высева соответствующих разведений бактериальных культур на агари-зованные среды. Вместе с тем в последние годы все шире используются более быстрые методы определения жизнеспособности бактерий, основанные на использовании флуоресцентных проб, которые позволяют осуществлять мониторинг жизненно важных биологических параметров отдельных клеток. К числу таких параметров относятся проницаемость мембран и способность поддерживать мембранный потенциал. Использование двух флуоресцентных красителей ДНК. SYT09 и про-пидиум иодида (PI), в «live-dead» тесте позволяет дифференцировать бактерии с интактной и повреждённой цитоплазматической мембраной [Вегпеу et al., 2007]. SYT09, дающий зелёную флуоресценцию, проникает во все клетки и служит для подсчета их общего количества, в то время как красный флуоресцентный краситель PI входит только в клетки с повреждёнными цитоплазмати-ческими мембранами или нарушенным механизмом откачки этого красителя. Следует отметить, однако, что если клетки с поврежденной мембраной можно рассматривать как «мёртвые», то обратное утверждение (интактные клетки активны) не всегда справедливо [Вегпеу et ai., 2007J.
Широко используемой пробой на мембранный потенциал является флуорохром бис-(1,3-дибутил-барбитуровая кислота) триметиноксонол DiBAC4(3) [Wickcns et al, 2000], Отрицательно заряженный DiBAC4(3) не может проникать в активные клетки, несущие изнутри отрицательный заряд. Поэтому клетки, окрашенные DiBAC4(3), можно рассматривать как утратившие мембранный потенциал (деполяризованные). Было показано наличие тесной корреляции между числом КОЕ при определении стандартным методом и количеством поляризованных клеток в тесте с DiBAC4(3) [Jcpras et al.. 1995]. Однако слсдуст иметь в виду-что изменения мембранного потенциала могут со-
провождать различные физиологические перестройки в клетках и отражать переключения их метаболической активности.
Целью настоящей работы является сравнение различных методов оценки жизнеспособности бактерий Е. coli при действии ципрофлоксацина и изучение связи между жизнеспособностью бактерий и индукцией SOS-отвста и антиоксидантных генов.
Материалы и методы исследования
Штаммы бактерии и условия культивирования. В качестве объекта исследований использовали штамм Е. coli BW25113 &(araD-araB)567. Ыас1Ш1{:.гтВ-Ъ\ X-, rph-1, A(rhaD-rhaB)568. /ш//?514. полученный из Е. coli Genetic Stock Center (CGSC). Штаммы NM3001 и NM301L. несущие слияния промоторов sodA и sulA(sflA) генов со структурным геном lad, кодирующим ß-галактозидазу, были сконструированы путем трансакции фагом PI слияний soäArlacZ и $ulA(sfiA)::lacZ из Е. coli DM4000 (дар проф. М. Volkert) и QC772 (дар проф. D. Touati) в BW25113. Штамм NM3021« несущий транскрипционное генное слияние katG::lacZ. был получен путем трансформации клеток Е. coli BW25113 плазмидой рКТЮЗЗ [TaoetaL 1989].
Бактерии выращивали на минимальной среде М9 (Na:HPOi • 12Н:0 - L5.13 г/л; KH2POi - 3 г/л; NH4C1 - 1 г/л; NaCl - 0.5 г/л; MgS0WH20 - 0.246 г/л; СаСЬ - Ö.011 г/л) с добавлением 0.15% глюкозы. За ростом следили путем измерения оптической плотности при длине волны 600 им (OD^rto). Клетки ИЗ НОЧНОЙ культуры после центрифугирования переносили в 250-мл колбы со 50 мл свежей среды (начальная 00*00=0.1) и культивировали на шейкере (150 об/мин) при 37°С до (XWrO.4. При достижении этой плотности в культуру вносили ципрофлоксацин в концентрациях 0 (контроль). 0.3 и 3 мкг/мл и далее выращивали в присутствии антибиотика б течение 2.5 ч.
Удельную скорость роста культуры (ц) рассчитывали по формуле
h-h
где ÖDßwfc) и OD^o^i) - оптическая плотность культуры, измеренная при длине волны 600 нм, во время t2 и ?i.
Колониеобразушщую способность определяли в образцах, отобранных с интервалом в 30 мин. из контрольной культуры и культур, обработанных ципрофлоксацином. После отмывания и приготовления серии разведений в 0.9%-ном растворе NaCl клетки смешивали с расплавленным при 42°С мягким (0.8%) LB-агаром и выливали на чашки Пет-
риг содержащие твёрдый LB-arap (1.5%). Количество образовавшихся колоний (КОЕ) подсчитывали через 24 ч. инкубации в термостате при 37°С.
В тесте «live-dead» образцы культуры (0.5 мл) отмывали и ресуспецдировали в 0.5 мл 0.9%-ном растворе NaCL обрабатывали SYT09 (10 мкМ) и пропидиум иодидом (PI, 5 мкМ) и в течение 15 мин выдерживали в темноте при комнатной температуре. Каплю (10 мкл) этой суспензии помешали на предметное стекло с 1%-ной агарозой. накрывали покровным стеклом и подсчитывали количество флуоресцирующих клеток при помощи микроскопа Leica DM2000. Для детекции флуоресценции SYT09 использовали систему фильтров 13 (возбуждение 450-490 нм. эмиссия > 515 нм, дихроичное зеркало 510 нм). для детекции флуоресценции PI применялась система фильтров N2.1 (возбуждение 515-560 нм. эмиссия > 590 нм, дихроичное зеркало 580 нм),
Изменения мембранного потенциала исследовали по методу [Wickens et al.r 2000]. Для этого бактериальную культуру (180 мкл) смешивали с 20 мкл раствора DiBACj(3) с концентрацией 100 мкг/мл и выдерживали в темноте при 37°С в течение 10 мин. Затем 10 мкл образца наносили на предметное стекло с 1 %-ной агарозой и исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM2000 (фильтр-система 13). Обшее количество клеток подсчитывали в проходящем свете. Для каждого образца анализировали не менее 800 клеток. Эксперименты проводили 3-6 раз в различные дни.
Активность Р-галактозидазы определяли по методу Миллера [Miller. 1972] в штаммах Е. coli NM3021. NM3001 и NM3011, несущих генные слияния ka(G::locZ, sod A::lacZ и suiA(sfiA):AacZ, соответственно.
Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли с помощью пакета программ Microsoft Excell и Statistica 6,0, вычисляя среднее значение, стандартную ошибку и доверительный интервал. Каждый результат показан как среднее значение из не менее трех независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего.
снижаться через 30 мин. после добавления антибиотика. и через 2 ч. экспозиции скорость роста падала в 16 раз до 0.04 ч."1. Более высокая доза ципрофлоксацина (3 мкг/мл) вызывала резкое ин-гибирование роста, и через 80 мин. экспозиции значение \1 было близким к ну лю.
0.8
40 60 30 100 120 Время, мин
Рис. 1. Изменение удельной скорости роста (ц) при действии ципрофлоксацина на бактерии Е. coli BW25113
Интересно, что количество КОЕ при разных дозах ципрофлоксацина изменялось противоположным образом по сравнению с удельной скоростью роста: низкая доза антибиотика оказывала в 3 раза более сильный ингибирующий эффект на способность к образованию колоний, чем высокая доза (рис. 2).
5000
с
s
а
500
50
*
-О- КОНТЭОЛЬ Ф'
-□- Û.3 мкг'м.1 ЦФ -<»- з миг/мл ЦФ
Результаты и их обсуждение
В контрольных культурах удельная скорость роста (д) была близка к максимальному значению на протяжении всего эксперимента и в среднем составляла 0.63 ± 0.02 ч."1 (рис. 1). Добавление ципрофлоксацина сопровождалось торможением роста. которое было более выражено при высокой концентрации антибиотика. В случае обработки 0.3 мкг/мл ципрофлоксацина начинала постепенно
0 20 40 60 80 100 120 Время, мин
Рис. % Способность бактерий Е. соН В\У25113. обработанных щтрофлокеащшом, к образованию колоний на агаризованной среде
Подобный эффект наблюдался и в тесте «1пе/ёеа<1», где бактерицидное действие низкой концентрации ципрофлоксацина было выше, чем
высокой (рис. 3). Следует отметить, что, несмотря на определенное соответствие результатов, полученных в тестах с определением КОЕ и «live/dead», между ними наблюдалась и существенная разница. В частности, только 0.04% клеток в попу ляции сохраняли способность к образованию колоний через 2 ч. экспозиции к 0.3 мкг/мл ципрофлоксацина, в то время как доля «живых» клеток в тесте «live/dead» составляла 83% от их общего числа. При обработке 3 мкг/мл ципрофлоксаци-на способность к образованию колоний демонстрировали 0.13% клеток, тогда как в этих же условиях в тесте «live/dead» практически все клетки имели интактные мембраны и не окрашивались пропидиум иодидом. В отличие от колониеобра-зующей способности и теста «live/dead», в тесте с DiBAC:}(3) наблюдалась прямая зависимость числа флуоресцирующих (деполяризованных) клеток от концентрации ципрофлоксацина (рис. 4). Через 2 ч. инкубации доля клеток, утративших мембранный потенциал, составляла 30% в случае обработки 0.3 мкг/мл ципрофлоксацина и 70% - при обработке 3 мкг/мл этого антибиотика.
100
03 ф
о
95
90
85
80
-О- коктэоль □ 0 3 мкг'мп ЦФ -<* Змкг/И1ЦФ
20
.....и
ео
70
60
О коктропь
0,3 мкг/мл ЦФ -О- 3 мчг/мг ЦФ
f-
50
40
30
<о
Cl
О
С
е
20
10
f*
40 60 30 100 120 Время, мин
Рис. 3. Процент жизнеспособных клеток Е соИ В\\^25113 в тесте «11\'е/с1еа<1»
Таким образом, определение жизнеспособности бактерий различными методами не дает однозначных результатов. Это может быть связано с тем, что оцениваются разные физиологические параметры клеток. Полненные данные свидетельствуют о том, что довольно длительное время в течение инкубации с антибиотиком продолжается накопление биомассы, и значительная доля клеток в популяции сохраняет интактные мембраны и поддерживает мембранный потенциал, то есть остается метаболически активной. Вместе с тем количество КОЕ начинает снижаться практически сразу после добавления ципрофлоксацина, что может объясняться накоплением повреждений ДНК, препятствующих образованию колоний.
0 20 40 60 80 100 120 Бремя, мин
Рис, 4. Доля клеток Е. coït BW25113, окрашенных DiBACi(3) (утративших мембранный потенциал), от общего числа клеток
Повреждение ДНК различными агентами, в том числе хинолонами, вызывает индукцию SOS-ответа [Piddock. Wise, 1987]. Ген $ttlA(sfiА) является частью SOS-регулона и кодирует белок SulA, который взаимодействует с подобным тубулину белком FtsZ. ответственным за процесс деления. Белок SulA ингибирует активность FtsZ, что приводит к филаментации клеток [Trusca et al., 1998]. Мы использовали генное слияние $t4?A(sJiA): lacZ для мониторинга SOS-ответа при обработке клеток Е. coii разными концентрациями ципрофлоксацина. Добавление ципрофлоксацина вызывало быструю индукцию активности [З-галактозидазы, которая была более выражена при низкой дозе антибиотика (рис. 5). За 2.5 ч. экспозиции экспрессия $u!A(sfiA)::!acZ возрастала в 12 раз при действии 0.3 мкг/мл ципрофлоксацина и в 3 раза - при обработке клеток 3 мкг/мл этого антибиотика. Полученные результаты могут свидетельствовать о более сильном повреждении ДНК в клетках, сохраняющих высокую скорость роста и поддерживающих нормальный мембранный потенциал при обработке низкой дозой ципрофлоксацина.
Поскольку' в аэробных условиях в механизм бактерицидного действия хинолонов могут быть вовлечены активные формы кислорода [Wang et al., 2010], мы проследили за изменениями экспрессии генов katG и ю&4, кодирующих каталазу НР1 и Мп-супероксидцисмутазу, соответственно. Ген katG принадлежит к регулону, который индуцируется в ответ на пероксидный стресс и контролируется транскрипционным фактором OxyR [Iinlay, 2008]. Экспрессия гена xoiiA повышается в условиях супероксидного стресса под контролем двух-компонентной регул яторной системы SoxRS [Imlay, 2008]. Добавление ципрофлоксацина инги-бировало экспрессию обоих генов, причем степень
ингибирования повышалась с увеличением концентрации антибиотика (не показано). Снижение индукции антиоксидантных генов может указывать на отсутствие классического окислительного стресса в этих условиях.
2800
sulA.JacZ
Я 2400 о. а> С
I 2000
it
.и
s
о £ то
0> ID
1600 1200 800 400
I-
-Ф-
-Ф-
-О контэоль □- 0.3 МКГМЛ ЦФ -О 3 мкггмл цф
____ф------ф
0 20 40 60 80 100 12С 140 Время, мин
Рис. 5. Изменение экспрессии гена svIA при действии ципрофлоксацина на бактерии Е, coli NM301 I
Парадоксальный эффект, при котором высокие дозы хинолонов обладают меньшей бактерицидной активностью (определяемой по КОЕ), чем низкие, известен уже давно [Lewin, Morrissey, Smith, 1991]. Было показано, что бактерицидное действие хинолонов имеет двухфазный характер: при дозах выше МИК (минимальная ингибирутощая концентрация) летальное действие антибиотика возрастает до концентрации, которую называют оптимальной бактерицидной концентрацией (ОБК); при дальнейшем повышении дозы антибиотика его бактерицидная активность падает. Такой двухфазный характер бактерицидной активности хинолонов может быть связан с ингибированием синтеза РНК при концентрациях, превышающих оптимальную бактерицидную концентрацию [Lewin. Morrissey. Smith, 1991], Предполагается, что при концентрациях, превышающих ОБК? иншбированне ДНК-гиразы рслаксируст супсрскручснную хромосомную ДНК до такой степени, что она больше не может служить матрицей при транскрипции. Синтез РНК, белка и деление клеток являются обязательными условиями максимальной бактерицидной активности хинолонов [Lewiii. Morrissey. Smith, 1991].
В наших экспериментах степень ингибирования колониеобразующей активности при действии ципрофлоксацина прямо коррелировала со значением удельной скорости роста культуры и способностью клеток поддерживать мембранный потенциал в течение периода экспозиции с антибиотиком. Удельная скорость роста является интегральным показа-
телем метаболической активности клеток. Установлено. что значение ц обратно пропорционально внутриклеточной концентрации гуанозинтетра-фосфата (ppGpp). который регулирует многие метаболические процессы и ответ клеток на различные стрессовые воздействия, в том числе путем торможения синтеза рибосомальной и транспортной РНК (ppGpp) [Potiykus et al. 2011]. Следовательно. сохранение высокой скорости роста и, соответственно, низкого уровня ppGpp в период экспозиции к ципрофлоксацину должно повышать эффективность бактерицидного действия антибиотика. Бактерии с пониженной метаболической активностью проявляют большую устойчивость к действию ципрофлоксацина.
Заключение
Сравнение различных методов оценки жизнеспособности бактерий Е. coli, обработанных ци-профлоксацином. показало, что результаты, полученные каждым из этих методов, отличаются друг от друга в зависимости от того, что принимается в качестве критерия жизнеспособности. Определение удельной скорости роста и способности поддерживать мембранный потенциал позволило установить, что после добавления ципрофлоксацина бактерии длительное время сохраняют метаболическую активность, которая снижается пропорционально концентрации антибиотика. В то же время согласно тесту «live-dead», большая часть клеток популяции имела интактные мембраны, что препятствует входу пропидиум иодида. Вместе с тем количество КОЕ начинало снижаться практически сразу после внесения ципрофлоксацина и имело обратн)то зависимость от концентрации антибиотика, что хорошо коррелирует со степенью индукции SOS-ответа. Таким образом, использование только одного из методов определения жизнеспособность бактерий при обработке антибиотиками не может дать полной характеристики состояния культуры. С нашей точки зрения, сочетание традиционных методов измерения OD¿oo. скорости роста и подсчета КОЕ с определением способности клеток поддерживать мембранный потенциал является наиболее предпочтительным, поскольку дает информацию как о метаболической активности клеток. так и об их способности к дальнейшему размножению.
Работа поддержана грантом РФФИ-Урал № 13-04-96039 и грантом по программе «Молекулярная и клеточная биология» Российской академии наук.
Библиографический список
Berney M et al. Assessment and interpretation of
bacterial viability by using the LIVE/DEAD backlight kit in combination with flow cytometry //
Appl. Environ. Microbiol. 2007. Vol. 73. P. 3283-
3290.
Drlica K. et al. Quinolone-mediated bacterial death // Antimicrob. Agents Chemother. 2008. Vol 52. P. 385-392.
Friedberg EC., Walker G.C., Siede W. DNA repair and mutagenesis. Washington: ASM Press. 1995. P. 407-464.
Imlay J.A. Cellular defenses against superoxide and hydrogen peroxide // Annu. Rev. Biochem. 2008. Vol. 77. P. 755-776.
Jepras R.I et al. Development of a robust flow cytometric assay for determining numbers of viable bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1995. Vol. 61 P. 2696-2701.
Lewin C.S, Morrissev I, Smith J.T. The mode of action of quinolones: the paradox in activity of low and high concentrations and activity in the anaerobic environment if Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1991. Vol. 10. P. 240-248.
Aliller J.H, Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1972,
Piddock L.J. V., Wise R. Induction of (lie SOS response in Escherichia coli by 4-quinolone antimicrobial agents if FEMS Microbiol. Lett. 1987. Vol. 41. P. 289-294.
Potrykus K. el al. ppGpp is the major source of growth rale control in E. coli // Environ. Microbiol. 2011. Vol. 13. P. 563-575.
Tao K. el al. Molecular cloning and nucleotide sequencing ofary.fi. the positive regulatory gene of a regulon for an adaptive response to oxidative slress in Escherichia coli: homologies between OxyR protein and a family of bacterial activator proteins // Mol. Gen. Genet, 1989. Vol. 218. P. 371-376.
Trusca D. el al. Bacterial SOS checkpoint protein SulA inhibits polymerization of purified FtsZ cell division protein // J. Bacteriol. 1998. Vol. 180. P. 3946-3953.
WangX. et al. Contribution of reactive oxygen species to pathways of quinolone-mediated bacterial cell death // J, Antimicrob. Chemother. 2010. Vol. 65. P. 520-524.
Wickens H.J. et al. Flow cytometric investigation of fi lamentation, membrane patency and membrane potential in Escherichia coli following ciprofloxacin exposure // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. Vol. 44. P. 682-687,
References
Berney M., Hammes F.. Bosshard F.. Weilenmann H. U.. Egli T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LTVE/DEAD backlight
kit in combination with flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 2007. Vol. 73. pp. 3283-3290.
Drlica K., Malik M.. Kerns R.J., Zhao X, Quinolone-mediated bacterial death. Antimicrob. Agents Chemother. 2008. Vol. 52. pp. 385-392,
Friedberg E.C.. Walker G С, Siede W. DNA repair and mutagenesis. Washington. ASM Press. D C. 1995. P. 407-464.
Imlay J.A. Cellular defenses against superoxide and hydrogen peroxide. Anna. Rev. Biochem, 2008. Vol. 77. pp. 755-776.
Jepras R.I.. Carter J.. Pearson S C.. Paul F.E., Wilkinson M.J. Development of a robust flow cytometric assay for determining numbers of viable bacteria Appl. Environ. Microbiol, 1995, Vol. 61, pp. 2696-2701.
Lew in C.S.. Morrissey I., Smith J.T. The mode of action of quinolones; the paradox in activity of low and high concentrations and activity in the anaerobic environment. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis, 1991. Vol. 10, pp. 240-248.
Miller J.H. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1972.
Piddock L.J.V,, Wise R. Induction of the SOS response in Escherichia coli by 4-quinolone antimicrobial agents. FEMS Microbiol. Lett. 1987. Vol. 41. pp. 289-294.
Potrykus K.. Murphy H., Philippe N.. Cashel M. ppGpp is the major source of growth rate control in E. coíi. Environ. Microbiol. 2011. Vol. 13. pp. 563-575.
Tao K.. Makino K.. Yonei S.. Nacala A., Shinagawa H. Molecular cloning and nucleotide sequencing of oxvR, the positive regulatory gene of a regulon for an adaptive response to oxidative slress in Escherichia coli: homologies between OxyR protein and a family of bacterial activator proteins. Mol. Gen. Genet. 1989. Vol. 218. pp. 371-376.
Trusca D.. Scott S., Thompson C, Bramhill D. Bacterial SOS checkpoint protein SulA inhibits polymerization of purified FtsZ cell division protein. J. Bacterial. 1998, Vol. 180, pp. 3946-3953.
Wang X.. Zliao X.. Malik M., Drlica K, Contribution of reactive oxygen species to pathways of qui-nolone-mediated bacterial cell death. J. Antimicrob. Chemother. 2010. Vol. 65. pp. 520-524.
Wickcns H.J., Pinncy R.J., Mason D.J., Gant V.A. Flow cytometric investigation of fi lamentation, membrane patency and membrane potential in Escherichia coli following ciprofloxacin exposure Antimicrob. Agents Chemother. 2000. Vol. 44. pp. 682-687.
Посту пила в редакцию 27.10.2015
Об авторах
Петере Михаил Александрович, аспирант лаборатории физиологии и генетики м икроорганизмов
ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН» 614081. Пермь, ул. Голева, 13; иихеи-mliz-@mail.ru; (342)2122086
Музыка Надежда Геннадьевна, кандидат биологических наук старший научный сотрудник лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов
ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
614081, Пермь, ул. Голева, 13; muzykafi5iegm.ru; (342)2122086
Октябрьский Олег Николаевич, доктор биологических наук, профессор, зав, лабораторией физиологии и генетики микроорганизмов ФГЪУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
614081. Пермь, ул. Голева. 13; ок1уаЬг(й:iegm.ru; (342)2122086
профессор кафедры химии и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет», 614990, Пермь, Комсомольский пр., 29
Смирнова Галина Васильевна, доктор биологических наук ведущий научный сотрудник лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов
ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН» 614081. Пермь, ул. Голева, 13; sinimovaiftiegni.ru; (342)2122086
About the authors
Peters Michail Aleksandrovich, graduate student of laboratory of physiology and genetics of microorganisms
Institute of ecology1 and genetics of microorganisms, UB RAS. 13« Golev str., Perm, Russia, 614081, mixeu-mhzfaimail.ru; (342)2122086
Muzyka Nadezhda Geniiad'evna, candidate of biology, senior researcher of laboratory of physiology and genetics of microorganisms Institute of ecology and genetics of microorganisms. UB RAS. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081; muzyka@iegm.ru; (342)2122086
Oktyabrsky Oleg Nikolaevich. doctor of biology, professor, director of laboratory of physiology and genetics of microorganisms Institute of ecology and genetics of microorganisms, UB RAS. 13. Golev str.. Perm, Russia, 614081; oktyabr^iegm.ru; (342)2122086 professor of the Department of Chemistry and Biotechnology'
Perm National Research Polytechnic University, Komsomolsky pr, 29, Perm, Russia, 614990
Smimova Galina Vasil'cvna, doctor of biology, leading researcher of laboratory of physiology and genetics of microorganisms Institute of Ecology and Genetics of Microorganism UB RAS. 13, Golev str., Perm, Russia, 614081: smirnova@iegm.ru, (342)2122086
